一种荧光探针及其合成及应用转让专利
申请号 : CN202010952627.2
文献号 : CN112028915B
文献日 : 2021-05-04
发明人 : 张长丽 , 仲文 , 丁湘蓉 , 黄芳 , 何凤云
申请人 : 南京晓庄学院
摘要 :
本发明公开了一种荧光探针及其合成及应用，属于检测领域。该方法包括如下步骤：第一步：在氯化亚砜的作用下，化合物Ⅰ与化合物Ⅱ进行反应，得到化合物Ⅲ；第二步：在氢化钠或二异丙基氨基锂的作用下，化合物Ⅲ与化合物Ⅳ进行反应，得到化合物Ⅴ；第三步：在有机碱的作用下，化合物Ⅴ与三氟化硼乙醚溶液进行反应，得到化合物Ⅵ。该荧光探针的制备方法简单，且探针对Aβ42蛋白多聚体具有良好的识别作用，并且能透过血脑屏障识别活体小鼠内的Aβ42蛋白。
权利要求 :
1.一种荧光探针的制备方法，其特征在于：该方法如下：第一步：在氯化亚砜的作用下，化合物Ⅰ与化合物Ⅱ进行反应，得到化合物Ⅲ；
第二步：在氢化钠的作用下，化合物Ⅲ与化合物Ⅳ进行反应，得到化合物Ⅴ；
第三步：在有机碱的作用下，化合物Ⅴ与三氟化硼乙醚溶液进行反应，得到化合物Ⅵ；
第二步中：化合物IV先与氢化钠进行反应，反应结束后在反应体系中加入化合物III进一步进行反应；化合物III：氢化钠：化合物IV的摩尔比为1～1.5：1.8～2.2：1；反应所用的溶剂为四氢呋喃或乙醚，反应温度为0～30℃，反应时间为2.5～5.5h。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：第一步中，化合物Ⅰ：化合物Ⅱ：氯化亚砜的摩尔比为3～5：1：1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：第一步中，反应所用溶剂为二氯甲烷，反应温度为室温，反应时间为1～3.5h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：第三步中，化合物Ⅴ与三氟化硼的摩尔比为1：3～8，化合物V与有机碱的摩尔比为1：2～4，反应所用的溶剂为甲苯或二氯甲烷，反应温度为30～110℃，反应时间为0.5～3h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：第三步中，所述的有机碱为三乙胺或
1,8‑二氮杂二环十一碳‑7‑烯。
说明书 :
一种荧光探针及其合成及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及检测领域，具体涉及一种用于检测Aβ斑块的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 阿尔茨海默病(AD)是一种破坏性的神经退行性疾病，是导致痴呆症的最常见原因，给个人、家庭和社会造成巨大的经济负担。更令人痛心的是，目前还没有对AD进行有效
的诊断。随着对AD发病机制的认识不断加深，作为生物标志物的病理因素的检测在更准确
地诊断AD方面显示出了巨大的潜力。由淀粉样β肽(Aβ)纤维组成的淀粉样斑块是AD的主要
病理学标志，是目前诊断AD的主要生物标志物。它们的检测将为AD的早期诊断、进展预测以
及新型抗Aβ药物的有效监测提供有力的手段。
的诊断。随着对AD发病机制的认识不断加深，作为生物标志物的病理因素的检测在更准确
地诊断AD方面显示出了巨大的潜力。由淀粉样β肽(Aβ)纤维组成的淀粉样斑块是AD的主要
病理学标志，是目前诊断AD的主要生物标志物。它们的检测将为AD的早期诊断、进展预测以
及新型抗Aβ药物的有效监测提供有力的手段。
发明内容
[0003] 本发明是针对上述存在的技术问题提供一种用于检测Aβ斑块的荧光探针及其制备方法和应用。
[0004] 本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
[0005] 一种荧光探针，该荧光探针如式I所示的化合物：
[0006]
[0007] 一种上述荧光探针的制备方法，该方法如下：
[0008]
[0009] 在一些具体的技术方案中：该方法包含以下步骤：
[0010] 第一步：在氯化亚砜的作用下，化合物Ⅰ与化合物Ⅱ进行反应，得到化合物Ⅲ；
[0011] 第二步：在氢化钠或二异丙基氨基锂(LDA)的作用下，化合物Ⅲ与化合物Ⅳ进行反应，得到化合物Ⅴ；
[0012] 第三步：在有机碱的作用下，化合物Ⅴ与三氟化硼乙醚溶液进行反应，得到化合物Ⅵ。
[0013] 本发明技术方案中：第一步中，化合物Ⅰ：化合物Ⅱ：氯化亚砜的摩尔比为3～5：1： 1。
[0014] 本发明技术方案中：第一步中，反应所用溶剂为二氯甲烷，反应温度为室温，反应时间为1～3.5h。
[0015] 本发明技术方案中：第二步中，化合物IV先与氢化钠或LDA进行反应，反应结束后在反应体系中加入化合物III进一步进行反应。
[0016] 本发明技术方案中：第二步中，化合物III：氢化钠或LDA：化合物IV的摩尔比为 1～1.5：1.8～2.2：1。
[0017] 本发明技术方案中：第二步中，反应所用的溶剂为四氢呋喃或乙醚，反应温度为0～30 摄氏度，反应时间为2.5～5.5h。
[0018] 本发明技术方案中：第三步中，化合物Ⅴ与三氟化硼的摩尔比为1：3～8，化合物V 与有机碱的摩尔比为1：2～4，反应所用的溶剂为甲苯或二氯甲烷，反应温度为30～110摄氏
度，反应时间为0.5～3h。优选：所述的有机碱为三乙胺或1,8‑二氮杂二环十一碳‑7‑烯
(DBU)。
度，反应时间为0.5～3h。优选：所述的有机碱为三乙胺或1,8‑二氮杂二环十一碳‑7‑烯
(DBU)。
[0019] 本发明技术方案中：本发明技术方案所述的荧光探针在作为阿尔茨海默病诊断试剂方面的应用。
[0020] 在一些优选的技术方案中：本发明技术方案所述的荧光探针在检测Aβ42蛋白多聚体方面的应用。
[0021] 本发明的有益效果：
[0022] 本发明提供了一种一种荧光探针及其合成及应用，该荧光探针的制备方法简单，且探针对Aβ42蛋白多聚体具有良好的识别作用，并且能透过血脑屏障识别活体小鼠内的Aβ
42蛋白。
42蛋白。
附图说明
[0023] 图1为本发明实施例1制备得到的探针的1H NMR谱图。
[0024] 图2为实施例1制备得到的探针及探针与各种蛋白反应后的荧光光谱图。
[0025] 图3为实施例1制备得到的探针及探针与各种蛋白反应后在560nm处荧光强度的柱状图。
[0026] 图4.注射实施例1制备得到的探针的小鼠脑组织匀浆高效液相色谱图。
[0027] 图5为不同浓度的实施例1制备得到的探针溶液作用于MCF7细胞，细胞的存活率。
[0028] 图6为实施例1制备得到的探针对小鼠脑组织切片染色的荧光共聚焦图。
具体实施方式
[0029] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此：
[0030] 实施例1探针的合成
[0031] 第一步：干燥的100mL两口烧瓶，真空置换三次，在N2保护下，加入5.0g(41.8mmol) 化合物I，用53mL二氯甲烷溶解，滴加0.76mL(10.5mmol)氯化亚砜，室温搅拌30min，加入
2.0g(10.5mmol)化合物II，继续搅拌3h.加入水猝灭反应，二氯甲烷萃取，饱和 NaCO3水溶
液和饱和食盐水洗涤，无水MgSO4干燥，抽滤，旋转蒸干溶剂，所得固体用适量乙醇重结晶，
得淡黄色固体2.27g。产率73.96％，纯度95.2％.
2.0g(10.5mmol)化合物II，继续搅拌3h.加入水猝灭反应，二氯甲烷萃取，饱和 NaCO3水溶
液和饱和食盐水洗涤，无水MgSO4干燥，抽滤，旋转蒸干溶剂，所得固体用适量乙醇重结晶，
得淡黄色固体2.27g。产率73.96％，纯度95.2％.
[0032]
[0033] 第二步：干燥的100mL两口烧瓶中，加入氢化钠(58mg,2.4mmol)，用5mL四氢呋喃溶解，20℃的条件下滴加化合物IV(120uL，1.2mmol，10mL四氢呋喃溶解)，反应30min，滴加化
合物III(380mg，1.3mmol，10mL四氢呋喃溶解)，20min后滴加完，继续搅拌反应5h，乙酸乙酯
萃取，无水硫酸镁干燥，抽滤，旋转蒸干溶剂。混合物用柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝5：
1，v/v)，得浅黄色固体化合物V 182mg，产率57％，纯度95.6％。
合物III(380mg，1.3mmol，10mL四氢呋喃溶解)，20min后滴加完，继续搅拌反应5h，乙酸乙酯
萃取，无水硫酸镁干燥，抽滤，旋转蒸干溶剂。混合物用柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝5：
1，v/v)，得浅黄色固体化合物V 182mg，产率57％，纯度95.6％。
[0034]
[0035] 第三步：干燥的100mL两口烧瓶，真空置换三次，在N2保护下，加入1.33mmol 化合物V，用20mL甲苯溶解，加入3.99mmol DBU的甲苯溶液(DBU含量为20％)，搅拌30min后，升温
至110℃，搅拌10min，滴加6.65mmol三氟化硼甲苯溶液(三氟化硼含量为7.5％)，反应回流
30min。产物用二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，旋转蒸干溶剂。混合
物用柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝2：1，v/v)，得橙黄色固体347mg，产率83％，纯度
99.1％.
至110℃，搅拌10min，滴加6.65mmol三氟化硼甲苯溶液(三氟化硼含量为7.5％)，反应回流
30min。产物用二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，旋转蒸干溶剂。混合
物用柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝2：1，v/v)，得橙黄色固体347mg，产率83％，纯度
99.1％.
[0036] 如图1，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ/ppm＝8.35(d,J＝5.6Hz,1H),7.79(t,J＝6.8Hz, 1H),7.57(d,J＝13.6Hz,1H),7.43(d,J＝8.8Hz,2H),7.16(d,J＝7.2Hz,2H),6.68(d,J＝
8.8Hz,2H),6.46(d,J＝15.6Hz,1H),5.76(s,1H),3.01(s,6H).
8.8Hz,2H),6.46(d,J＝15.6Hz,1H),5.76(s,1H),3.01(s,6H).
[0037]
[0038] 探针的性质
[0039] 光谱性质及选择性
[0040] Aβ42蛋白现配溶液、37℃孵育48小时分别认为是蛋白的单体、多聚体，多聚体形成淀粉样斑块。实验中，20μmol/L Aβ42蛋白溶液(20mM Tris‑HCl/150mM NaCl,pH 7.4) 现
配、37℃孵育48小时，分别加入等当量的探针(实施例1)溶液，混匀，室温放置5 分钟，测试
其荧光强度。20μmol/L(20mM Tris‑HCl/150mM NaCl,pH 7.4)tau蛋白、牛血清白蛋白
(bovine serum albumin,BSA)分别加入等当量的探针(实施例1)溶液，混匀，室温放置5分
钟，测试其荧光强度。
配、37℃孵育48小时，分别加入等当量的探针(实施例1)溶液，混匀，室温放置5 分钟，测试
其荧光强度。20μmol/L(20mM Tris‑HCl/150mM NaCl,pH 7.4)tau蛋白、牛血清白蛋白
(bovine serum albumin,BSA)分别加入等当量的探针(实施例1)溶液，混匀，室温放置5分
钟，测试其荧光强度。
[0041] 如图2～3，实验结果表明，探针的最大激发波长为432nm，最大发射波长为560nm. 探针与现配的Aβ42蛋白溶液作用，荧光增强1.2倍；与37℃孵育48小时的Aβ42蛋白溶液作
用，荧光增强1.9倍。tau蛋白与BSA对探针的荧光有一定淬灭作用。以上结果表明，探针对Aβ
42蛋白多聚体具有良好的识别作用。
用，荧光增强1.9倍。tau蛋白与BSA对探针的荧光有一定淬灭作用。以上结果表明，探针对Aβ
42蛋白多聚体具有良好的识别作用。
[0042] 透过血脑屏障
[0043] Aβ42蛋白分布在大脑中，如果进行在体Aβ42蛋白检测，探针需要透过血脑屏障。取6‑8周B6小鼠15只，3只分别尾静脉注射150μL对照溶液(10％二甲亚砜+90％生理盐水)、12
只分别尾静脉注射150μL探针溶液(2mmol/L，10％二甲亚砜+90％生理盐水)。在小鼠在注射
探针溶液2min、10min、30min、60min后断颈处死取脑组织(每个时间点3只小鼠)，分别加入
1ml NP‑40裂解液，剪碎组织并进行粉碎匀浆，加入1ml甲醇，混匀30min，12000rpm离心
10min，取上层清液进行高效液相色谱实验(HPLC)。注射对照溶液的小鼠在60min后断颈处
死，取脑组织进行上述相同处理。
只分别尾静脉注射150μL探针溶液(2mmol/L，10％二甲亚砜+90％生理盐水)。在小鼠在注射
探针溶液2min、10min、30min、60min后断颈处死取脑组织(每个时间点3只小鼠)，分别加入
1ml NP‑40裂解液，剪碎组织并进行粉碎匀浆，加入1ml甲醇，混匀30min，12000rpm离心
10min，取上层清液进行高效液相色谱实验(HPLC)。注射对照溶液的小鼠在60min后断颈处
死，取脑组织进行上述相同处理。
[0044] HPLC实验条件，C18色谱柱(150nm×4.6mm)，流动相：乙腈：水＝80:20；进样量： 10μL；流速：1mL/min；温度：不控制；紫外波长：430nm.
[0045] 如图4，HPLC实验结果表明，探针的保留时间是3.2min，分别注射探针后2min、 10min、30min、60min，小鼠脑组织匀浆中均检测到探针，随着时间的增长，探针的含量越来
越多。表明探针能够透过小鼠的血脑屏障。
越多。表明探针能够透过小鼠的血脑屏障。
[0046] 备注：图4中a.注射探针2min后，小鼠脑组织匀浆，甲醇萃取液；b.注射探针10min后，小鼠脑组织匀浆，甲醇萃取液；c.注射探针30min后，小鼠脑组织匀浆，甲醇萃取液；d.注
射探针60min后，小鼠脑组织匀浆，甲醇萃取液；e.10μmol/L探针与脑组织匀浆混合，甲醇萃
取液。
射探针60min后，小鼠脑组织匀浆，甲醇萃取液；e.10μmol/L探针与脑组织匀浆混合，甲醇萃
取液。
[0047] 探针的安全性
[0048] 探针用于检测小鼠脑组织中Aβ蛋白，需要是无毒性。实验中，人乳腺癌细胞MCF7 细胞培育24小时，去掉培养基，重新加入分别含有探针浓度为1,5,10,20,40,60,80,100 μ
mol/L的完全培养基，37℃，5％CO2培养箱中继续培养。48小时后，每孔加入10μL 3‑ (4，5‑
二甲基噻唑‑2)‑2，5‑二苯基四氮唑溴盐(5mg/mL),置于37℃含5％CO2的培养箱继续孵育
4h。吸去上清液,每孔加入150μL二甲亚砜，室温避光放置30min，在酶标仪上震荡60s，波长
490nm测量每孔的吸收值。吸光度值以获得的数据减去空白对照得出，存活率以实验组与阴
性对照组的百分比表示。
mol/L的完全培养基，37℃，5％CO2培养箱中继续培养。48小时后，每孔加入10μL 3‑ (4，5‑
二甲基噻唑‑2)‑2，5‑二苯基四氮唑溴盐(5mg/mL),置于37℃含5％CO2的培养箱继续孵育
4h。吸去上清液,每孔加入150μL二甲亚砜，室温避光放置30min，在酶标仪上震荡60s，波长
490nm测量每孔的吸收值。吸光度值以获得的数据减去空白对照得出，存活率以实验组与阴
性对照组的百分比表示。
[0049] 如图5，实验结果表明，即使探针的浓度达到100μmol/L，细胞的存活率仍能到达90％以上，表明该探针没有明显的毒性。
[0050] 探针对AD转基因小鼠的脑组织切片染色
[0051] 进一步研究探针对含有Aβ淀粉样斑块的小鼠脑组织Aβ淀粉样斑块识别情况。
[0052] 实验中，取18个月大小的阿尔兹海默症老年痴呆AD小鼠双转基因APP/PS1小鼠，断颈处死，获得脑组织冰冻切片，用20μmol/L探针溶液染色30min，弃掉探针溶液，用 0.9％
NaCl溶液洗涤3次，用50％甘油生理盐水溶液封片，荧光显微镜拍照。显微镜成像条件，
Zeiss LSM710荧光共聚焦显微镜，物镜10×，激发波长488nm，发射波长510～610nm. 实验
结果如图6a‑c。
NaCl溶液洗涤3次，用50％甘油生理盐水溶液封片，荧光显微镜拍照。显微镜成像条件，
Zeiss LSM710荧光共聚焦显微镜，物镜10×，激发波长488nm，发射波长510～610nm. 实验
结果如图6a‑c。
[0053] 从图6中可以看出，探针能够检测到转基因小鼠脑组织中的Aβ淀粉样斑块，和商业化探针ThT(硫黄素T)染色比较(图6d‑f)，该探针的在没有结合Aβ淀粉样斑块前，荧光强度
更弱。
更弱。
[0054] 另外，对18个月大小的阿尔兹海默症老年痴呆AD小鼠双转基因APP/PS1小鼠尾静脉注射2mmol/L探针150uL，60min后处死小鼠，取脑组织进行冰冻切片，用50％甘油生理盐
水溶液封片，荧光显微镜拍照。实验结果如图6g‑i。
水溶液封片，荧光显微镜拍照。实验结果如图6g‑i。
[0055] 从图中可以看出明显的绿色荧光斑块，进一步表明探针可以透过血脑屏障，检测到脑组织中的淀粉样斑块。
[0056] 备注：图6中图a‑c，20μmol/L探针对18个月大小的阿尔兹海默症老年痴呆AD小鼠双转基因 APP/PS1小鼠脑组织冰冻切片染色图；a为荧光图，b为明场图，c是a和b的叠加图。
图d‑f，20μmol/L 探针ThT对18个月大小的阿尔兹海默症老年痴呆AD小鼠双转基因APP/PS1
小鼠脑组织冰冻切片染色图；d为荧光图，e为明场图，f是d和e的叠加图。图g‑i，对18个月大
小的阿尔兹海默症老年痴呆 AD小鼠双转基因APP/PS1小鼠尾静脉注射探针60min后，脑组
织冰冻切片图；g为荧光图，h为明场图，i是g和h的叠加图。
图d‑f，20μmol/L 探针ThT对18个月大小的阿尔兹海默症老年痴呆AD小鼠双转基因APP/PS1
小鼠脑组织冰冻切片染色图；d为荧光图，e为明场图，f是d和e的叠加图。图g‑i，对18个月大
小的阿尔兹海默症老年痴呆 AD小鼠双转基因APP/PS1小鼠尾静脉注射探针60min后，脑组
织冰冻切片图；g为荧光图，h为明场图，i是g和h的叠加图。
[0057] 实施例2探针的合成
[0058] 第一步：干燥的100mL两口烧瓶，真空置换三次，在N2保护下，加入5.0g(41.8mmol) 化合物I，用53mL二氯甲烷溶解，滴加0.76mL(10.5mmol)氯化亚砜，室温搅拌30min，加入
2.0g(10.5mmol)化合物II，继续搅拌3h.加入水猝灭反应，二氯甲烷萃取，饱和 NaCO3水溶
液和饱和食盐水洗涤，无水MgSO4干燥，抽滤，旋转蒸干溶剂，所得固体用适量乙醇重结晶，
得淡黄色固体2.27g。产率73.96％，纯度95.2％.
2.0g(10.5mmol)化合物II，继续搅拌3h.加入水猝灭反应，二氯甲烷萃取，饱和 NaCO3水溶
液和饱和食盐水洗涤，无水MgSO4干燥，抽滤，旋转蒸干溶剂，所得固体用适量乙醇重结晶，
得淡黄色固体2.27g。产率73.96％，纯度95.2％.
[0059] 第二步：干燥的100mL两口烧瓶中，加入氢化钠(3.0mmol)，用6.3mL四氢呋喃溶解，30℃的条件下滴加化合物IV(150uL，1.5mmol，13mL四氢呋喃溶解)，反应30 min，滴加化合
物III(1.6mmol，13mL四氢呋喃溶解)，30min后滴加完，继续搅拌反应5h，乙酸乙酯萃取，无
水硫酸镁干燥，抽滤，旋转蒸干溶剂。混合物用柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝5：1，v/v)，
得浅黄色固体化合物V 220mg，产率55％，纯度93.6％。
物III(1.6mmol，13mL四氢呋喃溶解)，30min后滴加完，继续搅拌反应5h，乙酸乙酯萃取，无
水硫酸镁干燥，抽滤，旋转蒸干溶剂。混合物用柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝5：1，v/v)，
得浅黄色固体化合物V 220mg，产率55％，纯度93.6％。
[0060] 第三步：干燥的100mL两口烧瓶，真空置换三次，在N2保护下，加入354mg(1.33 mmol)化合物V，用20mL二氯甲烷溶解，加入3.99mmol DBU的二氯甲烷溶液(DBU 含量为
20％)，搅拌30min后，滴加6.65mmol三氟化硼乙醚溶液(三氟化硼含量为7.5％)，用5mL二氯
甲烷溶解)(三氟化硼含量47％)，室温反应240min。产物用二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤，
无水硫酸镁干燥，抽滤，旋转蒸干溶剂。混合物用柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝2：1，v/
v)，得橙黄色固体341mg，产率82％，纯度98.5％.’
20％)，搅拌30min后，滴加6.65mmol三氟化硼乙醚溶液(三氟化硼含量为7.5％)，用5mL二氯
甲烷溶解)(三氟化硼含量47％)，室温反应240min。产物用二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤，
无水硫酸镁干燥，抽滤，旋转蒸干溶剂。混合物用柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝2：1，v/
v)，得橙黄色固体341mg，产率82％，纯度98.5％.’
[0061] 实施例3探针的合成
[0062] 第一步：干燥的100mL两口烧瓶，真空置换三次，在N2保护下，加入5.0g(41.8mmol) 化合物I，用53mL二氯甲烷溶解，滴加0.76mL(10.5mmol)氯化亚砜，室温搅拌30min，加入
2.0g(10.5mmol)化合物II，继续搅拌3h.加入水猝灭反应，二氯甲烷萃取，饱和 NaCO3水溶
液和饱和食盐水洗涤，无水MgSO4干燥，抽滤，旋转蒸干溶剂，所得固体用适量乙醇重结晶，
得淡黄色固体2.27g。产率73.96％，纯度95.2％.
2.0g(10.5mmol)化合物II，继续搅拌3h.加入水猝灭反应，二氯甲烷萃取，饱和 NaCO3水溶
液和饱和食盐水洗涤，无水MgSO4干燥，抽滤，旋转蒸干溶剂，所得固体用适量乙醇重结晶，
得淡黄色固体2.27g。产率73.96％，纯度95.2％.
[0063] 第二步：干燥的100mL两口烧瓶中，加入氢化钠(2.64mmol)，用5.5mL四氢呋喃溶解，0℃下滴加化合物IV(132uL，1.32mmol，10mL四氢呋喃溶解)，反应30min，该温度下滴加
化合物III(1.43mmol，11mL四氢呋喃溶解)，20min后滴加完，室温搅拌反应5h，乙酸乙酯萃
取，无水硫酸镁干燥，抽滤，旋转蒸干溶剂。混合物用柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝5：1，
v/v)，得浅黄色固体化合物V 198mg，产率56.3％，纯度95％。
化合物III(1.43mmol，11mL四氢呋喃溶解)，20min后滴加完，室温搅拌反应5h，乙酸乙酯萃
取，无水硫酸镁干燥，抽滤，旋转蒸干溶剂。混合物用柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝5：1，
v/v)，得浅黄色固体化合物V 198mg，产率56.3％，纯度95％。
[0064] 第三步：干燥的100mL两口烧瓶，真空置换三次，在N2保护下，加入1.33mmol 化合物V，用20mL甲苯溶解，加入3.99mmol DBU的甲苯溶液(DBU含量为20％)，搅拌30min后，升温
至110℃，搅拌10min，滴加6.65mmol三氟化硼甲苯溶液(三氟化硼含量为7.5％)，反应回流
30min。产物用二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，旋转蒸干溶剂。混合
物用柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝2：1，v/v)，得橙黄色固体345mg，产率82.8％，纯度
99.1％。
至110℃，搅拌10min，滴加6.65mmol三氟化硼甲苯溶液(三氟化硼含量为7.5％)，反应回流
30min。产物用二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，旋转蒸干溶剂。混合
物用柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝2：1，v/v)，得橙黄色固体345mg，产率82.8％，纯度
99.1％。