一种具有良好固氮能力的褐球固氮菌突变体及其应用

摘要

一种具有良好固氮能力的褐球固氮菌突变体及其应用，其为固褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)A2820，保藏编号为CGMCC No.20443，保藏编号为CGMCC No.20443，保藏日期为2020年7月24日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其固氮酶活性210‑280nmol·mg‑1·h‑1；本发明的褐球固氮菌突变体为经ARTP诱变28秒、用乙炔还原法测定并筛选出的高酶活突变株，具有良好的固氮能力，经多次传代培养确定其遗传稳定性。

权利要求

1.一种具有良好固氮能力的褐球固氮菌突变体，其为固褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)A2820，保藏编号为CGMCC No.20443，保藏日期为2020年7月24日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.如权利要求1所述褐球固氮菌突变体在植物培养中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物为小麦或蔬菜。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述蔬菜为玉米。

说明书

一种具有良好固氮能力的褐球固氮菌突变体及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物领域，具体涉及一种具有良好固氮能力的褐球固氮菌突变体及其应用。

背景技术

[0002] 中国作为世界上最大的氮肥生产和消费国，农业系统中的氮肥盈余成为环境污染因子，目前我国的氮肥使用量远远超过作物最高产量需求量，这些过多消耗的氮肥成为环境污染的主要因素。

[0003] 生物固氮是工业氮肥最有效的替代品之一，可通过控制氮肥的使用，从传统的工业氮肥转为生物固氮，提高氮肥利用率，建设环境友好型农业，同时能够减少温室气体、酸雨及地表水和地下水的硝酸盐污染。

[0004] 细菌的固氮酶能够利用来自ATP水解的电子、质子和能量，将空气中的分子氮(N2)还原成氨(NH3)，固氮菌通过固氮酶的活性进行生物固氮可以提高全球生产力。

[0005] 褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)是一种自生固氮菌，其不需要与一定的植物相配合，具有适应性广的特点，在天然生态系统的氮素循环中具有重要作用，是重要的农业菌剂，已有研究证实，褐球固氮菌对春小麦、枸杞、棉花等作物的生长有显著的促进作用，还可提高氮肥的利用率以及减少氮肥用量，接种褐球固氮菌可以减少50％棉花生长所需氮肥的施用量，褐球固氮菌在农业的中具有广泛的应用前景。

[0006] 常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)诱变育种技术目前在生物育种领域应用广泛，通过育种仪产生均匀的等离子体射流对待处理的细胞群体进行诱变，经ARTP诱变的菌株会随着等离子体射流处理时间的增加而导致碱基与核糖之间、碱基上的氨基以及磷酸二酯中的P‑O键发生断裂，将寡核苷酸链断裂成小片段，最终形成多个突变位点而改变菌株的基因序列。

[0007] 目前，ARTP已经成功应用于包括细菌、真菌和微藻在内的40多种微生物的诱变育种，相比于传统诱变方法，射流中具有化学活性的粒子能够引发种类非常丰富的DNA损伤，最终得到大容量突变库，大容量突变库容易快速获得性能优良及遗传稳定的诱变菌株，且ARTP诱变育种技术操作简便、安全无毒，目前，对固氮菌株的诱变还鲜有报道。

发明内容

[0008] 本发明的目的在于提供一种具有良好固氮能力的褐球固氮菌突变体及其应用，通过ARTP诱变褐球固氮菌，用乙炔还原法测定并筛选出一株高酶活突变株A2820，具有良好的固氮能力，经多次传代培养确定其遗传稳定性，固氮酶活性测定结果表明，与诱变前菌株相比，提升了101.72％。

[0009] 为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0010] 一种具有良好固氮能力的褐球固氮菌突变体，其为A2820，分类命名为固褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)，于2020年7月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.20443。

[0011] 本发明所述褐球固氮菌突变体，固氮酶活性210‑280nmol·mg‑1·h‑1，菌落较小，单菌落直径1‑2mm，表面呈淡黄色，表面及边缘光滑，显微镜下常呈“8”字或成对排列。

[0012] 进一步，所述褐球固氮菌突变体适于生长的无氮固体培养基为：蔗糖3.0‑6.0g，KH2PO4 1.0‑3.0g，K2HPO4 1.0～3.0g，MgSO4·7H2O 0.3‑0.5g，FeCl3 0.002‑0.01g，CaCO3 0.05‑0.2g，蒸馏水定容至1.0L，pH 7.0～7.5，15.0～20.0g琼脂。

[0013] 本发明所述具有良好固氮能力的褐球固氮菌突变体的选育方法，包括如下步骤：

[0014] 1)制备菌体悬浮液

[0015] 将褐球固氮菌CICC21686种子液接种至固氮菌种子培养基中，于28℃、200r·min‑1‑1培养48h，取菌液至无菌EP管中，于4000r·min 、4℃离心10min，弃去上清液，菌体用无菌生理盐水悬浮，稀释至OD600为0.6～0.8，获得菌体悬浮液；

[0016] 固氮菌种子培养基为：酵母提取物0.5g，甘露醇20.0g，KH2PO4 0.2g，K2HPO4 0.8g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaSO4·2H2O 0.1g，FeCl3 0.02g，Na2MoO4·2H2O 0.03g，琼脂15.0g，蒸馏水定容至1.0L，pH7.2；

[0017] 2)ARTP诱变

[0018] 将上述菌体悬浮液与10％甘油按1：1的比例混合，均匀涂布于与ARTP诱变仪配套使用的无菌不锈钢载片上，ARTP功率120W，通氦气载气流速10L·min‑1，冷却水循环机温度为20℃，处理时间从0秒开始，每4秒做一个递增，至52秒，共14个处理,每个样品处理结束后，不锈钢载片会自动掉落至装有无菌生理盐水的无菌EP管内，待样品全部处理完毕后取下EP管，在振荡器上将菌体振荡洗脱；

[0019] 统计不同处理时间下无氮培养基平板上的菌落数，按以下公式计算致死率：

[0020]

[0021] 式中，A指经ARTP处理后平板上生长出的菌落数，B指样品诱变处理0s的总菌落数；

[0022] 3)变异菌株筛选

[0023] 平板初筛：取经过上述ARTP诱变后振荡洗脱的菌液200μL，均匀涂布在无氮固体培养基上，每个时间梯度涂布3个无氮培养基平板作为三组平行，28℃培养48h；从各试验组中的无氮培养基平板上共挑选出36个生长状态良好、菌落较大的单菌落，对照组的菌株编号为1号，各试验组的菌株按照挑选顺序分别编号为2～37号，接种至无氮培养基液体试管，于‑128℃、200r·min 培养48h，测定36个初筛菌株的固氮酶活性，筛选出发生正突变且固氮酶活性大幅提升的菌株；

[0024] 复筛：将筛选出的正向突变菌株转接至无氮液体培养基28℃、200r·min‑1培养48h后转接至固氮斜面培养基，28℃培养48h，测定复筛菌株的固氮酶活性，验证菌株的酶活稳定性；

[0025] 其中，固氮酶活性的测定方法为：采用乙炔还原法测定固氮酶活性，固氮菌株在斜面培养基培养48h后更换橡胶塞，向体系注入乙炔气体，使其体积终浓度为10％，28℃继续培养4h，取反应气体用气相色谱仪测定，根据乙烯标准工作曲线计算乙烯生成量；

[0026] 菌株固氮酶活性用每毫克菌体每小时将乙炔还原为乙烯的量表示，按照以下公式计算：

[0027]

[0028] 式中，P为气压(毫米汞柱)，t为反应温度(℃)，菌体蛋白量的测定采用考马斯亮蓝法，根据牛血清白蛋白标准曲线计算菌体蛋白含量；

[0029] 其中，牛血清白蛋白标准曲线的绘制：取7只试管，分别加入浓度为0.5mg·mL‑1的牛血清白蛋白溶液0mL，0.1mL，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL，再依次分别加入1.0mL，0.9mL，0.8mL，0.6mL，0.4mL，0.2mL，0mL蒸馏水，每支试管加入5mL考马斯亮蓝G‑250溶液；振荡摇匀各试管内液体，静置5min，测定595nm处吸光值A595，以标准蛋白浓度为横坐标，A595为纵坐标，绘制标准曲线。

[0030] 4)诱变菌株的遗传稳定性分析

[0031] 为了验证突变株的遗传稳定性，以无氮固体培养基传无氮固体培养基为一代，将复筛后获得的最优突变株A2820传代培养5代，每代均接种装有3mL无氮培养基液体试管，28‑1℃、200r·min 培养72h，测定每一代菌株的固氮酶活性。

[0032] 5)生物学特性检测

[0033] 将野生菌和最优突变株A2820的种子液接种到装有100mL固氮菌液体培养基的250mL三角瓶中，培养基设置不同的温度梯度，分别为26℃、28℃、30℃、32℃、34℃，200r·min‑1培养48h后测定OD600，每个温度梯度3次重复；设置不同初始pH，分别为6.0、6.5、7.0、
7.5、8.0、8.5，28℃、200r·min‑1培养48h后测定OD600，每个pH梯度3次重复。

[0034] 两株菌的最佳培养温度均为28℃；培养基初始pH在7.5左右时，最优突变株A2820的生长能力最好；接种量的变化对突变株生长量影响不大，最佳接种量和野生株一致，为3％。

[0035] 本发明提供所述固褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)A2820在玉米、小麦或蔬菜中的应用。

[0036] 本发明具有以下有益效果：

[0037] 通过ARTP诱变筛选获得高固氮酶活性且遗传稳定的诱变株，并证实了ARTP诱变对于其固氮效能具有显著提升，为提高褐球固氮菌固氮酶活性提供了有效方法，经过该菌株处理的玉米植株干重及含氮量分别增加了21.16％和34.36％。

附图说明

[0038] 图1为本发明实施例1中不同诱变时间的菌株致死率曲线。

[0039] 图2为本发明实施例1中的标准蛋白曲线。

[0040] 图3为本发明实施例1中诱变菌株的固氮酶活性及增长率曲线。

[0041] 图4为本发明实施例1中初筛诱变菌株的固氮酶活性及增长率曲线。

[0042] 图5为本发明实施例1中连续培养5代的突变株固氮酶活性。

具体实施方式

[0043] 以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

[0044] 实施例1

[0045] 本发明所述具有良好固氮能力的褐球固氮菌突变体的选育方法，包括如下步骤：

[0046] 1)制备菌体悬浮液

[0047] 将褐球固氮菌CICC21686种子液接种至固氮菌种子培养基中，于28℃、200r·min‑1‑1培养48h，取菌液至无菌EP管中，于4000r·min 、4℃离心10min，弃去上清液，菌体用无菌生理盐水悬浮，稀释至OD600为0.6～0.8，获得菌体悬浮液；

[0048] 固氮菌种子培养基：酵母提取物0.5g，甘露醇20.0g，KH2PO4 0.2g，K2HPO4 0.8g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaSO4·2H2O 0.1g，FeCl3 0.02g，Na2MoO4·2H2O 0.03g，琼脂15.0g，蒸馏水定容至1.0L，pH7.2；

[0049] 2)ARTP诱变

[0050] 将上述菌体悬浮液与10％甘油按1：1的比例混合，均匀涂布于与ARTP诱变仪配套使用的无菌不锈钢载片上，ARTP功率120W，通氦气载气流速10L·min‑1，冷却水循环机温度为20℃，处理时间从0秒开始，每4秒做一个递增，至52秒，共14组样品，每个样品处理结束后，不锈钢载片会自动掉落至装有无菌生理盐水的无菌EP管内，待样品全部处理完毕后取下EP管，在振荡器上将菌体振荡洗脱；

[0051] 统计不同处理时间下无氮培养基平板上的菌落数，按以下公式计算致死率：

[0052]

[0053] 式中，A指经ARTP处理后平板上生长出的菌落数，B指样品诱变处理0s的总菌落数；

[0054] 以诱变处理时间为横坐标，致死率为纵坐标绘制曲线，结果(参见图1)可见，随着诱变处理时间的增加，菌体的致死率不断上升。诱变时间为12s时，致死率达到80％以上；处理时间为20s时，致死率相对于16s略有下降，为77.7％，其致死率的下降可能是由于细胞启动损伤修复机制；诱变时间为24s时，致死率又重新上升，可能是由于细胞受到的损伤超出了自身的修复能力，导致损伤无法继续修复，从而使得致死率再次升高，诱变时间为36s及以上时，致死率达到100％。

[0055] 3)变异菌株筛选

[0056] 平板初筛：取经过上述ARTP诱变后振荡洗脱的菌液，均匀涂布在无氮固体培养基，每个时间梯度3次重复，28℃培养48h；从各试验组中的无氮培养基平板上共挑选出36个生长状态良好、菌落较大的单菌落，对照组的菌株编号为1号，各试验组的菌株按照挑选顺序‑1分别编号为2～37号，接种至无氮培养基液体试管，于28℃、200r·min 培养48h，测定36个初筛菌株的固氮酶活性，其中，有21株诱变株的固氮酶活高于野生菌，即58.33％的菌株发生了正向突变，选择其中10株酶活比野生菌高60％的突变株作为复筛的出发菌株。

[0057] 无氮固体培养基：蔗糖5.0g，KH2PO4 2.0g，K2HPO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeCl3 0.005g，CaCO3 0.1g，蒸馏水定容至1.0L，pH 7.0～7.5，15.0～20.0g琼脂。

[0058] 复筛：将筛选出的正向突变菌株转接至无氮液体培养基(即不加琼脂的无氮固体‑1培养基)，28℃、200r·min 培养48h后转接至固氮斜面培养基，28℃培养48h，测定复筛菌株的固氮酶活性，验证菌株的酶活稳定性。

[0059] 复筛结果显示，编号28s‑20突变株A2820的固氮酶活性与初筛时相当，为(207.47‑1 ‑1±6.73)nmol·mg ·h ，高于野生株101.72％，其余菌株的固氮酶活性均有不同程度的下降，均远低于初筛结果，表明这些菌株不具备遗传稳定性。因此，选择A2820作为最优突变株，并继续检验其遗传稳定性。

[0060] 其中，固氮酶活性的测定方法为：采用乙炔还原法测定固氮酶活性，固氮菌在斜面培养基(由每升固氮菌种子培养基加15.0～20.0g琼脂获得)培养48h后更换橡胶塞，向体系注入乙炔气体(v/v，99.99％)，使其终浓度为10％，28℃继续培养4h，取反应气体用气相色谱仪测定，根据乙烯标准工作曲线计算乙烯生成量；

[0061] 菌株固氮酶活性用每毫克菌体每小时将乙炔还原为乙烯的量表示，按照以下公式计算：

[0062]

[0063] 式中，P为气压(毫米汞柱)，t为反应温度(℃)，菌体蛋白量的测定采用考马斯亮蓝法，收集测定上述固氮斜面培养基上的所有菌体，测定固氮菌菌体蛋白的吸光值，根据牛血清白蛋白标准曲线计算菌体蛋白含量，最后根据公式计算得出固氮酶活性。

[0064] 菌体蛋白含量的测定：用5ml生理盐水洗涤、收集试管斜面菌体，加入3ml ‑10.5mol·L‑1的NaOH煮沸5min，加入3ml 0.5mol·L 的HCl，离心取上清1.0ml加入5ml考马斯亮蓝，混合、显色3min，测定595nm处吸光值A595，根据牛血清白蛋白标准曲线计算菌体蛋白含量。

[0065] 牛血清白蛋白标准曲线的绘制：取7只试管，分别加入浓度为0.5mg·mL‑1的牛血清白蛋白溶液0mL，0.1mL，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL，再依次分别加入1.0mL，0.9mL，0.8mL，0.6mL，0.4mL，0.2mL，0mL蒸馏水，每支试管加入5mL考马斯亮蓝G‑250溶液；振荡摇匀各试管内液体，静置5min，测定595nm处吸光值A595，以标准蛋白浓度为横坐标，A595为纵坐标，绘制标准曲线。

[0066] 根据各标准蛋白样品的浓度和其对应A595nm值，绘制工作曲线，结果如图2，测得2
的标准蛋白溶液的方程如下：y＝3.5007x+0.3706，R ＝0.9973，其中x为蛋白标准溶液浓度‑1
(mg·mL )，y为各浓度对应的A595nm值。

[0067] 初筛挑选出36株突变菌株，这些菌株的酶活性及相对于野生菌的增长率结果参见图3，可知，突变具有随机性，且发生正负向突变与诱变时间的长短无关，各诱变组均存在正负向突变。但当诱变时间为28s时，致死率即为94.6％，正突变率较高，且酶活力增长率与其他诱变时间组相比增长幅度较大。表明随着诱变致死率的升高，产生高酶活突变株的可能性越大。挑选的36株单菌中，有21株诱变株的固氮酶活高于野生菌，即58.33％的菌株发生了正向突变，其余为负向突变株，酶活力有不同程度的降低。

[0068] 在21株正向突变株中，有10株突变株的酶活比野生菌高60％以上，为检验其遗传稳定性，选择这些菌株重新测定酶活进行复筛。

[0069] 复筛结果见图4，编号28s‑20的突变株A2820的固氮酶活性与初筛时相当，为‑1 ‑1(207.47±6.73)nmol·mg ·h ，高于野生菌101.72％。编号20s‑18的菌株酶活增长率在
58.94％，相较于初筛时的酶活，降低了22.04％，其余菌株的固氮酶活性均有不同程度的下降，均远低于初筛结果，表明这些菌株不具备遗传稳定性。

[0070] 因此，选择诱变参数28s‑20的菌株A2820作为最优突变株，并继续检验其遗传稳定性。

[0071] 4)诱变菌株的遗传稳定性分析

[0072] 为了验证筛选得到的最优突变株的遗传稳定性，以无氮固体培养基传无氮固体培养基为一代，将复筛后获得的最优突变株A2820传代培养5代，每代均接种装有3mL无氮培养‑1基液体试管，28℃、200r·min 培养72h，测定每一代菌株的固氮酶活性，结果参见图5。

[0073] 可见，随着传代次数的增加，固氮酶活性始终稳定在210nmol·mg‑1·h‑1左右，表明突变株28s‑20具有良好的遗传稳定性。

[0074] 5)生物学特性检测

[0075] 将野生菌和最优突变株的种子液接种到装有100mL固氮菌液体培养基的250mL三‑1角瓶中，培养基设置不同的温度梯度，分别为26℃、28℃、30℃、32℃、34℃，200r·min 培养
48h后测定OD600，每个温度梯度3次重复；设置不同初始pH，分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、‑1
8.5，28℃、200r·min 培养48h后测定OD600，每个pH梯度3次重复；设置不同的接种量梯度，分别为1％、3％、5％、7％、9％，即分别接种1mL、3mL、5mL、7mL、9mL野生株和突变株种子液，‑1
每个梯度设置三组平行，28℃、200r·min 培养48h后测定测OD600，确定最佳接种量。

[0076] 最优突变株固褐固氮菌A2820的最佳培养温度为28℃；培养基初始pH在7.5左右时生长能力最好；接种量不是影响突变株生长量的主要因素，其最佳接种量和野生株一致，为3％。

[0077] 实施例2诱变固氮菌对植物生长量的影响

[0078] 采用盆栽试验，设置接种无氮培养基作为对照处理、接种褐球固氮菌CICC21686、接种突变株固褐固氮菌A2820共3个处理，检验诱变固氮菌对玉米生长的影响。

[0079] 盆栽土壤取自上海市农业科学院农业试验地，试验前，将土壤用2mm过筛，121℃灭菌1h，待冷却后重新灭菌，重复3次，盆栽容器为8cm×16cm×8cm(高×盆口直径×盆底直径)，每盆装等量干燥土。

[0080] 处理方法：将玉米种子用95％酒精处理5min，倾去酒精，加入3％NaClO溶液处理2min，倾去NaClO溶液，无菌水冲洗5次；播种玉米种子5粒，播种深度为1～2cm，玉米两叶一心期定苗，每盆保留长势一致的幼苗4株；每个处理3盆，设置3组平行试验，共27盆。

[0081] 试验在上海农科院组织培养室中进行，室内温度28℃，光周期16h光照/8h黑暗。

[0082] 将出发菌株褐球固氮菌CICC21686和突变株固褐固氮菌A2820在无氮培养基培养‑148h，稀释至OD600为1.5，实验组菌剂接种量100mL·盆 ，对照组施等量的无氮培养基，2d接种一次，共接种7次。待幼苗长至14d后，收获后，将植株烘干至恒重，分析植株干重及全氮量，植株全氮量由南京维百瑞生物科技有限公司测定。

[0083] 不同菌株处理的玉米植株固氮指标结果如表1所示：

[0084] 表1野生菌和突变菌处理的玉米固氮指标结果

[0085]

[0086] 可见，接种野生株和突变株的处理组与施用无氮培养基的对照组相比，植株干重及氮含量均有显著增加(P＜0.05)，且突变株固褐固氮菌A2820较野生株CICC21686的玉米植株干重和氮含量均显著增加(P＜0.05)，分别增加了21.16％和34.36％。

[0087] 表明固褐固氮菌A2820较出发菌株CICC21686能够显著增加玉米的固氮效能。

[0088] 固褐固氮菌突变株A2820具有较高的固氮酶活210‑280nmol·mg‑1·h‑1，培养后可稀释一定倍数喷洒在作物的根部或土壤中，如玉米、小麦、蔬菜等，以提高作物的氮含量。