一种无需微需氧装置培养幽门螺旋杆菌的方法

摘要

本发明涉及一种油性液态混合物及使用所述混合物培养幽门螺旋杆菌的方法。本发明的油性液态混合物不仅能够隔离空气，为幽门螺旋杆菌培养提供微厌氧环境，还能模拟幽门螺旋杆菌在体内生长环境，促进其生长。本发明的油性液态混合物的发明，解除了培养幽门螺旋杆菌对微需氧装置的特殊要求，且所述方法操作简便，不影响幽门螺旋杆菌生长，培养过程中易于随时观察幽门螺旋杆菌的生长状态。

权利要求

1.一种油性液态混合物用于幽门螺杆菌微需氧培养的用途，所述混合物由油酸、亚油酸和花生酸制备而成；其中，按体积比计算，所述混合物中油酸含量为42%、亚油酸含量为

38%、花生酸含量为20%。

2.一种幽门螺杆菌微需氧液态培养方法，具体包括如下步骤：

（1）制备一种油性液态混合物，所述混合物由油酸、亚油酸和花生酸制备而成，其中，按体积比计算，混合物中油酸含量为42%、亚油酸含量为38%、花生酸含量为20%；

（2）制备幽门螺杆菌液体培养基：称取一定量的脑心浸液培养基溶于一定体积的去离子水中，高压灭菌降至室温后加入胎牛血清和抗生素；

（3）液体培养基培养：将幽门螺杆菌接种于步骤（2）制备的幽门螺杆菌液体培养基中，在液体培养基表面加入步骤（1）制备得到的油性液态混合物至完全覆盖液体培养基液面，置于普通摇床振摇培养。

3.一种幽门螺杆菌微需氧固态培养方法，具体包括如下步骤：

（1）制备一种油性液态混合物，所述混合物由油酸、亚油酸和花生酸制备而成，其中，按体积比计算，混合物中油酸含量为42%、亚油酸含量为38%、花生酸含量为20%；

（2）制备幽门螺杆菌固体培养基：称取一定量的哥伦比亚血琼脂基础溶于一定体积的去离子水中，高压灭菌后冷却至40-60℃，加入无菌脱纤维马血、胎牛血清以及抗生素，混匀后倒入细菌培养皿中，静置冷却凝固；

（3）分离幽门螺杆菌：将含有幽门螺杆菌的胃或十二指肠粘膜组织机械研磨或组织酶消化制备成单细胞悬液；

（4）固体培养基培养：吸取一定体积的步骤（3）制备细胞悬液涂布到步骤（2）制备的幽门螺杆菌固体培养基上，待固体培养基表面涂液风干后加入步骤（1）制备得到的油性液态混合物至所述混合物的完全覆盖固体培养基表面，将所述涂布后固体培养基放入培养箱培养。

4.根据权利要求2-3任一项所述的方法，其特征在于：所述液体培养基或固体培养基中，加入胎牛血清的终浓度为5%-15%。

5.根据权利要求2-3任一项所述的方法，其特征在于：所述液体培养基或固体培养基中，加入的抗生素为多种抗生素的混合，分别为5-15mg/L 的amphotericin B ，3-6 mg/L的trimethoprim，5-15mg/L 的vancomycin和5-15mg/L的 cefsulodin，浓度为抗生素在培养基中的终浓度。

6.根据权利要求2-3任一项所述的方法，其特征在于：所述液态培养方法的培养条件为：35-40℃， 100-200转/分，普通摇床振摇培养5-10天；所述固态培养方法的培养条件为：

35-40℃培养5-10天。

说明书

一种无需微需氧装置培养幽门螺旋杆菌的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种细胞培养用油性液态混合物及其细胞培养方法，特别涉及使用油性液态混合物培养幽门螺旋杆菌的方法，属于细胞培养技术领域。

背景技术

[0002] 幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是一种革兰氏阴性、螺旋形、微厌氧、对生长条件要求十分苛刻的细菌。自1982年澳大利亚学者发现Hp，并将其从胃粘膜分离出来，对Hp的研究就成为胃肠病研究的重点。研究中心逐渐发现，Hp感染可引起胃炎、消化道溃疡、胃淋巴瘤以及胃癌等。Hp在全球人群中的感染率超过50%，我国Hp的感染率范围为42%~64%。 Hp培养是对胃或十二指肠黏膜细菌进行培养检测Hp感染的方法，敏感性98%，特异性
100%，是诊断Hp感染的“金标准”，可用于临床诊断、治疗效果评估、新诊疗方法评价、体外药物敏感试验等。

[0003] 由于Hp是一种专性微需氧菌，在大气或绝对厌氧条件下均不能生长，体外分离培养需要含5% 8%氧气的微需氧环境。换句话说，Hp生长条件苛刻，较一般细菌培养困难异常。~
目前，用于培养Hp的培养基主要有两种，分别为脑心浸液基础培养基和固体培养基。但不管何种培养基进行Hp的培养，均需要使用能够提供微需氧装置。用于Hp培养的微需氧装置主要有两种：1、三气培养箱：给以氧气5%，二氧化碳15%，氮气85%的混合微需氧的气体环境。2、密封箱与微需氧产气袋的联合运用：在密封箱内，微需氧产气袋可制造出6% 12%O2，5% 8%~ ~
CO2的气体环境。三气培养箱可为Hp生长提供较为精准浓度的气体环境，是Hp体外分离培养的首选微需氧装置，但其缺点是价格昂贵，在基层医疗和科研机构难以普及。通过微需氧产气袋在一定体积的密封箱内制造微需氧环境克服了三气培养箱的上述缺点，但其不足是培养过程中需开启密封箱观察Hp的生长状态，若继续培养必须更换新的微需氧产气袋，造成培养成本的增加；其次，密封箱体积一般仅2.5升，不适合大规模样本的培养。

[0004] 本发明依据Hp在体内定居的微环境特点以及生长的营养需求制备了一种专门用于Hp培养的油性液态混合物，Hp接种到固体或液体培养基后再用该油性液态混合物进行封闭，使Hp在无微需氧装置的普通培养箱中即可进行分离培养，解除了培养Hp对微需氧装置的特殊要求。该油性液态混合物具有操作简便，不影响Hp生长，培养过程中易于随时观察Hp的生长状态，适合普及等优点。

发明内容

[0005] 为解决当前Hp培养困难的现状，本发明提供一种专门用于Hp培养的油性液态混合物。本发明的混合物能够为Hp培养提供微厌氧环境，并能提供类似Hp体内的生长环境。使用本发明的油性液态混合物只需在普通培养箱中即可分离培养Hp，而无需使用Hp培养的微需氧装置。

[0006] 因此，本发明一方面提供一种油性液态混合物，所述混合物由油酸、亚油酸和饱和脂肪酸制备而成，所述饱和脂肪酸优选为棕榈酸、硬脂酸、花生酸中的一种或多种。

[0007] 所述油性液态混合物中，所述油酸优选按体积比40-65%油酸、18-38%亚油酸、15-24%饱和脂肪酸混合制备而成。

[0008] 另一方面，本发明提供一种所述油性液态混合物用于幽门螺旋杆菌微需氧培养的用途。

[0009] 本发明进一步提供一种幽门螺旋杆菌微需氧培养方法，具体包括如下步骤：

[0010] （1）制备油性液态混合物：述混合物由油酸、亚油酸和饱和脂肪酸制备而成，所述饱和脂肪酸优选为棕榈酸、硬脂酸、花生酸中的一种或多种。

[0011] （2）制备Hp液体或固体培养基：

[0012] A．制备Hp液体培养基：称取一定量的脑心浸液培养基溶于一定体积的去离子水中，高压灭菌降至室温后加入胎牛血清和抗生素；

[0013] B．制备Hp固体培养基：称取一定量的哥伦比亚血琼脂基础培养基溶于一定体积的去离子水中，高压灭菌后冷却至40-60℃左右（优选为55℃），加入无菌脱纤维马血、胎牛血清以及抗生素，混匀后倒入细菌培养皿中，静置冷却凝固。

[0014] （3）分离Hp：将含Hp的胃或十二指肠粘膜组织机械研磨或组织酶消化制备成单细胞悬液；（4）液体培养基或固体培养基进行Hp培养：

[0015] A．液体培养基培养：将Hp接种于步骤（2）制备的Hp液体培养基中，在液体培养基表面加入步骤（1）制备得到的油性液态混合物至完全覆盖液体培养基液面；置于普通摇床振摇培养；

[0016] B．固体培养基培养：吸取一定体积的上述悬液涂于步骤（2）制备得到的Hp固体培养基上，待固体培养基表面涂液风干后加入步骤（1）制备得到的油性液态混合物至所述混合物的完全覆盖固体培养基表面；将接种有Hp的固体培养基放入无微需氧装置的普通培养箱培养。

[0017] 其中，所述液体培养基中，胎牛血清的终浓度为5%-15%（优选10%）；所述抗生素为多种抗生素的混合，分别为5-15mg/L 的amphotericin B (优选10 mg/L)、3-6 mg/L的trimethoprim（优选5 mg/L），5-15mg/L 的vancomycin  (优选10 mg/L)， 5-15mg/L的 cefsulodin (优选10 mg/L)；所述浓度为抗生素在培养基中的终浓度。

[0018] 所述固体培养基中，所述无菌脱纤维马血的终浓度为5-%（优选10%）、所述胎牛血清的终浓度为5%-15%（优选10%）；所述抗生素为多种抗生素的混合，分别为5-15mg/L 的amphotericin B (优选10 mg/L)、3-6 mg/L的trimethoprim（优选5 mg/L），5-15mg/L 的vancomycin (优选10 mg/L)， 5-15mg/L的 cefsulodin (优选10 mg/L)，所述浓度为抗生素在培养基中的终浓度。

[0019] 所述液体培养方法的培养条件为：35-40℃，普通摇床100-200转/分振摇培养5-10天；所述固体培养方法的培养条件为：35-40℃培养5-10天。

[0020] 本发明的油性液态混合物不仅能够为Hp培养提供微需氧环境，还能够模拟人体内Hp生长环境，能够很好的培养Hp。本发明的方法使Hp在普通培养箱中即可进行分离培养，极大的克服了现有培养缺陷，摆脱了Hp培养对特殊装备的需求。且本发明的方法该操作简便，不影响Hp生长，可随时观察Hp的生长状态。

附图说明

[0021] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

[0022] 图1是幽门螺旋杆菌固体培养平板图；

[0023] 图2是幽门螺旋杆菌固体培养菌落PCR鉴定电泳图；

[0024] 图3是幽门螺旋杆菌固液体培养PCR鉴定电泳图。

具体实施方式

[0025] 以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

[0026] 实施例1：Hp固体培养方法

[0027] （1）制备油性液态混合物

[0028] 将42毫升油酸、38毫升亚油酸和20毫升花生酸混合，制备成100毫升油性液态混合物；

[0029] （2）制备Hp液体培养基和Hp固体培养基

[0030] 液体培养基：称取11.1g脑心浸液培养基溶于270ml去离子水中，高压灭菌降至室温后加入30ml胎牛血清和amphotericin B (终浓度10 mg/L)、trimethoprim (终浓度5 mg/L)、vancomycin (终浓度10 mg/L)、cefsulodin (终浓度10 mg/L)；

[0031] 固体培养基：称取哥伦比亚血琼脂基础培养基13.2克溶于240ml去离子水中，高压灭菌后冷却至55℃左右，加入30ml无菌脱纤维马血、30ml胎牛血清以及amphotericin B (终浓度10 mg/L)、trimethoprim (终浓度5 mg/L)、vancomycin (终浓度10 mg/L)、cefsulodin (终浓度10 mg/L)；充分混匀后倒入直径90mm的细菌培养皿中，静置冷却凝固，4℃保存备用。

[0032] （3）分离获得的Hp

[0033] 患者胃镜镜检获得的胃或十二指肠粘膜组织经尿素酶实验证实存在Hp感染后，将该组织在PBS溶液中机械研磨成单细胞悬液，室温离心沉淀细胞，弃上清后用步骤（1）所述Hp液体培养基重悬沉淀得Hp细胞悬液；

[0034] （4）固体培养基进行Hp培养

[0035] 吸取500μl上述步骤（3）的细胞悬液悬液用三角涂布棒涂于步骤（2）所述Hp固体培养基上，待固体培养基表面涂液风干后加入500μl的步骤（1）所述油性液态混合物；将接种有Hp的固体培养基放入普通培养箱，37℃培养7天后观察结果；

[0036] （5）Hp的鉴定

[0037] 用Hp特异性引物对培养结果进行菌落PCR鉴定，目的扩增产物分子量为421bp，使用的引物为：

[0038] flaM sense: 5’- AAAAACATGCCCTATTTAAGA-3’

[0039] flagM antisense: 5’-GGAATTGCAAAAACAGATTTC-3’

[0040] 扩增条件：95℃，10分钟， （95℃，30秒；52℃，30秒；72℃，30秒）40个循环。

[0041] 用油性物质封闭的固体培养基置于普通培养箱培养7天后，平板上均生长出大小不一的菌落（见图1），挑取单克隆菌落进行Hp菌落PCR鉴定，均扩增出阳性条带（见图2），证明生长菌落为Hp。

[0042] 实施例2：Hp液体培养方法

[0043] 吸取4ml 实施例1步骤（2）制备的Hp液体培养基加入至15ml玻璃试管中，挑取实施例1固体培养基上生长出的Hp单克隆接种于所述液体培养基中，在液体培养基表面加入500μl油性液态混合物；37℃，摇床振摇（150转/分）培养7天后观察结果；结果使用实施例1步骤（5）的方法进行鉴定。

[0044] 结果显示，用油性物质封闭的液体培养基接种Hp后，振摇培养7天用Hp菌落PCR鉴定，证实Hp液体培养用油性物质封闭后可达到与在微需氧装置中同样的培养效果（见图3）。

[0045] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。