纳米孔测序平台的宏基因组建库方法及其试剂盒

摘要

本发明涉及一种纳米孔测序平台的宏基因组建库方法及其试剂盒。通过对建库中的末修连接以及PCR扩增等进行优化调整，本发明的建库方法及其试剂盒有效降低了建库起始量，提高了测序数据读长和质量，压缩了建库和测序时间，节约了测序成本，同时还提高整个流程的灵敏度，满足了临床对于感染检测的要求，适于推广应用。

权利要求

1.一种基于纳米孔测序的建库方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤1)DNA末端修复；

步骤2)BCA接头连接；

步骤3)PCR扩增；

步骤4)混库加RAP接头；

所述步骤1)中，末端修复采用的末端修复酶来自Vazyme的 Universal End preparation Module for V2；所述步骤2)中BCA接头连接的连接酶来自Vazyme的Universal Adapter Ligation Module for V2；所述步骤3)PCR扩增的DNA聚合酶来自Takara的 GXL DNA Polymerase；

所述方法是以ONT的PCR条码试剂盒SQK‑PBK004的建库方法为基础。

2.权利要求1所述的一种基于纳米孔测序的建库方法，其特征在于，所述步骤3)PCR扩增过程中的反应体系为50‑80μL。

3.权利要求2所述的一种基于纳米孔测序的建库方法，其特征在于，所述步骤3)PCR扩增过程中的反应体系为50μL。

4.权利要求1‑3任一所述的一种基于纳米孔测序的建库方法，其特征在于，所述步骤1)的DNA末端修复体系为：

组分 体积

样本核酸 100ng

End prep Mix4 15μLNuclease‑Free Water 补至60μL所述End  prep Mix4来自于 Universal End preparation Module forV2。

5.权利要求4所述的一种基于纳米孔测序的建库方法，其特征在于，所述步骤2)的BCA接头连接体系为：

组分 体积

末端修复反应产物 60μLRapid Ligation Buffer 2 25μLRapid DNA Ligase 5μLBCA 10μL

所述Rapid Ligation Buffer 2来自于 Universal Adapter Ligation Module for V2。

6.权利要求1‑3任一所述的一种基于纳米孔测序的建库方法，其特征在于，所述步骤3)的PCR扩增体系为：

组分 体积

5×PS GXL Buffer 10μLDNA 32.5μL

LWB 1μL

dNTP Mix 4μL

PrimeSTAR GXL 2μLNuclease‑free water 补至50μL所述5×PS GXL Buffer和PrimeSTAR GXL，来自于 GXL DNA Polymerase。

7.权利要求6所述的一种基于纳米孔测序的建库方法，其特征在于，所述步骤3)PCR扩增条件如下：

8.一种用于纳米孔测序的建库试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的末端修复酶来自Vazyme的 Universal End preparation Module for V2，所述试剂盒中的连接酶来自Vazyme的 Universal Adapter Ligation Module for V2，所述试剂盒中的DNA聚合酶来自Takara的 GXL DNA Polymerase；所述试剂盒以ONT的PCR条码试剂盒SQK‑PBK004为基础。

9.权利要求8所述的用于纳米孔测序的建库试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试剂盒一和试剂盒二组分，其中：所述试剂盒一组分如下：

所述试剂盒二组分如下：

说明书

纳米孔测序平台的宏基因组建库方法及其试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及测序领域，具体涉及一种基于纳米孔测序平台的宏基因组建库方法及其试剂盒。
技术背景

[0002] 感染性疾病是造成人类疾病和死亡的重要原因。在呼吸道感染中，2016年，全球下呼吸道感染造成至少300万人死亡。然而，由于方法的局限性，确定下呼吸道感染的病因仍
然具有挑战性。诊断下呼吸道感染的传统方法包括培养和血清学检查，敏感性低并且耗时
长。从统计学上讲，只有38％的具有影像学证据支持的成年肺炎患者可以成功鉴定到病原
体。广谱抗生素的滥用使病原体的鉴定更加困难。对于每位患者，缓慢的诊断过程会导致经
验性的广谱抗生素治疗不当，随后肠道微生物组紊乱，治疗效果差，住院时间延长和费用负
担增加。更不用说这种经验性的广谱抗生素治疗会加剧全球耐多药病原体。

[0003] 与培养方法不同，分子方法通过丰富的遗传分子识别病原体，从而跳过了微生物生长的大量时间，因此比培养方法要快得多。靶向方法(如PCR)是快速的诊断方法，但是只
能对于特定的病原体进行检测，对于罕见或新发病原体难以及时鉴定。因此，快速、准确地
确定下呼吸道感染病原体对于临床具有重大意义。

[0004] 宏基因组测序鉴定相较于传统的培养鉴定方法，鉴定周期短、对操作人员技术水平要求低等优势。宏基因组测序也克服了很多不能培养的微生物的鉴定弊端，越来越多地
应用于微生物鉴定中，特别是不明原因病原微生物的鉴定。目前主流的宏基因组测序方法
主要是高通量测序方法，包括二代测序和三代测序。其中三代测序如纳米孔测序以其包括
超长序列读长、实时数据产生生信分析和设备小巧便携等卓越的特征，是目前比较快捷方
便的宏基因组研究方法。

[0005] 在宏基因组的研究领域，对于一些珍贵的样本，往往提取获得的核酸量非常有限；另一方面如果在样本处理过程中使用了去宿主流程，这样提取得到的核酸量也非常低，因
此，在很多情况下，为了满足测序上机的要求，通过PCR扩增来提高样本总量，还是一个必不
可少的选择。

[0006] 目前英国牛津纳米孔公司提供的官方试剂盒中满足低起始量、提供多样本混合测序功能的试剂盒只有快速PCR条码试剂盒(SQK‑RPB004)和PCR条码试剂盒(SQK‑PBK004)。但
是PCR条码试剂盒(SQK‑RPB004)是通过转座酶打断的方法来添加Barcode，这往往需要基因
组比较完整，而对于临床样本而言提取后基因组常常片段化严重，因此影响建库成功率。而
PCR条码试剂盒(SQK‑PBK004)的建库起始量要求100ng，首先通过NEBNext末端修复/dA尾添
加模块(NEBNext End Repair/dA‑tailing module)进行修复和dA尾添加，中间经过一步纯
化，再将含有引物位点的接头连接至制备好的末端纯化产物上，试剂盒中含有12个引物对，
进行PCR体系(LongAmpTaq 2X master mix，延伸时间6mins)来扩增每个样本。后面进行混
库，纯化，加接头，上机测序。可以看到这个流程耗时很长，无法满足临床对于感染检测流程
简便、快速的需求，

[0007] 现有技术中仍亟需一种更为高效便捷，适宜于临床样本核酸低质量特点的宏基因组测序的建库方法。有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

[0008] 本发明需要解决的核心目的是寻求一种能够缩短时间和节约成本的测序建库试剂盒。本发明在对基于ONT PCR条码试剂盒(SQK‑PBK004)建库进行优化时，惊奇的发现，当
选择Vazyme的末端修复酶和连接酶，以及Takara的聚合酶替换原流程中的酶体系后，能够
显著降低建库起始量，提高测序数据读长、质量以及整个流程的灵明度，还明显压缩建库和
测序时间，节约了测序成本。

[0009] 进一步的，本发明提供如下技术方案：

[0010] 本发明提供一种基于纳米孔测序的建库方法，所述方法包括如下步骤：

[0011] 步骤1)DNA末端修复；

[0012] 步骤2)BCA接头连接；

[0013] 步骤3)PCR扩增；

[0014] 步骤4)混库加RAP接头；

[0015] 在一些实施方式中，所述步骤1)中，末端修复采用的末端修复酶来自Vazyme的Universal End preparation Module for V2；

[0016] 在一些实施方式中，所述步骤2)中BCA接头连接的连接酶来自Vazyme的Universal Adapter Ligation Module for V2。

[0017] 在一些实施方式中，所述步骤3)PCR扩增的DNA聚合酶来自Takara的GXL DNA Polymerase。

[0018] 在一些实施方式中，所述步骤3)PCR扩增过程中的反应体系为50‑80μL，优选为50μL。

[0019] 在一些实施方式中，所述步骤1)的DNA末端修复体系为：

[0020]组分 体积
样本核酸 100ng
End prep Mix4 15μL
Nuclease‑Free Water 补至60μL

[0021] 所述说Endprep Mix4来自于 Universal End preparation Module forV2。

[0022] 在一些实施方式中，所述步骤2)的BCA接头连接体系为：

[0023] 组分 体积末端修复反应产物 60μL
Rapid Ligation Buffer 2 25μL
Rapid DNA Ligase 5μL
BCA 10μL

[0024] 所述Rapid Ligation Buffer 2来自于 Universal Adapter Ligation Module for V2。

[0025] 在一些实施方式中，所述步骤3)的PCR扩增体系为：

[0026] 组分 体积5×PS GXL Buffer 10μL
DNA 32.5μL
LWB 1μL
dNTP Mix 4μL
PrimeSTAR GXL 2μL
Nuclease‑free water 补至50μL

[0027] 所述5×PS GXL  Buffer和PrimeSTAR  GXL，来自于 GXL DNA Polymerase。

[0028] 在一些实施方式中，所述步骤3)PCR扩增条件如下：

[0029]

[0030] 在一些优选的实施例中，所述步骤3)PCR扩增条件如下：

[0031]

[0032]

[0033] 在一些实施方式中，所述方法是以ONT的PCR条码试剂盒SQK‑PBK004的方法为基础；优选的，采用Vazyme的末端修复酶和连接酶，以及Takara的聚合酶替换原流程中的酶体
系。

[0034] 在一些更优选的实施方式中，示例性的提供一种特定的基于纳米孔测序的建库方法，

[0035] 一、DNA片段的末端修复

[0036] 1在PCR管中加入末修体系：

[0037] 组分 体积样本核酸 100ng
End prep Mix4 15μL
Nuclease‑Free Water 补至60μL

[0038] 2混匀离心后，进行PCR反应：

[0039]温度 时间
20℃ 10min
65℃ 10min

[0040] 二、接头连接：

[0041] 1反应结束后，向PCR管中加入接头连接体系：

[0042]组分 体积
上一步末端修复反应产物 60μL
Rapid Ligation Buffer 2 25μL
Rapid DNA Ligase 5μL
BCA 10μL

[0043] 2混匀20℃孵育。

[0044] 三、纯化

[0045] 1加入0.4×AMPure XP beads室温旋转混匀孵育5min，离心弃上清；

[0046] 2 80％酒精洗2次beads；

[0047] 3加入Nuclease‑free water，室温孵育2min。

[0048] 四、PCR扩增

[0049] 1配制PCR反应mix：

[0050]

[0051]

[0052] 2涡旋混匀，置于PCR仪上设置好反应程序；

[0053]

[0054] 3 Qubit检测。

[0055] 优选的，该特定的基于纳米孔测序的建库方法还进一步包括纯化和加接头等步骤：

[0056] 五、纯化和混库：

[0057] 1加0.5×AMPure XP beads室温旋转混匀孵育5min，离心后弃上清；

[0058] 2 80％酒精洗2次beads；

[0059] 3加入Nuclease‑free water，室温旋转混匀孵育2min后Qubit测浓度；

[0060] 4混库：根据纯化后的样本浓度，按照数据产出要求成比例混库，保持混库总量在900‑1800ng。

[0061] 六、加接头：

[0062] 1加入0.5×beads室温旋转混匀孵育5min，离心后弃上清；

[0063] 2 80％酒精洗2次beads；

[0064] 3 10mM Tris‑HCl(50mM NaCl)pH 8.0洗脱液洗脱，离心后Qubit检测；

[0065] 4加入1μL RAP，室温反应5‑10min。

[0066] 七、按照标准纳米孔测序上机流程上机测序。

[0067] 本发明还提供一种用于纳米孔测序的建库试剂盒，所述试剂盒以ONT的PCR条码试剂盒SQK‑PBK004为基础，所述试剂盒中的末端修复酶来自Vazyme的 Universal 
End preparation Module for V2，所述试剂盒中的连接酶来自Vazyme的
Universal Adapter Ligation Module for V2；

[0068] 在一些实施方式中，所述试剂盒中的DNA聚合酶来自Takara的 GXL DNA Polymerase。

[0069] 在一些优选的实施方式中，所述试剂盒包括试剂盒一和试剂盒二，

[0070] 其中：所述试剂盒一包含如下组分：

[0071]

[0072] 所述试剂盒二包含如下组分：

[0073]

[0074] 在另一些优选的实施方式中，所述试剂盒中各组分的用量如下：

[0075] 试剂盒一包含如下组分(‑20℃±5℃保存)：

[0076]

[0077]

[0078] 试剂盒二包含如下组分(2～8℃保存)：

[0079]

[0080] 本发明有益技术效果：

[0081] 1、本发明通过对末修连接以及PCR步骤等的优化，不仅提高了测序数据的读长和质量，还压缩了测序时间，大大节约测序成本。

[0082] 2、本发明还有效降低了建库的起始量，对于极低的建库起始量的样本均可以成功建库，为去宿主样本及珍贵的临床样本测序检测提供可能性。

[0083] 3、本发明整套方法和试剂盒能够提高整个流程的灵敏度，增加物种鉴定和耐药分析的可信度。

[0084] 4、本发明从检测流程的整体上优化了流程时间，满足临床对于感染检测周期的要求，整个建库时长缩短3小时，具有显著意义，适于推广应用。

附图说明

[0085] 图1 3个临床样本mz102、mz104和mz105用两个不同的流程处理得到的数据从Reads长度和质量两方面进行评估。对比所示，数据的合格比例(框中部分)，3个样本均是优
化后高于原流程。

[0086] 图2 3个临床样本mz111、na103和na113用两个不同的流程处理得到的数据从Reads长度和质量两方面进行评估。对比所示，数据的合格比例(框中部分)，3个样本均是优
化后高于原流程。

具体实施方式

[0087] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体
条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为
可以通过市场购买获得的常规产品。

[0088] 部分术语定义

[0089] 除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员
很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。

[0090] 如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”等可互换使用且具有相同含义。类似地，“包含”、“包括”、“具有”等可互换使用且具有相同含义。具体地，每个术语都与通常美国专
利法“包含”的定义一致地定义，并且因此被解释为开放术语，意指“至少以下”，并且还被解
释为不排除额外的特征、限制、方面等。因此，例如，“具有组件a、b和c的装置”意味着该装置
至少包括组件a、b和c。类似地，短语：“涉及步骤a、b和c的方法”意味着该方法至少包括步骤
a、b和c。此外，尽管本文可以以特定顺序概述所述步骤和过程，但技术人员将认识到，排序
步骤和过程可以变化。在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一
种”，“所述”，包括该名词的复数形式。

[0091] 本发明中的术语“大约”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。

[0092] 此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在
适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其
它顺序实施。

[0093] 本发明中的术语“核酸”可以是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语可包含含有已知核苷酸类似物或修饰骨架残基或连接的核酸，它们
是合成的、天然形成的和非天然形成的，具有与参考核酸类似的结合性质并以类似于参考
核苷酸的方式代谢。这样的类似物的实例可包括但不限于硫代磷酸酯、亚磷酰胺
(phosphoramidites)、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2‑O‑甲基核糖核苷酸、肽‑核酸(PNAs)。术
语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。

[0094] 本发明中的术语“核苷酸”除了指天然形成的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体外，还可被理解为是指就使用核苷酸的特定环境(例如与互补碱基杂交)而言功能上等效的
其相关结构变体，包括衍生物和类似物，除非上下文清楚地另行指明。

[0095] 本发明中的术语“引物”可以是指提供DNA合成的起始点的短核酸序列。

[0096] 本发明中的术语“纳米孔”是指在膜中形成或以其它方式提供的孔隙、通道或通路。膜可以是有机膜，如脂质双层，或合成膜，如由聚合物材料形成的膜。纳米孔可毗邻或靠
近传感电路或耦合至传感电路，例如诸如互补金属氧化物半导体(CMOS)或场效应晶体管
(FET)电路的电极布置。在一些实例中，纳米孔具有大约0.1纳米(nm)至大约1000nm的特征
宽度或直径。一些纳米孔是蛋白质。

[0097] 本发明中的术语“纳米孔测序”或“基于纳米孔的测序”是指借助于纳米孔测定多核苷酸的序列的方法。在一些实施方案中，以模板依赖性方式测定多核苷酸的序列。本文公
开的方法不受限于任何纳米孔测序方法、系统或装置。

[0098] 本发明中术语“条形码”意指存在于核酸序列中以便对其进行鉴别的寡核苷酸。

[0099] 本发明中术语“测序”是指确定核酸中的碱基的顺序和位置。

[0100] 本发明所用试剂和耗材：

[0101] 核酸纯化试剂：AgencourtAMPure XP beads(货号：A63881)；无酶无菌水：ThermoFisher，Nuclease‑Free Water(not DEPC‑Treated)(货号：AM9937)；Qubit荧光定量
仪DNA检测试剂盒：Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit(货号：Q33231)；建库末端修复模块：
Universal End preparation Module for V2(货号：N203)；建库末端修
复模块：NEBNext Ultra II End repair/dA‑tailing Module(货号：E7546)；建库接头连接
模块： Universal Adapter Ligation Module for V2(货号：N204)；建库
接头连接模块：NEB Blunt/TA Ligase Master Mix(货号：M0367)；建库PCR扩增酶：Takara
的 GXL DNA Polymerase(货号：R050A)；建库PCR扩增酶： Taq DNA 
Polymerase(货号：M0323L)；建库PCR扩增酶：HifiHotstart Ready mix(货号：KK2602)核酸
TM
标准品ZymoBIOMICS  Microbial Community DNA Standard(Catalog Nos.D6305)。

[0102] 英国牛津纳米孔公司ONT的快速PCR条码试剂盒(SQK‑RPB004)：FRM(片段化混合物)：1管；RLB(快速条形码引物)：01‑12A，共12管；RAP(快速接头)：1管；SQB(测序缓冲液)：1
管；SQT(测序膜固定物)：1管；LB(测序上样珠)：1管。

[0103] 英国牛津纳米孔公司ONT的PCR条码试剂盒(SQK‑PBK004)：LWB(条形码引物)：01‑12，共12管；RAP(快速接头)：1管；SQB(测序缓冲液)：1管；LB(测序上样珠)：1管。

[0104] 实施例1性能优化和参数调整实验

[0105] 本发明以ONT的PCR条码试剂盒(SQK‑PBK004)为基础进行优化实验。

[0106] 本发明首先选用了Zymo Research公司生产的一款DNA核酸标准品ZymoBIOMICSTM Microbial Community DNA Standard(CatalogNos.D6305)作为验证的输入，它是由精确定
量比例的临床上非常常见的8种细菌和2种真菌组成，总体的GC含量分布很广(15％‑85％，
如下表，DNA标准品组成(Catalog Nos.D6305(Zymo Research，产品说明书))。其对于研究
微生物组是一个很好的标准品。

[0107] 表1.ZymoBIOMICSTM Microbial Community DNA Standard菌株信息

[0108]

[0109] 1)末端修复和连接酶的优化筛选

[0110] 考虑到宏基因组建库测序的对样本量、实验精度以及时间成本等高要求，实验过程中不同型号的酶体系都会对于建库或测序结果产生很大影响。因此本发明前期对KAPA 
HyperPlus kit里的末修‑连接模块(货号：KK8511)、天根TIANSeq快速DNA片段化/末端修
复/dA添加模块(货号：NG301)、翊圣快速末端修复/A尾添加模块(货号：12605ES24)等数种
酶进行预筛选，获得效果较优的国产南京诺唯赞生物Vazyme的末端修复和连接试剂
Universal End preparation Module for V2(货号：N203)和
Universal Adapter Ligation Module for V2(货号：N204)。

[0111] 进一步的，本发明将ZymoDNA标准品作为输入样本，比较测试了Universal End preparation Module for V2(货号：N203)和 Universal 
Adapter Ligation Module for V2(货号：N204)与ONT官方试剂NEBNext Ultra II 
End repair/dA‑tailing Module(货号：E7546)和NEB Blunt/TA Ligase Master Mix(货
号：M0367)的末修‑连接效果。

[0112] 如下表所示，令人惊奇的，国产Vazyme试剂的末修‑连接流程总用时比ONT官方推荐的NEB试剂短30min，并且无论是较低(1ng)或者更低(0.1ng)的建库起始量，使用相同的
PCR流程，最终出库的核酸浓度都是Vazyme高于NEB，证明Vazyme试剂不但流程时间更短，末
修‑连接效果也更好。

[0113]

[0114] 2)DNA聚合酶的优化筛选

[0115] 为了进一步优选PCR步骤的试剂，本发明依然利用Zymo DNA标准品，采用同样的末修连接流程进行实验。除了ONT官方使用NEB的LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix(货
号：M0533S)，本发明还选用了其他多家公司的产品共同测试，比如Takara的
GXL DNA Polymerase(货号：R050A)和KAPA的HifiHotstart Ready mix(货号：KK2602)。

[0116] 通过三种酶的比较发现，如下表所示，Takara的PCR流程的耗时最少(54min)，它的扩增速度是每合成1000bp耗时10s，而其他两个酶都需要1分钟。而且Takara酶的PCR后的产
物得率确最高；KAPA的酶虽然得率不错，但是流程时间还是相对较长(130min)。可见，聚合
酶选择Takara的 GXL DNA Polymerase(货号：R050A)。

[0117]

[0118] 3)DNA聚合酶的使用条件优化筛选

[0119] 接下来，本发明对于Takara的 GXL DNA Polymerase(货号：R050A)的具体使用条件(包括退火温度、PCR反应体积、延伸时间)进行了进一步的优化。首先，如下表
所示，本发明分别测试了两个退火温度(56℃和65℃)和两个反应体系(50μL、80μL和100μ
L)，PCR反应完成后测定浓度，扩增产物浓度可以粗略的评估PCR扩增产量，可以看到50μL体
系、65℃退火的条件最优。然后，取500ng DNA进行后续的纯化步骤，因为本发明使用的是
0.5*beads纯化，一些较小的片段，比如引物二聚体不是本发明的目标，会被丢弃。因此，纯
化得率可以更准确地衡量PCR的扩增效率，从这项指标来说，也是50μL体系、65℃退火的条
件最优。

[0120]

[0121] 然后，本发明对于延伸时间进行了进一步地评估，为了取得更优地扩增长度，通过如下表所示的测试，最终选定45‑60s，优选45s的延伸时间，得到最优的纯化得率，并且扩增
片段的平均长度通过测序评估也是最优的。

[0122]

[0123] 实施例2确立本发明方法体系

[0124] 基于实施例1的优化实验，获得本发明的建库方法体系，该方法体系以ONT的PCR条码试剂盒(SQK‑PBK004)为基础。

[0125] 一、DNA片段的末端修复

[0126] 1在0.2mL PCR管中加入末修体系：

[0127]

[0128] 注：样本提取总量补足100ng，投入45μL。

[0129] 2用移液器轻轻吹打混匀(请勿震荡混匀)，短暂离心后将反应液收集至管底，将PCR管置于PCR仪上进行下述反应：

[0130] 温度 时间20℃ 10min
65℃ 10min

[0131] 二、接头连接：

[0132] 1反应结束后，向PCR管中加入接头连接体系：

[0133]

[0134] 2用移液器吹打混匀，PCR管置于PCR仪上，20℃孵育15min。

[0135] 三、纯化

[0136] 1加入0.4×AMPure XP beads室温旋转混匀孵育5min，短暂离心后放磁力架上静置，弃上清；

[0137] 2取200μL新鲜配制的80％酒精洗2次beads，注：80％酒精需现用现配。

[0138] 3加入35μL Nuclease‑free water，室温旋转混匀孵育2min，短暂离心后放磁力架上至澄清；

[0139] 4小心吸取33.5μL上清至0.2mL PCR管中，取1μL进行Qubit测浓度。

[0140] 四、PCR扩增

[0141] 1在0.2mL PCR管中配制PCR反应mix：

[0142]

[0143] 2涡旋混匀，短暂离心后将反应液收集至管底，将PCR管置于PCR仪上设置好反应程序；

[0144]

[0145]

[0146] 3 PCR完Qubit检测浓度，并记录。

[0147] 五、纯化

[0148] 1在PCR反应管中加入0.5×AMPure XP beads室温旋转混匀孵育5min，短暂离心后放于磁力架上，待液体澄清，弃上清；

[0149] 2取200μL新鲜配制的80％酒精洗2次beads；

[0150] 3加入26μL Nuclease‑free water，室温旋转混匀孵育2min，短暂离心后放于磁力架上至澄清；

[0151] 4小心吸取25μL上清至1.5mL离心管中，1μL Qubit测浓度。

[0152] 六、混库：根据纯化后的样本浓度，按照数据产出要求成比例混库，保持混库总量在900‑1800ng。

[0153] 七、纯化加接头：

[0154] 1加入0.5×beads室温旋转混匀孵育5min，短暂离心后放磁力架上去上清；

[0155] 2用200μL新鲜配制的80％酒精洗2次beads；

[0156] 3加入12μL 10mM Tris‑HCl(50mM NaCl)pH 8.0洗脱液，室温旋转混匀孵育2min，短暂离心后放磁力架上至澄清；小心吸取11μL上清至1.5mL低吸附的离心管中；

[0157] 4QC：取1μLQubit检测；

[0158] 5加接头：往上述10μL样本中加入1μL RAP，室温反应5‑10min。

[0159] 八、按照标准纳米孔测序上机流程上机测序。

[0160] 实施例3试剂盒的制备

[0161] 根据实施例2确定的流程体系，我们将本方案组装成如下表所示的2个文库制备试剂盒，鉴于试剂盒的保存温度差异，因此将其制备成两个包装的试剂盒，分别需要保存在‑
20℃±5℃和2～8℃条件下。

[0162] 试剂盒一包含如下组分(‑20℃±5℃保存)：

[0163]

[0164]

[0165] 试剂盒二包含如下组分(2～8℃保存)：

[0166]

[0167] 实施例4临床样本检测——与SQK‑PBK004比较

[0168] 基于实施例3本发明试剂盒，本发明利用6例临床痰液核酸样本，分别用PCR条码试剂盒(SQK‑PBK004)原流程和实施例2的现流程分别建库上机，进行不同维度比较。

[0169] 首先，如下表原流程和现流程建库时间比较所示，通过优化后，建库各步骤时间大部分都有所减少，整体流程的时间缩短3小时，可极大地满足临床对于感染检测产品快速的
要求。

[0170]   现流程(min) 原流程(min)末端修复 25 53
连接 58 73
PCR 54 191
混库上机 93 93
总时长 230 410

[0171] 进一步地，通过上机测序，本发明分析了每例样本测序数据中，按照Reads质量和Reads长度两方面的质控过滤的比例，以及最终比对到微生物，可用于物种鉴定的Reads比
例。如下表和附图1和2所示，现流程无论是在数据质量和Reads长度两方面都有显著优势，
尤其是在Reads长度方面。而原流程的Reads长度普遍较短，被大量过滤。因而，最终可用的
微生物Reads比例现流程在6例样本上都高于原流程。这不但可以压缩测序时间节约测序成
本，还可以提高流程的灵敏度，对于物种鉴定和耐药分析的可信度都大大增加。

[0172]

[0173] 实施例5：临床样本检测——与SQK‑RPB004比较

[0174] 为进一步评价本发明试剂盒的优势，本实施例比较了本发明试剂盒和ONT另一个建库试剂盒SQK‑RPB004的效果。从官方给出的流程上，SQK‑PBK004的建库最低起始量是
100ng，而SQK‑RPB004试剂盒是1ng，为了比较本发明建库试剂盒和SQK‑RPB004试剂盒对于
低起始量的样本的建库成功率，本发明设计了以下实验。

[0175] 本发明将同一份临床肺泡灌洗液样本提取的核酸进行梯度稀释，取不同的建库起始量平行进行SQK‑PBK004和SQK‑RPB004试剂盒的建库上机测序，如下表所示，最终比对到
微生物基因组上的Reads比例，用现流程建库都维持在了20％以上，即使在极低(8pg)的建
库起始量，也说明了，现流程是可以满足去宿主样本及珍贵的临床样本核酸提取浓度低的
情况的。而同样起始量的SQK‑RPB004建库上机数据，最终比对到微生物的Reads比例相对同
样建库起始量的SQK‑PBK004流程都很低，而且整体的比对reads数跟建库起始量不成梯度，
说明整个流程的稳定度较差。并且，从病原检出上，SQK‑PBK004流程检出的Reads数也更多，
增加了检出和耐药的可信度。综上，优化后的SQK‑PBK004流程(即本发明试剂盒)，对于极低
的建库起始量的样本都可以成功建库，检出感染病原，为去宿主样本及珍贵的临床样本等
痕量核酸测序检测提供可能性。

[0176]

[0177]

[0178] 以上对本申请具体实施方式的描述并不限制本申请，本领域技术人员可以根据本申请作出各种改变或变形，只要不脱离本申请的精神，均应属于本申请所附权利要求的范
围。