miR-132-5p在制备神经再生药物或材料中的应用

摘要

本发明公开了非编码RNA(miR‑132‑5P)在周围神经再生过程中的应用，可通过抑制miR‑132‑5P的表达促进周围伸进再生。本发明通过基因工程技术对大鼠miR‑132‑5p分别进行敲降和过表达，结果显示miR‑132‑5P被抑制后，神经元的轴突生长速度加快，神经修复的时间缩短，神经功能恢复显著。

权利要求

1.miR‑132‑5p抑制剂在制备坐骨神经再生药物或材料中的应用，以 miR‑132‑5p为靶点，设计或筛选具有抑制 miR‑132‑5p 表达作用的活性物质，所述 miR‑132‑5p核苷酸序列如SEQ ID NO :1 所示，所述活性物质为 miR‑132‑5p的反义核酸或者含有miR‑132‑5p 反义核酸的表达载体。

2.如权利要求 1所述的应用，其特征在于将所述活性物质用于制备组织工程神经材料。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述miR‑132‑5p的反义核酸的核苷酸序列如 SEQ ID NO :2 所示。

4.如权利要求 1所述的应用，其特征在于所述载体选自质粒、病毒、细胞中的一种或几种。

说明书

miR‑132‑5p在制备神经再生药物或材料中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域。具体地，涉及miR‑132‑5p在制备神经再生药物或材料中的应用。

背景技术

[0002] 交通事故，自然灾害，各类工伤等意外的发生会导致不同类型的周围神经损伤。据统计，在我国每年新增的神经损伤病例近100万例,其中神经缺损病况约30万例。神经缺损
会导致面瘫，垂腕等肢体残疾，造成严重的社会负担。

[0003] 目前，主要的采取的治疗手段是自体神经移植和同种异体神经移植。自体神经移植(是治疗神经缺损的“金标准”)，又被称为“拆东墙补西墙”电缆式移植，这会导致供区部
位功能丧失，且可供移植的部位极少。同种异体神经移植，需要等待人体捐献的神经，通过
脱细胞技术才能制备出神经移植物，显然，相对于庞大的患者数量这只是杯水车薪。神经缺
损依然是困扰人类的世界难题，解决这一难题，迫在眉睫。

[0004] 近年来，基于生命科学和工程学的原理和技术发展起来的组织工程学为构建神经移替代品开辟了新的道路。早期，组织工程技术修复神经损伤的研究主要集中在设计和构
建新的组织工程神经桥接装置；而现在的研究更倾向于制备带有神经生长因子或负载
miRNA，LncRNA等功能性核酸的神经移植物。MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一
类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20～25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较
长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合
体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶
mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、
病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等，具有非常重要的生理功
能。

[0005] 目前，还没有关于miR‑132‑5p与神经再生之间关联的研究。

发明内容

[0006] 本发明首次报道了miR‑132‑5p与周围神经再生之间的关系，可通过下调miR‑132‑5p表达来治疗周围神经损伤。

[0007] 本发明具体技术方案如下：

[0008] miR‑132‑5p在制备神经再生药物或材料中的应用，miR‑132‑5p在人和大鼠间高度保守，本发明所述miR‑132‑5p(http://www.mirbase.org/textsearch.shtml？q＝miR‑132‑
5p&submit＝submit)核苷酸序列为5’‑accguggcuuucgauuguuacugugggaaccggagguaacagu
cuacagccauggucg‑3’(SEQ ID NO:1)所示。

[0009] 本发明所述的神经为周围神经，可选自坐骨神经、臂丛神经、桡神经、腋神经、肌皮神经、正中神经、尺神经、股神经、腓总神经。

[0010] 本发明所述的应用，可以以miR‑132‑5p为靶点，设计或筛选具有下调miR‑132‑5p表达作用的活性物质。所述活性物质为蛋白、核酸或者化合物等。进一步的，可以将所述活
性物质用于制备组织工程神经材料。通过包埋、吸附、三维打印等方式将物质活性物质与生
物材料制成含有活性物质的组织工程神经移植物。

[0011] 本发明另一目的在于提供一种miR‑132‑5p抑制剂，为miR‑132‑5p的反义核酸或者含有miR‑132‑5p的表达载体。

[0012] 优选的，miR‑132‑5p的反义核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述载体选自质粒、病毒、细胞中的一种或几种。

[0013] 本发明另一目的在于提供一种神经再生药物或材料，含有下调miR‑132‑5p表达作用的活性物质，优选为本发明所述的miR‑132‑5p抑制剂。

[0014] 优选的，所述的药物为液体剂型，优选地为注射剂。

[0015] 一个优选例中，所述的药物的施用方法包括直接注射miR‑132‑5p抑制剂。

[0016] 本发明构建了miR‑132‑5p的模拟物(mimic)，抑制物(inhibitor)及其阴性对照的质粒，分别将这些质粒转染进大鼠背根神经节植块中，实验结果表明，通过抑制miR‑132‑5p
可以促进轴突生长速度。进一步的，本发明将miR‑132‑5p抑制剂转染进缺损的大鼠坐骨神
经中，结果表明，大鼠坐骨神经中的miR‑132‑5p被抑制后，其再生的速度明显加快，神经再
生能力显著增强。

附图说明

[0017] 图1为miR‑132‑5p的模拟物(mimic)，抑制物(inhibitor)及其阴性对照的质粒处理施万细胞后的细胞免疫荧光结果。

[0018] 图2为miR‑132‑5p的模拟物(mimic)，抑制物(inhibitor)及其阴性对照的质粒处理施万细胞后轴突长度。

[0019] 图3为miR‑132‑5p抑制物(inhibitor)质粒转染缺损的大鼠坐骨神经的组织免疫荧光结果。

具体实施方式

[0020] 以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

[0021] 在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

[0022] 下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

[0023] 在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

[0024] 下面结合具体实施例对本发明进一步说明。

[0025] 本发明的目的在于提供一种通过抑制miR‑132‑5p从而促进周围再生过程中的应用。

[0026] 实施例1

[0027] 1.构建miR‑132‑5p模拟物和抑制物

[0028] 本实验miR‑132‑5p模拟物和抑制物的构建，购买锐博公司micrONTM miRNA系列试剂盒，向公司提供miR‑132‑5p的成熟序列，合成相应片段。

[0029] mir‑132‑5p抑制物：5’‑aguaacaaucgaaagccacggu‑3’(SEQ ID NO:2)。

[0030] 抑制物对照：5’‑caguacuuuuguguaguacaaa‑3’(SEQ ID NO:3)。

[0031] mir‑132‑5p模拟物：5’‑accguggcuuucgauuguuacu‑3’(SEQ ID NO:4)。

[0032] 模拟物对照：5’‑uuuguacuacacaaaaguacug‑3’(SEQ ID NO:5)。

[0033] 2.原代背根神经节(DRG)植块培养与纯化及miR‑132‑5p处理

[0034] 孕14‑15d的SD大鼠，在通风橱内用乙醚将孕鼠麻醉后备皮。用75％的乙醇消毒，在无菌条件下取出胚鼠，置于含有PS的解剖液中，在解剖镜下取出胚鼠的背根神经节放于玻
片上。用含有Glutamine(2mmol/L)、Nerve growth factor(NGF，50ng/mL)和2％B27的
Neurobasal培养基均匀的接种在预先用L‑多聚赖氨酸包被的培养板中，置于5％CO2，37℃
培养箱中。24h后换含有U(10μmol/L)、5‑FU(10μmol/L)、Glutamine(2mmol/L)、2％B27、10μM
阿糖胞苷和NGF(50ng/mL)的Neurobasal培养基培养2d。后换含有Glutamine(2mmol/L)、2％
B27和NGF(50ng/mL)的Neurobasal培养基培养2d，重复前面步骤2‑3次，即可得到较纯的背
根节植块。通过使用华粤行NEPA21仪器，根据说明书分别将miR‑132‑5p的模拟物和抑制物
以及相应对照电转入DRG植块中。培养相应时间，弃去培养基，用0.01M PBS轻轻洗涤两次，
加入4％的多聚甲醛，室温下固定1h。弃去固定液，用PBS洗涤三次，每次10min。加入封闭液
进行封闭，室温下封闭1h。弃去封闭液，加入一抗(anti‑mouse NF‑200antibody,1:200)在4
℃孵育过夜。用PBS洗涤3次，每次洗涤10min，加入二抗(anti‑mouse‑Alexa Fluor 488Ig 
G，1:200)在4℃中避光孵育过夜。最后加入免疫荧光封片液封片，在荧光显微镜下进行拍照
观察。

[0035] 结果如图1和2所示。结果显示，miR‑132‑5p模拟物组轴突长度为992.743±200.5448μm，对照组轴突长度可达到1142.625±200.713μm；而miR‑132‑5p抑制物组轴突长
度最长，轴突长度为1329.068±176.8μm；对照组轴突长度为1153.068±201.9814μm。miR‑
132‑5p模拟物减少了DRG的神经突延伸。相反，miR‑132‑5p抑制物促进神经突延伸。以上数
* **
据表明miR‑132‑5p模拟物抑制轴突生长，其抑制物促进轴突生长。P≤0.05；P≤0.01。

[0036] 3.大鼠10mm缺损模型制备及miR‑132‑5p处理

[0037] (1)术前准备：手术室、手术器械以及其它用品均按常规方法消毒备用，称重大鼠并随机分组。

[0038] (2)制备坐骨神经缺损模型：腹腔注射复合麻醉剂(30mg/kg)。麻醉后，将大鼠左大腿股部手术区域备皮，按照常规进行消毒，沿坐骨神经位置做纵行切口，从坐骨切迹钝性分
离股二头肌直至暴露出坐骨神经，切下坐骨神经中约10mm长的组织。之后用填充硅胶管桥
接坐骨缺损，向硅胶管内注入5nmol miR‑132‑5p抑制物。术后常规缝合伤口。所有的大鼠均
按照常规饲养。

[0039] (3)一般情况观察：术后每天观察大鼠的伤口愈合情况及精神状态。

[0040] 组织免疫荧光：

[0041] (1)术后不同时间点，用复合麻醉剂麻醉大鼠，将胸腔打开，暴露心脏，将针尖刺入左心室，剪破右心耳后先用生理盐水灌注，直至肝脏的颜色变浅，而且肠系膜血管内的液体
由红色变浅逐渐接近无色，随后再注入适量的4％多聚甲醛溶液。取下硅胶管，浸入4％多聚
甲醛溶液中，24h后用蔗糖溶液梯度脱水处理。取出组织进行冰冻切片，组织切片的厚度为
10μm，切片组织于37℃中烘干后置于4℃冰箱中备用。

[0042] (2)用PBS将组织切片洗涤3次，每次洗涤10min，加入封闭液进行封闭，室温封闭1h。加入一抗(anti‑mouse NF‑200antibody,1:200)在4℃孵育过夜。

[0043] (3)用PBS洗涤3次，每次洗涤10min，加入二抗(anti‑mouse Alexa Fluor 488IgG，1:200)在4℃中孵育过夜。

[0044] (4)最后用PBS洗涤3次，每次洗涤10min，加入免疫荧光封片液封片，在荧光显微镜下进行拍照观察。结果如图3所示，结果相较于对照组，miR‑132‑5p抑制物组神经生长延伸
有显著提高，新生神经已经实现端与端连接。表明miR‑132‑5p抑制物可以促进大鼠坐骨神
经再生。