一种多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂及其制备方法和应用

摘要

一种多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂及其制备方法和应用，本发明属抗菌纳米技术领域，涉及一种抗菌剂及其制备方法和应用。本发明的目的是要解决现有纳米抗菌剂由于对细菌生物膜的低渗透性造成抗菌效果不佳和副作用大的问题。一种多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂在酸性条件下释放Cu2+和H2O2，发生芬顿反应产生具有催化活性的·OH，在中性或碱性条件下不释放Cu2+和H2O2。方法：一、制备葡聚糖/CuCl2溶液；二、加入NaOH溶液和H2O2溶液，搅拌反应；三、离心清洗。一种多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂在酸性条件下释放具有催化活性的·OH，用于杀灭细菌、抑制细菌生物膜的形成和去除已形成的生物膜。

权利要求

1.一种多糖基纳米点聚集体在制备自催化抗菌剂中的应用，其特征在于所述自催化抗菌剂的制备方法是按以下步骤完成的：一、将0.5g葡聚糖加入到5mL 浓度为0.01mol/L 的CuCl2溶液中，再搅拌至葡聚糖完全溶解，得到葡聚糖/CuCl2溶液；

步骤一中所述的葡聚糖的分子量为20000 kDa；

二、向葡聚糖/CuCl2溶液中加入5mL浓度为0.01mol/L 的NaOH溶液，再加入100μL质量分数为30%的 H2O2溶液，磁力搅拌30min，得到含有葡聚糖修饰的铜过氧化物纳米点聚集体溶液；

三、以无水乙醇为清洗剂，将含有葡聚糖修饰的铜过氧化物纳米点聚集体溶液进行离心清洗3次，每次离心清洗的速度为8000r/min，每次离心清洗的时间为5min，得到自催化抗菌剂。

说明书

一种多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂及其制备方法和

应用

技术领域

[0001] 本发明属抗菌纳米技术领域，涉及一种抗菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 全球每年约有70万的患者因致病菌感染而死亡，这使得致病性细菌感染成为全球第二大死亡原因，并引起了健康领域的广泛关注。其中，生物膜的形成在绝大多数细菌感染
疾病中占重要地位。生物膜是一种复杂的多细胞聚集体，其中微生物细胞嵌入细胞外聚合
物的自生基质中，包括蛋白质，多糖，细胞外核酸(eDNA)和细胞碎片，通常存在于组织表面
以及医疗设备，例如导管，起搏器和人工关节，从而引起慢性感染。生物膜的特殊结构为内
部的细菌提供了保护屏障，因为它不仅可以保护生物膜内细菌免受宿主先天免疫细胞的攻
击，而且还可以避免抗菌剂的渗透和后续作用。由于生物膜的阻碍，普通的抗菌剂难以达到
预期的抗菌效果，既增加了医疗负担，同时也增加了经济负担。

[0003] 近年来，纳米颗粒的芬顿反应因其被视为最有效的高级氧化过程之一，并且具有很高的广谱抗菌活性，而在细菌感染治疗中的应用引起了广泛的兴趣。在芬顿反应过程中，
2+ 2+ 2+
Fe ，Cu 和Mn 等二价金属离子与过氧化氢(H2O2)反应，其产物·OH具有出色的氧化能力，
进而对细菌产生非选择性攻击脂质过氧化和细菌膜完整性破坏。然而生物膜特殊的屏障作
用使得·OH无法发挥其最大作用，如果依靠增加抗菌剂使用量而提高抗菌和抗生物膜效
果，又会对周围的正常的细胞组织产生副作用。因此，急迫需要开发高效、低毒、低成本的纳
米抗菌剂来应用于治疗顽固的细菌生物膜感染。

发明内容

[0004] 本发明的目的是要解决现有纳米抗菌剂由于对细菌生物膜的低渗透性造成抗菌效果不佳和副作用大的问题，而提供一种pH响应的葡聚糖修饰的铜过氧化物纳米点聚集体
抗菌剂及其制备方法和应用。

[0005] 一种多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂在酸性条件下释放Cu2+和H2O2，发生芬2+
顿反应产生具有催化活性的·OH，在中性或碱性条件下不释放Cu 和H2O2；所述的多糖基纳
米点聚集体的自催化抗菌剂由CuCl2、H2O2、NaOH和葡聚糖为原料制备而成。

[0006] 进一步的，所述的酸性条件的pH值为5.6；

[0007] 进一步的，所述的CuCl2与NaOH的摩尔比为1:1。

[0008] 一种多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂的制备方法，是按以下步骤完成的：

[0009] 一、将葡聚糖加入到CuCl2溶液中，再搅拌至葡聚糖完全溶解，得到葡聚糖/CuCl2溶液；

[0010] 二、向葡聚糖/CuCl2溶液中加入NaOH溶液，再加入H2O2溶液，搅拌反应，得到含有葡聚糖修饰的铜过氧化物纳米点聚集体溶液；

[0011] 步骤二中所述的葡聚糖/CuCl2溶液中的CuCl2与NaOH溶液中的NaOH的摩尔比为1:1；

[0012] 三、以无水乙醇为清洗剂，将含有葡聚糖修饰的铜过氧化物纳米点聚集体溶液进行离心清洗，得到多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂溶液。

[0013] 进一步的，步骤一中所述的葡聚糖的质量与CuCl2溶液的体积比为(0.2g～0.8g):5mL；

[0014] 进一步的，步骤一中所述的葡聚糖的质量与CuCl2溶液的体积比为0.5g:5mL；

[0015] 进一步的，步骤一中所述的CuCl2溶液的浓度为0.005mol/L～0.015mol/L。

[0016] 进一步的，步骤一中所述的CuCl2溶液的浓度为0.01mol/L。

[0017] 进一步的，步骤二中所述的NaOH溶液的浓度为0.005mol/L～0.015mol/L；

[0018] 进一步的，步骤一中所述的CuCl2溶液的浓度为0.01mol/L；

[0019] 进一步的，步骤二中所述的H2O2溶液的质量分数为28％～30％；

[0020] 进一步的，步骤二中所述的NaOH溶液与H2O2溶液的体积比为5mL:(80μL～120μL)；

[0021] 进一步的，步骤二中所述的NaOH溶液与H2O2溶液的体积比为5mL:100μL；

[0022] 进一步的，步骤二中所述的搅拌反应的时间为30min。

[0023] 进一步的，步骤一中所述的葡聚糖的分子量为20000kDa。

[0024] 进一步的，步骤三中所述的离心清洗的次数为3次～5次，每次离心清洗的速度为8000r/min，每次离心清洗的时间为5min。

[0025] 进一步的，一种多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂在酸性条件下释放具有催化活性的·OH，用于杀灭细菌、抑制细菌生物膜的形成和去除已形成的生物膜。

[0026] 进一步的，所述的细菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。

[0027] 进一步的，所述的革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌时，多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂的浓度为0.4μg/mL，对金黄色葡萄球菌的杀菌率为98％；所述的革兰氏阴性菌
为鼠伤寒沙门氏菌时，多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂的浓度为4μg/mL，对鼠伤寒沙
门氏菌的杀菌率为72％。

[0028] 本发明的原理：

[0029] 本发明制备了一种酸诱导的H2O2自供给葡聚糖包覆的过氧化铜纳米点聚集体(以2+
下称为DCPNAs)。在与生物膜微环境相符合的酸性环境下，DCPNAs可以分解为Cu 和H2O2，随
2+
后触发Cu 与H2O2之间的芬顿反应，产生·OH破坏细菌和生物膜。葡聚糖的引入不仅有利于
渗透到生物膜中，而且还改善了DCPND的生物相容性。此外，自给自足的H2O2将规避吸附性
2+
H2O2对正常细胞的副作用，并且在与健康组织相符的中性环境中，DCPNAs几乎不会释放Cu
和H2O2，故酸性诱导的机制还可以减轻对周围健康组织的损害。

[0030] 采用本发明的技术方案，具有以下有益效果：

[0031] (1)、本发明合成方法简单，通过一步合成pH响应的葡聚糖修饰的铜过氧化物纳米点聚集体抗菌剂，操作简便，合成时间快，成本低廉；

[0032] (2)、本发明合成的pH响应的葡聚糖修饰的铜过氧化物纳米点聚集体抗菌剂，在酸性环境中可释放强催化活性的·OH，能够催化底物TMB显色；

[0033] (3)、本发明合成的pH响应的葡聚糖修饰的铜过氧化物纳米点聚集体抗菌剂，具有良好的抗菌抗生物膜效果；

[0034] (4)、本发明合成的pH响应的葡聚糖修饰的铜过氧化物纳米点聚集体抗菌剂，其抗菌抗生物膜效果具有广谱性，由于·OH的非选择的细胞毒性，本发明对常见细菌及其生物
膜均可发挥作用；

[0035] (5)、本发明合成的pH响应的葡聚糖修饰的铜过氧化物纳米点聚集体抗菌剂，在酸性环境下可释放H2O2，自行提供H2O2，减少了外加H2O2带来的多余毒性；

[0036] (6)、本发明合成的pH响应的葡聚糖修饰的铜过氧化物纳米点聚集体抗菌剂，具有良好的生物相容性，酸性环境响应的特点降低了本发明合成的材料对健康细胞组织的伤
害；同时，葡聚糖的修饰也提高了材料的生物相容性；

[0037] (7)、在pH值为5.6的条件下，本发明合成的pH响应的葡聚糖修饰的铜过氧化物纳‑1
米点聚集体抗菌剂的浓度仅为0.4μg mL 时，对金黄色葡萄球菌的杀菌率可达98％，浓度为
‑1
4μg mL 时对沙门氏菌的杀菌率可达72％。

[0038] 与传统抗菌剂相比，本发明合成的pH响应的葡聚糖修饰的铜过氧化物纳米点聚集体抗菌剂不仅有良好的抗菌性能，葡聚糖的修饰还增加了材料对细菌生物膜的亲和力，从
而提高了材料的抗生物膜性能。此外，pH可控抗菌的特点减少了材料的毒性，本发明合成方
法简单，合成时间短，成本低，性能良好，生物活性强，抗菌抗生物膜性能好，解决了细菌生
物膜难以去除的问题，方法新颖，具有良好的应用前景。

[0039] 本发明可获得一种pH响应的抗菌剂。

附图说明

[0040] 图1为具体实施方式一制备的多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂溶液抗细菌及其生物膜的原理示意图；

[0041] 图2实施例一步骤三得到的多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂溶液的透射电镜图；

[0042] 图3为不同浓度的DCPNAs溶液的吸光度随时间的变化曲线；

[0043] 图4为环境的pH不同时DCPNAs溶液的吸光度随时间的变化曲线；

[0044] 图5为实施例一步骤三得到的多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂溶液对鼠伤寒沙门氏菌的杀菌效果图；

[0045] 图6为实施例一步骤三得到的多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂溶液对金黄色葡萄球菌的杀菌效果图；

[0046] 图7为实施例一步骤三得到的多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂溶液对鼠伤寒沙门氏菌的生物膜的抑制柱状图；

[0047] 图8为实施例一步骤三得到的多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂溶液对金黄色葡萄球菌生物膜的抑制柱状图；

[0048] 图9为实施例一步骤三得到的多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂溶液对已形成的鼠伤寒沙门氏菌生物膜和金黄色葡萄球菌的生物膜的破坏柱状图；

[0049] 图10为空白组对已形成的鼠伤寒沙门氏菌生物膜的破坏照片图；

[0050] 图11为实施例一步骤三得到的多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂溶液对已形成的鼠伤寒沙门氏菌生物膜的破坏照片图；

[0051] 图12为空白组对已形成的金黄色葡萄球菌生物膜的破坏照片图；

[0052] 图13为实施例一步骤三得到的多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂溶液对已形成的金黄色葡萄球菌生物膜的破坏照片图。

具体实施方式

[0053] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范
围。

[0054] 具体实施方式一：结合图1说明本实施方式，本实施方式是一种多糖基纳米点聚集2+
体的自催化抗菌剂在酸性条件下释放Cu 和H2O2，发生芬顿反应产生具有催化活性的·OH，
2+
在中性或碱性条件下不释放Cu 和H2O2；所述的多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂由
CuCl2、H2O2、NaOH和葡聚糖为原料制备而成。

[0055] 具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同点是：所述的酸性条件的pH值为5.6；所述的CuCl2与NaOH的摩尔比为1:1。其它步骤与具体实施方式一相同。

[0056] 具体实施方式三：本实施方式是一种多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂的制备方法是按以下步骤完成的：

[0057] 一、将葡聚糖加入到CuCl2溶液中，再搅拌至葡聚糖完全溶解，得到葡聚糖/CuCl2溶液；

[0058] 二、向葡聚糖/CuCl2溶液中加入NaOH溶液，再加入H2O2溶液，搅拌反应，得到含有葡聚糖修饰的铜过氧化物纳米点聚集体溶液；

[0059] 步骤二中所述的葡聚糖/CuCl2溶液中的CuCl2与NaOH溶液中的NaOH的摩尔比为1:1；

[0060] 三、以无水乙醇为清洗剂，将含有葡聚糖修饰的铜过氧化物纳米点聚集体溶液进行离心清洗，得到多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂溶液。

[0061] 具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三的不同点是：步骤一中所述的葡聚糖的质量与CuCl2溶液的体积比为(0.2g～0.8g):5mL；步骤一中所述的CuCl2溶液的浓度
为0.005mol/L～0.015mol/L。其它步骤与具体实施方式三相同。

[0062] 具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式三至四之一不同点是：步骤二中所述的NaOH溶液的浓度为0.005mol/L～0.015mol/L；步骤二中所述的H2O2溶液的质量分数为
28％～30％；步骤二中所述的NaOH溶液与H2O2溶液的体积比为5mL:(80μL～120μL)；步骤二
中所述的搅拌反应的时间为30min。其它步骤与具体实施方式三至四相同。

[0063] 具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式三至五之一不同点是：步骤一中所述的葡聚糖的分子量为20000kDa。其它步骤与具体实施方式三至五相同。

[0064] 具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式三至六之一不同点是：步骤三中所述的离心清洗的次数为3次～5次，每次离心清洗的速度为8000r/min，每次离心清洗的时间
为5min。其它步骤与具体实施方式三至六相同。

[0065] 具体实施方式八：本实施方式是一种多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂在酸性条件下释放具有催化活性的·OH，用于杀灭细菌、抑制细菌生物膜的形成和去除已形成的
生物膜。

[0066] 具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式八的不同点是：所述的细菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。其它步骤与具体实施方式八相同。

[0067] 具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式八至九之一不同点是：所述的革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌时，多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂的浓度为0.4μg/mL，
对金黄色葡萄球菌的杀菌率为98％；所述的革兰氏阴性菌为鼠伤寒沙门氏菌时，多糖基纳
米点聚集体的自催化抗菌剂的浓度为4μg/mL，对鼠伤寒沙门氏菌的杀菌率为72％。其它步
骤与具体实施方式八至九相同。

[0068] 下面结合附图和实施例对本发明进行详细的说明。

[0069] 实施例1：一种多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂的制备方法，是按以下步骤完成的：

[0070] 一、将0.5g葡聚糖加入到5mL浓度为0.01mol/L的CuCl2溶液中，再搅拌至葡聚糖完全溶解，得到葡聚糖/CuCl2溶液；

[0071] 步骤一中所述的葡聚糖的分子量为20000kDa；

[0072] 二、向葡聚糖/CuCl2溶液中加入5mL浓度为0.01mol/L的NaOH溶液，再加入100μL质量分数为30％的H2O2溶液，磁力搅拌30min，得到含有葡聚糖修饰的铜过氧化物纳米点聚集
体溶液；

[0073] 三、以无水乙醇为清洗剂，将含有葡聚糖修饰的铜过氧化物纳米点聚集体溶液进行离心清洗3次，每次离心清洗的速度为8000r/min，每次离心清洗的时间为5min，得到多糖
基纳米点聚集体的自催化抗菌剂(DCPNAs)。

[0074] 实施例一步骤三得到的多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂溶液的浓度用火焰‑1
原子吸收光谱法测定，以铜元素浓度记为98μg mL 。

[0075] 图2实施例一步骤三得到的多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂溶液的透射电镜图；

[0076] 从图2中可以看出，铜过氧化物纳米点的粒径约为10nm，葡聚糖将纳米点包裹，形成100nm左右的聚集体。

[0077] 实施例2：实施例一步骤三得到的多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂溶液(DCPNAs)的催化性能测定：

[0078] 将实施例一步骤三得到的多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂溶液(DCPNAs)制备成不同的材料溶液，溶剂为无菌水；5组材料溶液中DCPNAs的浓度依次为0μg/mL，0.125μ
g/mL，0.25μg/mL，0.5μg/mL和1μg/mL。向每组材料溶液中分别加入10μL浓度为20mmol/L的
TMB溶液，在半小时内使用酶标仪测定每分钟每孔中反应体系在625nm处的吸光度，见图3所
示；

[0079] 图3为不同浓度的DCPNAs溶液的吸光度随时间的变化曲线；

[0080] 从图3可知，吸光度与时间呈正相关，随着DCPNAs浓度的增加，其催化活性得到提高。

[0081] 取7组体积相同且DCPNAs的浓度分别为0、0.125、0.25和0.5μg/mL的材料溶液，分别向7组DCPNAs的浓度为0、0.125、0.25和0.5μg/mL的材料溶液中加入180μL pH不同的缓冲
溶液，使7组材料溶液的pH值分别为4.5、4.5、5.0、5.6、6.5、7.4和8.0，在半小时内使用酶标
仪测定每分钟每孔中反应体系在625nm处的吸光度，见图4所示；

[0082] 图4为环境的pH不同时DCPNAs溶液的吸光度随时间的变化曲线；

[0083] 从图4可知，当环境的pH值为5.6时，材料表现出最佳的催化活性，这远优于中性或碱性环境，因此表明酸性环境确实是DCPNAs生成·OH的关键因素。

[0084] 实施例3：细菌培养及其菌悬液的制备：

[0085] ①、细菌培养：

[0086] 在本发明中，革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌(ATCC25923)和革兰氏阴性细菌鼠伤寒沙门氏菌(S8xc001a)被选作具有生物膜形成能力的模型细菌，以评估材料的抗菌和抗
生物膜性能。首先，采用平板划线技术将细菌在LB琼脂平板上，放入37℃的培养箱过夜培
养，然后在培养好的平板上挑出金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌的单个菌落，然后分别
接种在50mL LB肉汤中，并于37℃振荡温育12小时。

[0087] ②、菌悬液的制备：从上一步培养好两种细菌的肉汤中各移取30mL至无菌离心管中，在6000rpm、4℃条件下离心5min，弃去上清的肉汤，加入相同体积的PBS缓冲液(1×)后
重悬，再次离心，重复洗涤3次，最后用PBS缓冲液稀释已经洗涤的菌悬液，使得其在600nm处
的吸光值为0.5，制备好的菌悬液存放至4℃环境，备用。

[0088] 实施例4：实施例一步骤三得到的多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂溶液(DCPNAs)的抗菌性能测定：

[0089] 采用平板菌落计数法用于评估本材料在不同pH环境下的抗菌活性；将100μL细菌5
悬浮液(10CFU/mL)加入890μL pH分别为5.6、6.5和7.4的PBS缓冲液中形成菌悬液；然后加
入10μL不同浓度的DCPNAs溶液，最终革兰氏阳性菌杀菌体系中DCPNAs的浓度分别为0.1、
0.2、0.3和0.4μg/mL，革兰氏阳性菌杀菌体系中DCPNAs的浓度分别为1、2、3和4μg/mL；空白
组中用相应pH的缓冲液代替材料溶液。在37℃下振荡孵育30分钟，然后采用平板涂布法将
菌悬液涂布于LB琼脂平板上，37℃下培养24小时，培养完成后菌落计数计算细菌存活率，见
图5和图6所示；

[0090] 图5为实施例一步骤三得到的多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂溶液对鼠伤寒沙门氏菌的杀菌效果图；

[0091] 图6为实施例一步骤三得到的多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂溶液对金黄色葡萄球菌的杀菌效果图；

[0092] 从图5和图6可知，鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球的存活率均随着材料浓度的增加而降低。同时结果表明DCPNAs具有优异的抗菌活性。此外，值得注意的是，图5和图6的结
果说明鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的存活百分比随环境pH值的降低而降低。浓度为
‑1
4μg mL DCPNAs在pH 5.6下处理的鼠伤寒沙门氏菌的存活率低至20％，而在pH 7.4下存活
率为75.5％，表明DCPNAs的pH依赖性抗菌活性。图6中金黄色葡萄球菌杀菌效果与图5中鼠
‑1
伤寒沙门氏菌杀菌效果pH响应性相似，浓度为0.4μg mL DCPNAs在pH 5.6下处理的鼠伤寒
沙门氏菌的存活率低至2％。

[0093] 实施例5：实施例一步骤三得到的多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂溶液的抗生物膜性能测定：

[0094] (1)、采用结晶紫染色测定法用于评估抑制生物膜形成的能力：

[0095] 将80μL pH分别为5.6、6.5及7.4的三组胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)加入到无菌的968
孔细胞培养板的各孔中，每组加两列。然后将10μL菌悬液(10CFU/mL)加入到各组肉汤中；
接着，将10μL材料溶液加入各组的其中一列，浓度为9.8μg/mL；空白组用等体积的相应TSB
肉汤代替材料溶液，加入每组的另一列。然后在37℃下孵育24h，以获得成熟的生物膜；用无
菌盐水漂洗，干燥20分钟，将100μL结晶紫溶液(0.1％，w/v)添加到每个孔中以染色5分钟；
用无菌水冲洗以除去多余的染料后，将孔中染色的生物膜溶解在乙酸溶液(33％，v/v)中，
最后使用酶标仪在592nm处检测吸光度，用该吸光度代表生物膜质量，见图7所示；

[0096] 图7为实施例一步骤三得到的多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂溶液对鼠伤寒沙门氏菌的生物膜的抑制柱状图；

[0097] 图8为实施例一步骤三得到的多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂溶液对金黄色葡萄球菌生物膜的抑制柱状图；

[0098] 结果：如图7所示，对照组中鼠伤寒沙门氏菌的生物膜质量为1.8左右，表明生物膜成功形成。与DCPNAs在pH7.4下孵育后，生物膜质量与对照组相似，这表明材料不能抑制
pH7.4下生物膜的形成。而DCPNAs在pH6.5下孵育后观察到轻微的生物膜抑制作用。与之形
成鲜明对比的是，pH 5.6实验组的生物膜质量比对照组要少得多，这表明本发明合成的
DCPNAs具有优异的酸诱导的抗生物膜性能，可抑制鼠伤寒沙门氏菌形成生物膜。

[0099] 如图8所示，DCPNAs对金黄色葡萄球菌生物膜形成抑制作用效果与图7中其对沙门氏菌的效果相同，在酸性条件(pH 5.6)下有明显的抑制作用。

[0100] (2)、采用MTT染色法测定以评估材料对生物膜的破坏作用：

[0101] 根据上一步培养生物膜的方法，不加实施例一步骤三得到的多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂溶液培养出成形的生物膜；将培养好的的生物膜用无菌盐水轻轻冲洗，然
后加入10μLDCPNAs溶液和90μL无菌生理盐水，材料浓度为9.8μg/m，置于37℃孵育24小时。
空白组用等体积的无菌生理盐水代替材料溶液。用无菌水洗涤后，将100μL MTT(0.5mg/mL)
溶液添加到每个孔中，并在37℃下孵育3h，然后，进一步添加100μL二甲基亚砜(DMSO)以溶
解蓝紫色沉淀，最后，通过酶标仪在592nm下测量每个孔的吸光度。

[0102] 图9为实施例一步骤三得到的多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂溶液对已形成的鼠伤寒沙门氏菌生物膜和金黄色葡萄球菌的生物膜的破坏柱状图；

[0103] 结果：如图9所示，与DCPNAs孵育后，鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的生物膜质量都有明显下降，证明了本发明中合成的DCPNAs抗菌剂对已形成的生物膜的破坏作用。

[0104] 图10为空白组对已形成的鼠伤寒沙门氏菌生物膜的破坏照片图；

[0105] 图11为实施例一步骤三得到的多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂溶液对已形成的鼠伤寒沙门氏菌生物膜的破坏照片图；

[0106] 图12为空白组对已形成的金黄色葡萄球菌生物膜的破坏照片图；

[0107] 图13为实施例一步骤三得到的多糖基纳米点聚集体的自催化抗菌剂溶液对已形成的金黄色葡萄球菌生物膜的破坏照片图。

[0108] 从图10～图13中的照片记录了用材料处理的成熟生物膜被破坏的现象，直观地表明了本发明的出色的生物膜清除能力。