一种碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体I42A

摘要

本发明公开了一种碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体I42A，属于蛋白质工程技术领域。本发明对从地衣芽孢杆菌基因组中克隆的CcpA基因进行突变，得到的一种碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体I42A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码其的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明构建了包含编码上述CcpA突变体I42A基因的重组表达载体，并将构建的表达载体转化到地衣芽孢杆菌CcpA基因缺陷株中获得重组地衣芽孢杆菌；所获得的重组地衣芽孢杆菌能够明显改变由于葡萄糖存在而产生的碳分解代谢阻遏现象，能够降低地衣芽孢杆菌对木糖的偏好性。

权利要求

1.一种碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体I42A，其特征在于，所述碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体I42A的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体I42A的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.含权利要求2所述基因的重组表达载体。

4.表达权利要求1所述碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体I42A的重组微生物细胞。

5.根据权利要求4所述的重组微生物细胞，其特征在于，所述重组微生物细胞以地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)为宿主。

6.权利要求1所述的碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体I42A在改善地衣芽孢杆菌对木糖利用偏好性中的应用。

7.权利要求2所述的基因在改善地衣芽孢杆菌对木糖利用偏好性中的应用。

8.权利要求3所述的重组表达载体在改善地衣芽孢杆菌对木糖利用偏好性中的应用。

9.权利要求4‑5任一所述的重组微生物细胞在改善地衣芽孢杆菌对木糖利用偏好性中的应用。

说明书

一种碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体I42A

技术领域

[0001] 本发明属于蛋白质工程领域，涉及一种碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体I42A，还涉及表达该突变体的重组表达载体及重组微生物细胞，进一步涉及该突变体在地衣芽孢杆
菌发酵过程中对当木糖与葡萄糖共存时对木糖利用的影响。

背景技术

[0002] 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是一种革兰氏阳性菌，具有耐热、酶系丰富、产酶量高、生长速率适中、蛋白折叠、全基因组信息公开等优点。与大肠杆菌相比，地
衣芽孢杆菌具有耐热性高、pH耐受性较低、生物量高等优势，因此，不仅广泛地被用于外源
基因的表达宿主，在发酵工业上也具有巨大的潜力。

[0003] 木糖作为一种优质碳源，可以通过木质纤维素水解而得到，随着目前环境与能源的压力，木质纤维素等可再生的碳越来越受到人们的青睐。地衣芽孢杆菌可以利用木糖，但
是其对木糖的利用会受到葡萄糖的抑制。而木质纤维素在水解过程中产生大量木糖的同
时，也会产生大量的葡萄糖。由于碳分解代谢阻遏效应，葡萄糖的存在会抑制地衣芽孢杆菌
对木糖的利用，为了消除葡萄糖存在而产生的碳分解代谢阻遏效应，许多解除或者降低碳
分解代谢阻遏效应的尝试已经在其他的微生物中进行，主要分为两类：一是通过人为构建
代谢途径的方式增加木糖的利用；二是通过对细菌本身的代谢途径进行干预，来构建碳分
解代谢阻遏降低的工程菌。但是通过敲除碳分解代谢调控蛋白CcpA蛋白的方式来抑制碳分
解代谢阻遏，降低葡萄糖对木糖利用的抑制，增加木糖的利用效率，菌体生长会受到明显的
抑制作用，其他的代谢途径也受到明显的影响。因此通过基因敲除构建的工程菌未能投入
商业化生产。

[0004] 因而，目前本领域普遍认为单纯敲除碳分解代谢调控蛋白会导致菌体生长受限，破坏菌体的代谢途径，往往得不到人们预期的结果，随着蛋白质工程的进步，对蛋白的理性
改造越来越受到人们的青睐。因此通过对碳分解代谢调控蛋白的活性位点的定向改造来降
低由于葡萄糖的存在而引起的木糖利用抑制可能是一个有效的手段。

发明内容

[0005] 针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体I42A(Ile42Ala)及其应用。本发明从地衣芽孢杆菌ATCC 9945A基因组中，克隆得到编码
碳分解代谢调控蛋白CcpA蛋白的基因序列，将其编码负责DNA结合结构域的氨基酸进行定
点突变，并在大肠杆菌中进行异源表达与纯化；体外测定CcpA蛋白与调控位点cre位点的结
合能力，初步筛选出与cre位点结合能力有明显差距的CcpA突变体I42A蛋白；将该突变体蛋
白在地衣芽孢杆菌CcpA缺陷株中进行表达，验证该突变体在葡萄糖存在下对木糖利用的影
响，得到一种可以改善地衣芽孢杆菌对木糖利用偏好性的CcpA突变体I42A。

[0006] 本发明的技术方案如下：

[0007] 本发明提供了一种碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体I42A，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0008] 本发明还提供了编码上述碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体I42A的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0009] 本发明还提供了含上述基因的重组表达载体。

[0010] 本发明还提供了表达上述碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体I42A的重组微生物细胞。

[0011] 进一步地，所述重组微生物细胞以地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)为宿主。

[0012] 本发明还提供了上述的碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体I42A在改善地衣芽孢杆菌对木糖利用偏好性中的应用。

[0013] 本发明还提供了上述的基因在改善地衣芽孢杆菌对木糖利用偏好性中的应用。

[0014] 本发明还提供了上述的重组表达载体在改善地衣芽孢杆菌对木糖利用偏好性中的应用。

[0015] 本发明还提供了上述的重组微生物细胞在改善地衣芽孢杆菌对木糖利用偏好性中的应用。

[0016] 本发明的主要思路如下：

[0017] (1)根据蛋白的同源建模预CcpA蛋白的关键氨基酸，对氨基酸进行定点突变；

[0018] (2)将得到的突变体蛋白在大肠杆菌中进行异源表达与纯化；

[0019] (3)在体外对突变体与核酸的结合能力进行筛选；

[0020] (4)将筛选得到的突变体蛋白构建CcpA蛋白重组表达质粒；

[0021] (5)CcpA突变体I42A蛋白体内影响验证，验证其在菌体内对木糖与葡萄糖利用的影响。

[0022] 本发明的有益效果：

[0023] 本发明对从地衣芽孢杆菌中克隆的CcpA基因进行突变，得到的一种碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体I42A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码其的基因核苷酸序列如
SEQ ID NO.1所示。本发明构建了包含编码上述CcpA突变体I42A基因的重组表达载体，并将
构建的表达载体转化到地衣芽孢杆菌CcpA基因缺陷菌株中获得重组地衣芽孢杆菌；所获得
的重组地衣芽孢杆菌能够明显改变由于葡萄糖存在而产生的碳分解代谢阻遏现象，能够降
低地衣芽孢杆菌对木糖的偏好性。

附图说明

[0024] 图1是地衣芽孢杆菌CcpA突变体I42A的定点突变菌落PCR扩增验证产物。泳道1是Marker，泳道2‑8是将CcpA蛋白突变体表达载体后转化至大肠杆菌中后挑取的转化子菌落
PCR验证，目的条带长度1002bp。

[0025] 图2是CcpA突变体I42A蛋白纯化后SDS‑PAGE凝胶验证。泳道1是Marker，泳道2是纯化后的突变体蛋白，蛋白大小36.8kDa。

[0026] 图3是地衣芽孢杆菌CcpA蛋白表达载体。

[0027] 图4是CcpA突变体I42A在CcpA基因缺陷株中的过表达重组质粒。

[0028] 图5是重组菌株I42A‑BL21‑ΔCcpA在木糖葡萄糖混合碳源培的养基中的生长曲线。

[0029] 图6是重组菌I42A‑BL21‑ΔCcpA在以木糖葡萄糖混合碳源的培养基中对木糖与葡萄糖的消耗曲线。

具体实施方式

[0030] 下面结合实施例和附图一步来描述本发明。本发明中使用的地衣芽孢杆菌ATCC 9945A是商用菌株，可通过购买获得。本发明使用的构建表达载体、转化、PCR等手段均为常
规的分子生物学方法。

[0031] (一)培养基：CcpA蛋白突变体体内功能验证培养基为添加了30g/L葡萄糖、30g/L木糖的LB培养基。

[0032] (二)地衣芽孢杆菌CcpA基因缺陷菌株的构建方法

[0033] 从地衣芽孢杆菌基因组上CcpA基因上游299bp处开始选取554bp作为同源臂一，在地衣芽孢杆菌CcpA基因下游991bp处开始选取500bp作为同源臂二，将含有FRT位点的Kan基
因插入至两个同源臂中间，构成CcpA基因的敲除盒，将该敲除盒连接至pNZT1‑Tet粒上，构
建CcpA基因敲除质粒。将该质粒转化至地衣芽孢杆菌中构建含有CcpA基因敲除盒的重组
菌。将该重组菌在30℃下活化培养，将活化培养后的种子液在42℃下培养，将种子液在含
Kan的LB平板上进行培养，挑取单双交换菌株，将得到的单交换菌株在30℃下培养，将培养
后的种子液在37℃下划线培养，挑取双交换菌株，作为地衣芽孢杆菌CcpA基因缺陷菌株。

[0034] (三)高效液相色谱测定培养基中的木糖与葡萄糖的含量的方法

[0035] 地衣芽孢杆菌CcpA突变体I42A过表达菌株在LB培养基中培养活化，之后取1mL菌液接种至250mL摇瓶中并在培养基中添加30g/L葡萄糖、30g/L木糖。每隔3h取样测定培养基
中的碳源的消耗，将培养基在12000rpm下离心5min，将得到的上清取出加入等体积的10％
三氯乙酸去除培养基中的杂质。然后利用氨基柱进行检测，流动相为乙腈与水(3：7)作为流
动相，进行检测。

[0036] 实施例1地衣芽孢杆菌CcpA蛋白的关键氨基酸的选取

[0037] 地衣芽孢杆菌CcpA基因作为一个全局型调控因子主要通过蛋白与核酸位点进行结合，然后发挥其调控功能，CcpA蛋白与核酸结合后其相应的结合部位的亚结构的相对位
置会发生一定的变化，在这一变换过程中起支点作用的氨基酸有可能位于CcpA蛋白亚结构
中α螺旋的两端。同时CcpA蛋白与核酸结合需要蛋白与cre位点的识别，在蛋白与cre位点识
别中其主要作用的氨基酸有可能位于α螺旋的中间，因此我们在选取氨基酸位点时主要分
布在CcpA蛋白α螺旋的两端以及中间。

[0038] 实施例2地衣芽孢杆菌CcpA蛋白表达载体的构建

[0039] 以地衣芽孢杆菌CcpA蛋白基因组为模板，扩增CcpA基因，将得到的基因连接在pET28a载体上，构建地衣芽孢杆菌CcpA蛋白表达载体(图3)。将其转化至大肠杆菌BL21
(DE3)中构建重组菌株。

[0040] 实施例3地衣芽孢杆菌CcpA蛋白定点突变及表达与纯化

[0041] 以实施例2中构建的地衣芽孢杆菌CcpA蛋白表达载体为模板对地衣芽孢杆菌CcpA蛋白进行定点突变。使用的突变引物为：

[0042] I42A‑F(SEQ ID NO.3)：5’aaggtgcttgaagccgccgagcgtcttggctatcgtccaaatgccgtggc3’；

[0043] I42A‑R(SEQ ID NO.4)：3’agccaagacgctcggcggcttcaagcaccttctttctcgtcgtcggcttg5’。

[0044] 将定点突变后的CcpA蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码其的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)在大肠杆菌中进行异源表达与纯化，菌落PCR扩增验证图如图1所
示，SDS‑PAGE凝胶验证图如图2所示，表明突变后的CcpA蛋白成功转化至大肠杆菌中并在大
肠杆菌中成功表达。

[0045] 实施例4突变体蛋白与cre位点结合和能力的测定

[0046] 将实施例3得到的突变体蛋白在体外利用荧光偏振与EMSA测定其与cre位点的结合能力。该结果表明突变体I42A与对照组相比较，对照组与cre位点的结合和能力有明显的
降低。

[0047] 实施例5地衣芽孢杆菌CcpA突变体I42A蛋白的过表达

[0048] 将突变体I42A连接在P43启动子后，与pHY300连接，构建重组表达载体，如图4所示，将重组表达载体在地衣芽孢杆菌CcpA缺陷株中进行表达，得到重组表达CcpA蛋白突变
体的菌株I42A‑BL21‑ΔCcpA。

[0049] 实施例6 CcpA突变体I42A蛋白对地衣芽孢杆菌对木糖及葡萄糖利用的影响

[0050] 将实施例5得到的重组表达CcpA蛋白突变体的菌株I42A‑BL21‑ΔCcpA在以木糖与葡萄糖混合碳源的培养基(添加了30g/L葡萄糖、30g/L木糖的LB培养基)中以250rpm，37℃
的条件下进行培养。取样利用高效液相色谱测定培养基中的木糖与葡萄糖的含量。结果如
图5和图6所示，培养21h后，木糖残糖量从28.9g/L下降至22.9g/L。此时培养基中葡萄糖含
量依然保持在14.6g/L。表达突变体蛋白的重组菌株I42A‑BL21‑ΔCcpA较对照组生长无明
显差别，但是其在葡萄糖存在的情况下对木糖的利用有明显的提高。

[0051] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范
围应该以权利要求书所界定的为准。