一种用于研究HIV感染者免疫衰老机制的系统转让专利
申请号 : CN202010972056.9
文献号 : CN112063699B
文献日 : 2021-06-18
发明人 : 郭悦 , 张燕琳 , 李姗珊
申请人 : 成都市疾病预防控制中心
摘要 :
权利要求 :
1.一种用于研究HIV感染者免疫衰老机制的系统,其特征在于,包括:样本采集单元,用于获取HIV感染者的全血样本和血浆样本,所述HIV感染者是指已通过治疗降低了体内HIV RNA病毒载量的HIV感染患者;
第一检测单元,用于检测全血样本中的HIV‑1 DNA病毒库的含量,得到HIV‑1 DNA检测数据;
第二检测单元,用于检测与免疫衰老相关的T淋巴细胞亚群的含量,得到T淋巴细胞亚群检测数据;所述第二检测单元利用流式细胞术检测全血样本中与免疫衰老相关的T淋巴细胞亚群占CD4+T淋巴细胞的百分比和/或与免疫衰老相关的T淋巴细胞亚群占CD8+T淋巴细胞的百分比;所述与免疫衰老相关的T淋巴细胞亚群包括初始T淋巴细胞、中心记忆T淋巴细胞、效应记忆T淋巴细胞、活化T淋巴细胞、衰老T淋巴细胞、老化T淋巴细胞、耗竭T淋巴细胞和胸腺输出T淋巴细胞;所述第二检测单元采用单克隆抗体荧光染料染色T淋巴细胞亚群,其中,初始T淋巴细胞的荧光单抗为CD3‑PC7、CD4‑FITC、CD8‑PC5.5、CD45RA‑PE、CD27‑ECD;中心记忆T淋巴细胞和效应记忆T淋巴细胞的荧光单抗为CD3‑PC7、CD4‑FITC、CD8‑PC5.5、CD45RO‑PE、CD27‑ECD;活化T淋巴细胞的荧光单抗为CD3‑PC7、CD4‑ECD、CD8‑PC5.5、HLA‑DR‑FITC、CD38‑PE;衰老T淋巴细胞的荧光单抗为CD3‑PC7、CD4‑ECD、CD8‑PC5.5、CD57‑FITC、CD28‑PE;老化T淋巴细胞和耗竭T淋巴细胞的荧光单抗为CD3‑PC7、CD4‑FITC、CD8‑PC5.5、KLRG1‑PE、PD‑1‑ECD;胸腺输出T淋巴细胞的荧光单抗为CD3‑PC7、CD4‑FITC、CD8‑PC5.5、CD45RA‑PE、CD31‑ECD;
第三检测单元,用于检测血浆样本中与机体炎症和稳态相关的细胞因子含量,得到细胞因子检测数据;所述第三检测单元采用酶联免疫吸附试验检测血浆样本中与机体炎症和稳态相关的细胞因子含量,所述与机体炎症和稳态相关的细胞因子包括IL‑6、IL‑7和TNF‑α;
分析单元,用于接收HIV‑1 DNA检测数据、T淋巴细胞亚群检测数据和细胞因子检测数据,并对T淋巴细胞亚群检测数据和细胞因子检测数据进行主成分分析,得到T淋巴细胞综合评分值和细胞因子综合评分值,将HIV‑1 DNA检测数据、T淋巴细胞综合评分值和细胞因子综合评分值进行相关性分析,判断HIV‑1 DNA检测数据、T淋巴细胞亚群检测数据和细胞因子检测数据之间的相关性;根据含量大小,将HIV‑1 DNA检测数据分为高病毒库组和低病毒库组,T淋巴细胞综合评分值分为高细胞免疫衰老组和低细胞免疫衰老组,细胞因子综合评分值分为高细胞因子组和低细胞因子组,进行logistic回归分析,判断HIV‑1 DNA检测数据、T淋巴细胞亚群检测数据和细胞因子检测数据之间的影响程度。
2.根据权利要求1所述的一种用于研究HIV感染者免疫衰老机制的系统,其特征在于,所述第一检测单元提取全血样本中的所有DNA,通过PCR法检测并计算单位数量的白细胞中HIV‑1 DNA的拷贝数。
3.根据权利要求2所述的一种用于研究HIV感染者免疫衰老机制的系统,其特征在于,所述第一检测单元包括定量标准曲线绘制单元,所述定量标准曲线绘制单元基于人类特异性基因片段的内参基因和HIV‑1 DNA的特异性基因制定双基因定量标准曲线以用于PCR定量检测。
4.根据权利要求1所述的一种用于研究HIV感染者免疫衰老机制的系统,其特征在于,所述分析单元用于将HIV‑1 DNA检测数据、T淋巴细胞综合评分值和细胞因子综合评分值转变为二分类变量指标后,利用logistic回归分析法分析HIV‑1 DNA检测数据、T淋巴细胞亚群检测数据和细胞因子检测数据之间的影响程度。
5.根据权利要求4所述的一种用于研究HIV感染者免疫衰老机制的系统,其特征在于,所述主成分分析法包括以下步骤:
趋同化处理检测数据中各指标数据,将所有指标数据转化为正向指标;
按照累积方差贡献率≥85%提取检测数据中的主成分;
计算每个全血样本或血浆样本中检测数据的主成分的综合评分值,所述综合评分值,其中,m为变量个数,k为提取的主成分数,λ为特征根,Ci为第i个主成分,i=
1,2,…,k;
根据综合评分值大小进行排序,综合评分值越大则免疫衰老程度越高,综合评分值越小则免疫衰老程度越低。
说明书 :
一种用于研究HIV感染者免疫衰老机制的系统
技术领域
背景技术
病率和死亡率,但是却无法完全清除体内潜伏的HIV病毒。长期的慢性病毒性感染会损伤机
体正常的免疫功能,引发慢性系统性炎症,导致免疫衰老(Immunosenescence)的发生。不同
于免疫退化的是,免疫衰老是一个由慢性抗原负荷引起的持续性消耗和重塑的适应过程。
免疫衰老并非HIV独有,其他病毒慢性感染例如CMV和中老年人也会出现免疫衰老。
指标。但是,这两个指标却无法解释HIV感染者体内的免疫衰老过程。
程度,因此所建立的研究模型的分析结果无法完整、准确地反映出HIV感染者的免疫衰老机
制和进程。
发明内容
相互关系及影响,探索和反映HIV感染者体内的免疫衰老机制与进程,为HIV药物的研发和
评估用药效果或其他干预手段的效果提供客观的科学支撑。
1DNA病毒库是指HIV病毒感染进入T淋巴细胞以后逆转录生成的潜伏存在于感染细胞和组
织中的HIV‑1DNA,在一定条件下能被再度激活形成具有复制能力的病毒。HIV‑1DNA病毒库
是清除HIV的主要障碍,因此将其作为一项独立的预测疾病进展的指标数据。
会造成胸腺输出T淋巴细胞的能力减弱,T淋巴细胞过度消耗,从而降低对病毒的反应,同时
HIV主要感染T淋巴细胞,可能会加剧机体的免疫衰老,形成恶性循坏。因此,本系统选择与
免疫衰老相关的T淋巴细胞亚群作为研究对象,旨在反映免疫衰老在细胞中出现的异常分
化、过度活化、复制衰老、过度耗竭、过度老化和胸腺输出功能减弱的情况。
持外周T淋巴细胞稳态的关键调节因子。故本系统通过检测血浆中各细胞因子的含量共同
反映机体的炎症与稳态。
据和细胞因子检测数据的两两相关性,以及三者间的相互影响程度。
胞因子三个维度的检测系统,将检测结果输出到分析单元后,提取T淋巴细胞亚群和细胞因
子的主成分获得其综合评价值,并利用相关回归分析法分析了HIV病毒库、T淋巴细胞亚群、
细胞因子的相互关系及相互影响,进而更加完整地从整体上反映出HIV感染者的免疫衰老
的机制与进程,不仅为HIV药物的研发和评估用药效果或其他干预手段的效果提供客观的
科学支撑,有利于HIV感染者免疫功能的重建,对其他慢性感染性疾病,甚至衰老相关的研
究都具有重要作用。
PCR法检测并计算单位数量的白细胞中HIV‑1DNA的拷贝数。具体地,采用人类基因组DNA提
取试剂盒提取全血中所有DNA,并使用HIV‑1DNA检测试剂盒的特定基因片段进行荧光PCR法
6 6
检测,计算以每1×10个白细胞中HIV‑1DNA的拷贝数表示,即cps/10cells。
因定量标准曲线以用于PCR定量检测。目前所使用的HIV‑1DNA定量检测试剂盒在不同的实
验环境尤其是不同的荧光PCR仪上进行定量检测时,需要设计出适合当前实验环境的定量
标准曲线用以HIV‑1DNA的定量检测。本系统的定量标准曲线绘制单元基于人类特异性基因
片段的内参基因和HIV‑1DNA的特异性基因制定双基因定量标准曲线,进一步地提高了定量
检测的准确性。
于阈值线没有特殊的控制,可能会由于人员操作造成Ct值在43附近的样本检测结果产生误
差,故本系统对检测孔Ct值在43±1的样本进行复检,以进一步提高结果的准确性。在一个
实施例中,复检的方式为将42<Ct<43的核酸提取样本进行对倍稀释再重新上机检测;将
43<Ct<44的样本重新提取,提取时加入的全血量加倍。如果复检结果与初检结果一致,则
维持原结果的判断;如果复检结果与初检结果不一致,则判为“不确定”。在一个实施例中,
所述有效性验证单元还用于验证试剂盒的有效性和/或样本的有效性。
的T淋巴细胞亚群占CD8+T淋巴细胞的百分比。在一个或多个实施例中,每类T淋巴细胞亚群
选择两个特定单抗分子来代表,相较于选用单一的特定单抗分子来代表的T淋巴细胞亚群
具有更好的特异性。
淋巴细胞(Effector Memory T Lymphocytes,Tem)、活化T淋巴细胞(Activated T
Lymphocytes,Ta)、衰老T淋巴细胞(Senescent T lymphocytes,Ts)、老化T淋巴细胞(Aging
T lymphocytes,Tagi)、耗竭T淋巴细胞(Exhausted T lymphocytes,Te)和胸腺输出T淋巴
细胞(Thymus export T lymphocytes,Tte)中的一种或多种。选择T淋巴细胞亚群作为研究
对象,将异常分化、过度活化、过度衰老、过度老化、过度耗竭和胸腺输出功能减弱的细胞亚
群代表纳入研究,能更加敏感和全面的反映T淋巴细胞免疫衰老的情况。
巴细胞,采用CD45RO+和CD27‑标记效应记忆T淋巴细胞,采用HLA‑DR+和CD38+标记活化T淋
巴细胞,采用CD57+和CD28+标记衰老T淋巴细胞,采用PD‑1和KLRG1标记老化T淋巴细胞和耗
竭T淋巴细胞,采用CD31+和CD45RA+标记胸腺输出T淋巴细胞,。之后,利用流式细胞术分别
计算CD4+和CD8+T淋巴细胞中各T淋巴细胞亚群目标细胞所占的百分比。
FITC、CD8‑PC5.5、CD45RA‑PE、CD27‑ECD;中心记忆T淋巴细胞和效应记忆T淋巴细胞的荧光
单抗为CD3‑PC7、CD4‑FITC、CD8‑PC5.5、CD45RO‑PE、CD27‑ECD;活化T淋巴细胞的荧光单抗为
CD3‑PC7、CD4‑ECD、CD8‑PC5.5、HLA‑DR‑FITC、CD38‑PE;衰老T淋巴细胞的荧光单抗为CD3‑
PC7、CD4‑ECD、CD8‑PC5.5、CD57‑FITC、CD28‑PE;老化T淋巴细胞和耗竭T淋巴细胞的荧光单
抗为CD3‑PC7、CD4‑FITC、CD8‑PC5.5、KLRG1‑PE、PD‑1‑ECD;胸腺输出T淋巴细胞的荧光单抗
为CD3‑PC7、CD4‑FITC、CD8‑PC5.5、CD45RA‑PE、CD31‑ECD。通过上述荧光单抗的搭配,可以一
次性地检测CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞中T淋巴细胞亚群的含量,显著
提高检测效率。
因子包括IL‑6、IL‑7和TNF‑α中的一种或多种。HIV感染会造成机体出现炎症老化,T细胞过
度分化为炎症性T细胞,分泌更多炎症因子;此外,IL‑7是维持外周T淋巴细胞稳态的关键调
节因子。因此,故本系统选择IL‑6和TNF‑α作为炎症的预警因子,选择IL‑7作为机体稳态的
指示因子,共同反映机体的炎症与稳态。采用酶联免疫吸附试验计算每mL血浆中各细胞因
子的含量。
HIV‑1DNA检测数据、T淋巴细胞综合评分值和细胞因子综合评分值进行相关性分析,判断
HIV‑1DNA检测数据、T淋巴细胞亚群检测数据和细胞因子检测数据之间的相关性;根据含量
大小,将HIV‑1DNA检测数据分为高病毒库组和低病毒库组,T淋巴细胞综合评分值分为高细
胞免疫衰老组和低细胞免疫衰老组,细胞因子综合评分值分为高细胞因子组和低细胞因子
组,进行logistic回归分析,判断HIV‑1DNA检测数据、T淋巴细胞亚群检测数据和细胞因子
检测数据之间的影响程度。
和HIV‑1DNA检测数据,或者T淋巴细胞亚群检测数据、细胞因子综合评分值和HIV‑1DNA检测
数据判断相关性和影响程度。
可能会存在多重共线性,不适合采用回归分析。因此本技术方案所采用的分析方式为:对T
淋巴细胞亚群和细胞因子的检测数据进行主成分分析,将T淋巴细胞亚群和细胞因子的多
个变量结果转化为少数几个综合变量作为主成分,再通过计算主成分得分算出综合评分
值,根据综合评分值大小进行排序,可以得到评价对象的T淋巴细胞衰老和细胞因子炎症和
机体稳态受影响的程度。对HIV‑1DNA病毒库进行标准化处理,得到相应的标准化Z值,在此
基础上再对HIV‑1DNA检测结果、T淋巴细胞综合评分值和细胞因子综合评分值进行相关性
分析;之后对三类指标进行排序,以中位数为分界点,对每类指标转变高值组和低值组,将
连续型变量转变为二分类变量,从而对这些变量进行logistic回归分析,进而探讨HIV感染
者免疫衰老的机制。
和细胞因子综合评分值进行相关性分析;将HIV‑1DNA检测数据、T淋巴细胞综合评分值和细
胞因子综合评分值转变为二分类变量指标后,利用logistic回归分析法分析HIV‑1DNA检测
数据、T淋巴细胞亚群检测数据和细胞因子检测数据之间的影响程度。
=1,2,…,k;
维度的检测系统,将检测结果输出到分析单元后,提取T淋巴细胞亚群和细胞因子的主成
分,并利用相关分析和回归分析法分析了HIV病毒库、T淋巴细胞亚群、细胞因子的相互关系
及相互影响,进而更加完整地从整体上反映出HIV感染者的免疫衰老的机制与进程,不仅为
HIV药物的研发和评估用药效果或其他干预手段的效果提供客观的科学支撑,有利于HIV感
染者免疫功能的重建,对其他慢性感染性疾病,甚至衰老相关的研究都具有重要作用;
反映T淋巴细胞免疫衰老的情况;
附图说明
具体实施方式
为对本发明的限定。
耗材属于市售的普通产品,其中涉及的检测手段以及仪器均为本领域技术人员所熟知并熟
练掌握。
血样本中与免疫衰老相关的T淋巴细胞亚群占CD4+T淋巴细胞的百分比和/或与免疫衰老相
关的T淋巴细胞亚群占CD8+T淋巴细胞的百分比;所述第三检测单元采用酶联免疫吸附试验
检测血浆样本中与机体炎症和稳态相关的细胞因子含量,所述与机体炎症和稳态相关的细
胞因子包括IL‑6、IL‑7和TNF‑α中的一种或多种。
据、T淋巴细胞综合评分值和细胞因子综合评分值进行相关性分析,判断HIV‑1DNA检测数
据、T淋巴细胞亚群检测数据和细胞因子检测数据之间的相关性;根据含量大小,将HIV‑
1DNA检测数据分为高病毒库组和低病毒库组,T淋巴细胞综合评分值分为高细胞免疫衰老
组和低细胞免疫衰老组,细胞因子综合评分值分为高细胞因子组和低细胞因子组,对高病
毒库组、低病毒库组、高细胞免疫衰老组、低细胞免疫衰老组、高细胞因子组和低细胞因子
组进行logistic回归分析,判断HIV‑1DNA检测数据、T淋巴细胞亚群检测数据和细胞因子检
测数据之间的影响程度。
维度的检测系统,将检测结果输出到分析单元后,提取T淋巴细胞亚群和细胞因子的主成
分,并利用相关回归分析法分析了HIV病毒库、T淋巴细胞亚群、细胞因子的相互关系及相互
影响,进而更加完整地从整体上反映出HIV感染者的免疫衰老的机制与进程,不仅为HIV药
物的研发和评估用药效果或其他干预手段的效果提供客观的科学支撑,有利于HIV感染者
免疫功能的重建,对其他慢性感染性疾病,甚至衰老相关的研究都具有重要作用。
量标准曲线以用于PCR定量检测。
的有效性。
胞、耗竭T淋巴细胞和胸腺输出T淋巴细胞、中的一种或多种。选择T淋巴细胞亚群作为研究
对象,将代表异常分化、过度活化、过度衰老、过度老化、过度耗竭和胸腺输出功能减弱的细
胞亚群纳入研究,能更加敏感和全面的反映T淋巴细胞免疫衰老的情况。
CD27‑ECD;中心记忆T淋巴细胞和效应记忆T淋巴细胞的荧光单抗为CD3‑PC7、CD4‑FITC、
CD8‑PC5.5、CD45RO‑PE、CD27‑ECD;活化T淋巴细胞的荧光单抗为CD3‑PC7、CD4‑ECD、CD8‑
PC5.5、HLA‑DR‑FITC、CD38‑PE;衰老T淋巴细胞的荧光单抗为CD3‑PC7、CD4‑ECD、CD8‑PC5.5、
CD57‑FITC、CD28‑PE;老化T淋巴细胞和耗竭T淋巴细胞的荧光单抗为CD3‑PC7、CD4‑FITC、
CD8‑PC5.5、KLRG1‑PE、PD‑1‑ECD;胸腺输出T淋巴细胞的荧光单抗为CD3‑PC7、CD4‑FITC、
CD8‑PC5.5、CD45RA‑PE、CD31‑ECD。
和细胞因子综合评分值进行相关性分析;将HIV‑1DNA检测数据、T淋巴细胞综合评分值和细
胞因子综合评分值转变为二分类变量指标后,利用logistic回归分析法分析HIV‑1DNA检测
数据、T淋巴细胞亚群检测数据和细胞因子检测数据之间的影响程度。
=1,2,…,k;
全血样本完成HIV‑1DNA病毒库的检测,以及初始T淋巴细胞Tn、中心记忆T淋巴细胞Tcm、效
应记忆T淋巴细胞Tem、活化T淋巴细胞Ta及衰老T淋巴细胞Ts的检测;血浆样本完成IL‑6的
ELISA检测。
剂盒和HIV‑1DNA定量检测试剂盒,其结果以每1×10个白细胞中HIV‑1DNA的拷贝数表示,
6
即cps/10 cells;第二检测单元所采用的流式细胞术检测的荧光单抗购自Beckman公司,其
结果以CD4+T淋巴细胞或CD8+T淋巴细胞中T淋巴细胞亚群目标细胞所占的百分比表示;
ELISA试剂购自R&D System公司,其结果以血浆样本中IL‑6的浓度(pg/mL)表示。
于‑20℃或以下避光储藏。
68℃延伸30s,45个循环。
PC7的荧光单抗2.5μL,共配制成17.5μL多色荧光抗体试剂;其中,初始T淋巴细胞Tn的荧光
单抗为CD3‑PC7、CD4‑FITC、CD8‑PC5.5、CD45RA‑PE、CD27‑ECD、中心记忆T淋巴细胞Tcm和效
应记忆T淋巴细胞Tem的荧光单抗为CD3‑PC7、CD4‑FITC、CD8‑PC5.5、CD45RO‑PE、CD27‑ECD、
活化T淋巴细胞Ta的荧光单抗为CD3‑PC7、CD4‑ECD、CD8‑PC5.5、HLA‑DR‑FITC、CD38‑PE,衰老
T淋巴细Ts的检测的荧光单抗为CD3‑PC7、CD4‑ECD、CD8‑PC5.5、CD57‑FITC、CD28‑PE。
Ta%、CD8+Ts%转化为少数几个综合变量作为主成分,并通过计算主成分得分算出综合评
分值,通过对这个综合评分值进行排序,可以得到评价对象T淋巴细胞衰老的程度。
测结果CD4+T淋巴细胞亚群中Tn所占百分比(CD4+Tn%)用差值法(100‑X)%转化为正向指
标;之后按照累积方差贡献率≥85%的原则,提取出主成分,计算每个样本的主成分综合评
分值 其中,m为变量个数,k为提取的主成分数,λ为特征根,Ci为第i个主成
分,i=1,2,…,k;对该综合评分值进行排序,即可得到T淋巴细胞亚群所代表的免疫衰老的
程度,免疫衰老程度越高,综合评分值也越高,反之亦然。
大于两个时,利用主成分分析法处理细胞因子,得到细胞因子综合评分值,并对综合评分值
进行排序,得到细胞因子所代表的免疫衰老程度。细胞因子的主成分分析方法与上述T淋巴
细胞亚群的分析方法相同。在细胞因子中,IL‑6和TNF‑a为正向指标,浓度越高,炎症越严
重;IL‑7为逆向指标,浓度越高,越有利于细胞稳态。三类细胞因子的量纲不同,需要对三类
细胞因子进行标准化处理再进行主成分分析。在部分实施例中,细胞因子也可以选择除了
IL‑6、IL‑7和TNF‑α以外的其他与机体炎症和稳态相关的细胞因子。
综合评分值进行相关性分析。之后对这三类指标进行排序,以中位数为分界点,对每类指标
转变为,分为高值组和低值组,即高病毒库组、低病毒库组、高免疫衰老组、低免疫衰老组、
高IL‑6组、低IL‑6组,将连续型变量转变为二分类变量,从而对这些变量进行logistic回归
分析。
病毒库大小与T淋巴细胞亚群免疫衰老程度正相关,HIV‑1DNA病毒库大小与IL‑6浓度正相
关,T淋巴细胞亚群免疫衰老程度也与IL‑6的浓度正相关,P值均小于0.05,均有统计学意
义。
病毒库与IL‑6 0.24 0.0098
免疫衰老细胞与IL‑6 0.20 0.032
P值为0.026,差异有统计学意义,可以认为病毒库大小对细胞免疫衰老程度有影响,高病毒
库含量的HIV感染者出现高度细胞免疫衰老的风险是低病毒库含量者的1.96倍。
胞免疫衰老程度作为自变量,IL‑6浓度高低作为因变量,进行logistic回归,得到OR为
1.385,P值为0.3930,差异无统计学意义,无法判断病毒库大小对IL‑6浓度的影响。
到了180份,不足全血样本的2/3。此外,T淋巴细胞亚群选择了4类指标(占第二检测单元指
标数的2/3),细胞因子指标只选了1种(占第三检测单元指标数的1/3),从样本量和指标数
的角度都偏少。但是,即使是在这种情况下,通过上述系统及方法也发现了IL‑6与HIV‑1DNA
病毒库和与衰老相关的T淋巴细胞亚群具有正相关,不仅如此,如表4所示,高病毒库和高细
胞衰老组的IL‑6中位数值分别高于低病毒库和低细胞衰老组。由此可见,上述HIV感染者免
疫衰老机制的系统及方法是可靠和有效的,随着样本量增大,细胞因子类型增加,病毒库对
细胞因子的浓度,以及细胞免疫衰老程度对细胞因子的浓度影响的统计学差异会在回归分
析里出现。
HIV‑1DNA病毒库大小 3.25pg/mL 2.39pg/mL
细胞衰老程度F值 3.17pg/mL 2.44pg/mL
关的,并且可以看到HIV‑1DNA病毒库的大小会对T淋巴细胞的免疫衰老产生影响,病毒库增
大使得HIV感染者T淋巴细胞中初始的T淋巴细胞减少,记忆T淋巴细胞增多,细胞过度活化
和衰老,从而加速T淋巴细胞的免疫衰老进程,高病毒库含量的HIV感染者出现高度细胞免
疫衰老的风险是低病毒库含量者的1.96倍,此外病毒库与细胞免疫衰老可能会同时伴随
IL‑6的过度分泌,影响HIV感染者的免疫功能。如果未来能有一些药物或者其他干预手段能
以HIV‑1DNA病毒库作为靶点,降低其含量,将有利于HIV感染者T淋巴细胞亚群免疫衰老程
度,有利于提升HIV感染者的免疫功能。
标,可能会能更敏感和快速地反映出干预手段如随访干预、心理疏导、营养指导等等的效
果,不仅如此,其他慢性感染性疾病如肺结核、乙肝或免疫力低下如老年人等人群中也同样
具有应用价值,具有较为广泛的适用人群。
施例所公开的方法。对试验组和对照组的病毒库、T淋巴细胞亚群和细胞因子的综合评分值
进行单因素分析,例如独立样本t检验、单因素方差分析、秩和检验等,比较不同干预手段分
别对三类指标的影响,之后以干预手段的分组为自变量,三类指标为因变量,进行多元t检
验,综合评估药物干预手段对免疫衰老相关的核酸、细胞、细胞因子的影响。
DNA,提取物的浓度控制在66ng/μL,使得能控制内参基因的浓度为2×10cps/μL,HIV‑1DNA
3
目标基因的浓度为1×10 cps/μL。在此基础上进行10倍浓度梯度稀释,使得内参基因的浓
4 3 2
度梯度2×10cps/μL、2×10 cps/μL、2×10cps/μL、20cps/μL,HIV‑1DNA的浓度梯度为1×
3 2
10cps/μL、1×10cps/μL、10cps/μL、1cps/μL。PCR反应体系中核酸加入的量为10μL,因此内
5 4 3
参基因的反应体系浓度最终为2×10 、2×10 、2×10、200cp,HIV‑1DNA的反应体系浓度最
4 3
终为1×10、1×10、100、10cps/μL。
仪器设备上用该试剂盒进行HIV‑1DNA的定量检测,均以此阈值线为标准。在此阈值线下,内
参基因和HIV‑1DNA每个浓度设立三个平行样进行荧光PCR检测,检测结果(以Ct值表示)如
表5所示。
来误差,故本检测平台要求检测孔Ct值在43±1的样本须进行复检。
致,则维持原结果的判断;如果复检结果与初检结果不一致,则判为“不确定”。
少DNA加入量再进行试验,但检测孔信号无升起或落在阴性区,该试验结果仍可信;如果控
制孔为阴性或其Ct值大于前述范围,说明加入的基因组DNA含有PCR抑制剂或DNA加入量过
少,需重新提取DNA或增加DNA上样量再进行试验,但检测孔信号有升起且落在阳性区,该试
验结果仍可信。
于43,则该样本为HIV‑1阳性;样本检测孔Ct值在42<Ct<44,需进行复检,复检结果与初检
结果一致结果报告初检结果,复检结果与初检结果不一致则判为不确定。
实施例6制定的定量标准双曲线,输入HIV‑1DNA基因Ct值和内参基因Ct值,计算出10的细
6
胞中感染HIV‑1DNA拷贝数(copies/10cells;如果检测孔的Ct值>43或无Ct值,则未检出,
这部分样本的结果也为低于检出限。
的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含
在本发明的保护范围之内。