一种针对肿瘤细胞的自动化分离富集装置及方法转让专利
申请号 : CN202011046765.0
文献号 : CN112080393B
文献日 : 2021-09-10
发明人 : 崔彩媚 , 张雷 , 丁汝波 , 甘剑亮
申请人 : 深圳睿思生命科技有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种针对肿瘤细胞的自动化分离富集装置,其特征在于,包括动力单元、样本单元、缓冲液单元、芯片、富集液单元和废液单元,所述芯片的入口端连接所述缓冲液单元和样本单元,所述芯片的出口端连接所述富集液单元和废液单元,所述动力单元同时连接至所述样本单元和缓冲液单元;所述芯片为微流控芯片;
所述样本单元包括样本管,所述样本管一端通过样本电磁阀连接动力单元,另一端通过第一管路连接至芯片入口端,所述第一管路上包括样本夹管阀;所述缓冲液单元包括缓冲液管,所述缓冲液管一端通过缓冲电磁阀连接动力单元,另一端通过第二管路连接至芯片入口端,所述第二管路上包括缓冲夹管阀;所述富集液单元包括富集液管,所述富集液管通过第四管路连接至芯片出口端,所述第四管路包括富集夹管阀;所述废液单元包括废液管,所述废液管通过第三管路连接至芯片出口端,所述第三管路包括废液夹管阀;
所述动力单元包括压力产生子单元,所述压力产生子单元的输出端口通过压力电磁阀连接至压力传感器,所述压力传感器连接至样本电磁阀和缓冲电磁阀;所述动力单元还包括压力控制板,所述控制板同时连接压力电磁阀、样本电磁阀、缓冲电磁阀、样本夹管阀、缓冲夹管阀、富集夹管阀和废液夹管阀;所述压力产生子单元包括传动机构和气缸,所述传动机构包括依次连接的步进电机、小齿轮、大齿轮、滚珠丝杆、滚珠轴承、导轨、滑动拨杆和活塞杆,所述步进电机的输出端通过小齿轮和大齿轮连接至滚珠丝杆的一端,所述滚珠丝杆的另一端通过所述滚珠轴承连接至所述导轨,所述导轨通过滑动拨杆和活塞杆连接至所述气缸;所述步进电机转动,动力通过小齿轮、大齿轮、滚珠丝杠、滑动拨杆传输至活塞杆,所述活塞杆推动气缸产生压力;
所述缓冲电磁阀、样本夹管阀和缓冲夹管阀打开时,所述动力单元产生的压力迫使所述缓冲液管中的缓冲液沿着第二管路进入芯片中,经过芯片后再沿着第一管路进入样本管中;所述样本电磁阀、样本夹管阀、缓冲电磁阀、缓冲夹管阀、富集夹管阀和废液夹管阀打开时,所述动力单元产生的压力迫使所述样本管中的样本和缓冲液管中的缓冲液通过芯片分别进入富集液管和废液管中。
2.根据权利要求1所述的一种针对肿瘤细胞的自动化分离富集装置,其特征在于,所述样本管的端口密封,所述样本管的端口分别连接样本气体输入管和第一管路,所述样本气体输入管通过样本气体输出管和样本电磁阀连接至所述动力单元的输出端;所述第一管路连接至所述芯片的入口端。
3.根据权利要求1所述的一种针对肿瘤细胞的自动化分离富集装置,其特征在于,所述缓冲液管的端口密封,所述缓冲液管的端口分别连接缓冲气体输入管和第二管路,所述缓冲气体输入管通过缓冲气体输出管和缓冲电磁阀连接至所述动力单元的输出端;所述第二管路连接至所述芯片的入口端。
4.根据权利要求1所述的一种针对肿瘤细胞的自动化分离富集装置,其特征在于,所述压力电磁阀、样本电磁阀和缓冲电磁阀均为两通电磁阀。
5.一种采用权利要求1所述的自动化分离富集装置对肿瘤细胞进行分离富集的方法,所述方法不用于疾病的诊断和治疗;其特征在于,包括如下步骤:S01:动力单元产生压力P2,富集夹管阀、废液夹管阀、样本电磁阀关闭,样本夹管阀、缓冲夹管阀和缓冲电磁阀打开;所述动力单元产生的压力P2使得缓冲液管中的缓冲液通过芯片进入样本管中,维持时间S1,使得样本管中样本被稀释;
S02:动力装置产生压力P2保持不变,样本夹管阀和样本电磁阀关闭,缓冲电磁阀、缓冲夹管阀、富集夹管阀和废液夹管阀打开,所述动力单元产生的压力P2使得缓冲液管中的缓冲液分别通过第三管路和第四管路排出至富集液管和废液管中,维持时间S2,使得管路中气体排出并达到预润管路的目的;
S03:富集夹管阀、废液夹管阀关闭,保留缓冲电磁阀和缓冲夹管阀打开,动力装置产生压力P2保持升为压力P3,维持时间S3,使得芯片中的气泡被完全去除;
S04:动力装置产生压力P3保持不变,缓冲电磁阀、缓冲夹管阀、样本电磁阀、样本夹管阀、富集夹管阀和废液夹管阀打开;样本管中的样本和缓冲液管中的缓冲液在压力P3作用下进入芯片中进行分离富集,富集液进入所述富集液管中,废液进入所述废液管中;
S05:样本跑完之后,对所述动力单元进行泄压。
6.根据权利要求5所述的一种对肿瘤细胞进行分离富集的方法,其特征在于,所述步骤S01之间,将样本气体输入管和样本气体输出管通过钢针连接起来;将缓冲气体输入管和缓冲气体输出管通过钢针连接起来。
7.根据权利要求6所述的一种对肿瘤细胞进行分离富集的方法,其特征在于,所述动力单元包括压力产生子单元和控制板,所述压力产生子单元的输出端口通过压力电磁阀连接至压力传感器,所述压力传感器连接至样本电磁阀和缓冲电磁阀;所述控制板用于控制压力电磁阀、样本电磁阀、缓冲电磁阀、样本夹管阀、缓冲夹管阀、富集夹管阀和废液夹管阀的开闭。
8.根据权利要求7所述的一种对肿瘤细胞进行分离富集的方法,其特征在于,所述步骤S05具体包括:
S051:样本跑完之后,关闭样本夹管阀、缓冲夹管阀、富集夹管阀和废液夹管阀,维持时间S4;
S052:控制板控制压力电磁阀打开,对动力单元进行泄压;同时打开样本夹管阀、缓冲夹管阀、富集夹管阀和废液夹管阀。
说明书 :
一种针对肿瘤细胞的自动化分离富集装置及方法
技术领域
背景技术
更好实现个体化治疗等。尤其是获取CTCs无损活细胞过程,其意义更是重大,通过对CTCs无
损活细胞培养可以为CTCs的研究提供宝贵的复制样本。但由于肿瘤患者在外周血中CTCs数
量稀少,研究表明平均在10^6~10^7个单核细胞中仅含有1个CTCs,再加上血液的复杂性,
如何分离富集CTCs是一项非常复杂的技术。目前已有的技术有三种:密度梯度离心法、多微
孔滤膜法、微流控芯片法。
离方法的样本量,但是,这种方法仅可以用于分离核型较为正常的细胞,反而会损失细胞核
异常的循环肿瘤细胞,这些细胞核异常的循环肿瘤细胞在很大程度上更能体现癌症的进
展。膜过滤法,只能筛选特定粒径的细胞,对于大于或者小于该粒径的目标细胞容易造成漏
检的情况,进而造成假阴性或者检测值比实际水平低的情况。基于标记物的分离方法,其中
阳性筛选只能筛选特定的癌细胞类型,然而癌细胞的表达在很大程度上是未知的,这造成
了目标细胞丢失,检测结果有效性偏低的问题;通过CD45负选的方法分离血液中CD45阳性
细胞,这类细胞数量较大,利用这种方法对样本较多的细胞进行处理,容易出现分离效率不
佳,残留较多白细胞;并且基于标记物的分离方法,在操作过程前需要裂解红细胞,在处理
不得当的情况下,同时可能对目标细胞造成损伤。
这种方法对整个分离富集系统要求较高。目前微流控芯片法还具有如下缺陷:
发明内容
入口端连接所述缓冲液单元和样本单元,所述芯片的出口端连接所述富集液单元和废液单
元,所述动力单元同时连接至所述样本单元和缓冲液单元;所述芯片为微流控芯片;
括缓冲液管,所述缓冲液管一端通过缓冲电磁阀连接动力单元,另一端通过第二管路连接
至芯片入口端,所述第二管路上包括缓冲夹管阀;所述富集液单元包括富集液管,所述富集
液管通过第四管路连接至芯片出口端,所述第四管路包括富集夹管阀;所述废液单元包括
废液管,所述废液管通过第三管路连接至芯片出口端,所述第三管路包括废液夹管阀;
冲夹管阀、富集夹管阀和废液夹管阀打开时,所述动力单元产生的压力迫使所述样本管中
的样本和缓冲液管中的缓冲液通过芯片分别进入富集液管和废液管中。
的输出端;所述第一管路连接至所述芯片的入口端。
单元的输出端;所述第二管路连接至所述芯片的入口端。
磁阀;所述控制板同时连接压力电磁阀、样本电磁阀、缓冲电磁阀、样本夹管阀、缓冲夹管
阀、富集夹管阀和废液夹管阀。
机的输出端通过小齿轮和大齿轮连接至滚珠丝杆的一端,所述滚珠丝杆的另一端通过所述
滚动轴承连接至所述导轨,所述导轨通过滑动拨杆和活塞杆连接至所述气缸;
通过芯片进入样本管中,维持时间S1,使得样本管中样本被稀释;
的缓冲液分别通过第三管路和第四管路排出至富集液管和废液管中,维持时间S2,使得管
路中气体排出并达到预润管路的目的;
作用下进入芯片中进行分离富集,富集液进入所述富集液管中,废液进入所述废液管中;
磁阀;所述控制板用于控制压力电磁阀、样本电磁阀、缓冲电磁阀、样本夹管阀、缓冲夹管
阀、富集夹管阀和废液夹管阀的开闭。
相的样本及缓冲液进行驱动,使样本能够匀速稳定的进入芯片,降低对细胞的损伤,能回收
更多的目标细胞,保证循环肿瘤细胞在下游分析中的可靠性;本发明离5mL血液仅需20分
钟,极大的保证了细胞的活性;本发明装置能够实现自动化操作,减少流程工序,且中途无
需人工参与,降低了中间环节出现差错的几率,对人员的专业技术技能要求低,缩短了检测
时间提高检测效率。
附图说明
管路,211第四管路,301步进电机,302小齿轮,303大齿轮,304滚珠丝杆,305滚珠轴承,306
导轨,307滑动拨杆,308活塞杆,309气缸,401电源适配器接口,402电源开关,403开始按钮,
404终止按钮,405按成按钮,406指示灯,407急停按钮,408细胞过滤器槽;
富集夹管阀,F3废液夹管阀,H芯片。
具体实施方式
端连接富集液单元和废液单元,动力单元同时连接至样本单元和缓冲液单元;本发明中芯
片为微流控芯片。
端口密封,样本管的端口分别连接样本气体输入管G3和第一管路209,样本气体输入管通G3
过样本气体输出管G1和样本电磁阀K2连接至动力单元的输出端;第一管路209通过样本夹
管阀F1连接至芯片H的入口端。
端口分别连接缓冲气体输入管G4和第二管路210,缓冲气体输入管G4通过缓冲气体输出管
G2和缓冲电磁阀K3连接至动力单元的输出端;第二管路210通过缓冲夹管阀F2连接至芯片
的入口端。
制板103同时连接压力电磁阀K1、样本电磁阀K2、缓冲电磁阀K3、样本夹管阀F1、缓冲夹管阀
F2、富集夹管阀F4和废液夹管阀F3。本发明中压力电磁阀、样本电磁阀和缓冲电磁阀均为常
闭两通电磁阀;样本夹管阀、缓冲夹管阀、富集夹管阀和废液夹管阀均为常开夹管阀。
308,步进电机301的输出端通过小齿轮302和大齿轮303连接至滚珠丝杆304的一端,滚珠丝
杆304的另一端通过滚动轴承305连接至导轨306,导轨306通过滑动拨杆307和活塞杆308连
接至气缸309;步进电机301转动,动力通过小齿轮302、大齿轮303、滚珠丝杠304、滑动拨杆
307传输至活塞杆308,如附图所示,滑动拨杆307和活塞杆308为垂直连接结构,气缸309位
于活塞杆的上方,最终活塞杆308将气缸向上推动使得气缸309产生一定压力的气体,压力
的带下可以由压力传感器P1检测,同时压力传感器P1将检测数值反馈给主控板103,主控板
再控制步进电机的进和退从而获得想要的气体压力。
富集夹管阀和废液夹管阀打开时,动力单元产生的压力迫使样本管中的样本和缓冲液管中
的缓冲液通过芯片分别进入富集液管和废液管中。通过控制板对电磁阀和夹管阀的开闭控
制,实现样本的稀释,管路的排气润湿以及样本跑样过程。
或者硬管或者软硬结合管,其管口口径可以根据具体需求进行设置。本发明中芯片为微流
控分离富集芯片,其入口数何出口数的增减均适用于本发明。
406、急停按钮407和细胞过滤器槽408,其中,细胞过滤槽用于对样本进行过滤,其他按钮用
于辅助设备使用。
磁阀、缓冲电磁阀、样本夹管阀、缓冲夹管阀、富集夹管阀和废液夹管阀的开闭。
缓冲气体输入管G2进入到缓冲液管203中,缓冲液受到压力P2的作用,沿着第二管路210进
入到芯片H中,经过芯片后再沿着第一管路209进入到样本管201中,维持时间S1,使得样本
管中样本被稀释。
开,动力单元产生的压力P2使得缓冲液管203中的缓冲液分别通过第三管路212和第四管路
211排出至富集液管208和废液管206中,维持时间S2,使得管路中气体排出并达到预润管路
的目的;
的气泡被完全去除;注意:压力P3是大于压力P2的,本发明采用的是先较低压预润及排气,
再高压跑液的方法。
样本在压力P3作用下进入芯片H中进行分离富集,同时缓冲液管203中的缓冲液在压力P3作
用下进入芯片H中,两种液体经过芯片之后,富集液进入富集液管208中,废液进入废液管
206中;压力P3保持不变直至样本跑完。
项发明相比于其他循环肿瘤细胞分离方法具有省时省力,操作简便的优势。
的培养基终止消化反应,用1mL移液器将细胞混合均匀,在镜下确认所有细胞均被分散成单
个细胞。并取100μL细胞,使用细胞计数仪进行计数。
用该设备进行分离。
98.25%。
MB‑231进行分离富集;得到结果见表
H1299 112 114 0 98.25%
HT29 136 138 0 98.55%
Hela 92 95 0 96.84%
AGS 165 173 0 95.38%
HepG2 113 118 0 95.76%
MDA‑MB‑231 68 69 0 98.55%
基终止消化反应,用1mL移液器将细胞混合均匀,在镜下确认所有细胞均被分散成单个细
胞。并取100μL细胞,按照1:1加入台盼蓝,使用细胞计数仪进行计数并计算细胞活率;经测
量细胞的初始活率为96.81%。
采用相同的初始细胞液,经过三次分离并测量细胞活性,分离后的细胞的活率分别为
94.82%、95.83%和96.44%,也就是说三次平均测量活性为95.70%。可以看出,本发明装
置中的微流控系统分离细胞前后细胞活性变化没有明显区别。
2周;培养过程中具体照片以及生产曲线如如图5和附图6所示,可以看出,在进行两周的培
养实验中,本发明分离装置和方法对于细胞的生长并没有影响。
操作进行分离;
遍,用100μL PBS重悬,在Nikon Ti2荧光显微镜下对细胞富集管内的细胞进行计数;
分离;
清。向第一份富集液中加入100μL破膜液,室温破膜10分钟,600×g离心5分钟,弃上清。向第
一份富集液中加入300μL洗涤液,600×g离心5分钟,弃上清。
离心5分钟,弃上清,加入100μL重悬液,荧光显微镜下观察。向第二份管中加入CD45‑Alexa
Fluor 488、vimentin‑Alexa Fluor 594、DAPI,室温孵育1小时;400×g离心5分钟,弃上清;
向细胞沉淀中加入100μL重悬液,荧光显微镜下观察;观察图如附图7所示。
同时也可以分离出小于白细胞的肿瘤细胞。
之内。