一种螺环化合物的生物样品分析方法

摘要

本发明提供了一种螺环化合物的生物样品分析方法，是通过高效、快速、灵敏的液相‑质谱联用系统(LC‑MS)方法对螺环化合物进行分析。此方法采取了简单的有机溶剂蛋白沉淀法对生物样本进行前处理，基于待测物与内标的峰面积比，通过归一化法得到标准曲线，从而定量得到生物样品中螺环化合物的浓度。本法为螺环化合物在动物体内的药代动力学中螺环化合物的检测提供了简便的分析方法。

权利要求

1.一种螺环化合物的生物样品分析方法，其特征在于，该分析方法包括以下步骤：（1）标准曲线溶液配制

称取10.52 mg螺环化合物对照品，置于100 ml容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀后配制成0.1052 mg/ml的标准溶液，再次加入乙腈稀释，配制成浓度分别为1‑500 ng/mL的标准曲线溶液；

（2）质控溶液配制

称取10.78 mg螺环化合物对照品，置于100 ml容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀后配制成0.1078 mg/ml的质控溶液，再次加入乙腈稀释，配制成浓度分别为2，40，400 ng/mL的质控溶液；

（3）内标溶液配制

称取11.43 mg特非那定对照品，置于100 ml容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀后配制成0.1143 mg/ml的内标溶液，再次加入乙腈稀释，配制成浓度为100 ng/mL的内标溶液；

（4）生物样品前处理

取生物样品，加入重量：体积比为1g : 6 mL的生理盐水匀浆，取100 μL匀浆后的生物样品至1.5 mL EP管中，加入100μL浓度为100 ng/mL的特非那定内标溶液，混匀，加入350‑

550μL乙腈沉淀，涡旋1‑2分钟混匀，4℃，13000‑15000 rpm离心15‑20分钟，取200 μL上清液进样；

（5）LC‑MS/MS方法检测

所述LC‑MS/MS方法的色谱及质谱条件如下：色谱条件：液相型号为Agilent 1260；色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB‑C8；流动相A相为5mM 乙酸铵水溶液，流动相B相为0.1%甲酸乙腈溶液，A:B=10:90；

质谱条件：API 4000质谱ESI源，负离子，离子喷射电压为5000 V，温度550℃，雾化气压力为55 psi，解簇电压压力为60 psi，气帘气体压力为30 psi，扫描方式为多重反应监测;通过LC‑MS/MS方法检测，基于待测物与内标的峰面积比，通过归一化法得到标准曲线，从而定量得到生物样品中螺环化合物的浓度;所述螺环化合物具有如下任一通式结构：，

其中，

R1选自可选地被1‑3个R4取代的5‑10元芳环基或5‑10元杂芳环基；

R2选自氢、C1‑3烷基、卤代C1‑3烷基或C3‑6环烷基，其中，所述的C3‑6环烷基可选地被一个或多个选自C1‑3烷基和卤代C1‑3烷基的基团所取代；

Z选自可选地被1‑3个R4取代的5‑10元芳环基或5‑10元杂芳环基；

R3选自‑CO2R5、‑CONR5R6、‑CONR5SO2R6、‑CONR5(CR7)1‑4CO2R5、‑SO2R5或四唑；

A选自N或CR8；

R4选自卤素、C1‑6烷基、卤代C1‑6烷基、C1‑6烷氧基、卤代C1‑6烷氧基或C3‑6环烷基；

R5、R6和R7独立地选自氢、C1‑6烷基、卤代C1‑6烷基、C3‑6环烷基或卤代C3‑6环烷基；

R8选自氢或羟基。

2.如权利要求1所述螺环化合物的生物样品分析方法，其特征在于，所述生物样品选自受试者的血液或血清样品。

说明书

一种螺环化合物的生物样品分析方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种螺环化合物的生物样品分析方 法。

背景技术

[0002] 法尼醇X受体(FXR)是一种核受体，是一种胆酸的传感器，可调控胆酸 的合成和胆汁在肝内的流动，同时对于胆汁内环境稳定、脂质代谢、糖代谢以 及炎症/免疫应答都有作
用。法尼醇X受体(FXR)激动剂，具有抗淤胆、抗纤 维化的效果。

[0003] 近期研究表明，螺环化合物能有效治疗法尼醇X受体介导的疾病，相对于 现有FXR激动剂更稳定、半衰期长，在制备预防和/或治疗胆固醇性胆结石症、 原发性胆汁性肝硬
化、门静脉高压、非酒精性脂肪肝炎、胆汁酸性腹泻、酒精 性肝炎、原发性硬化性胆管炎或
动脉粥样硬化的药物中有着潜在的应用前景。 然而目前螺环化合物在生物样品中浓度的
检测方法存在操作步骤复杂、分析周 期长以及生物基质取材单一等问题。

发明内容

[0004] 本发明针螺环化合物在生物样品中浓度的检测方法存在操作复杂、分析周期 长以及生物基质取材单一的问题，提供了一种螺环化合物的生物样品分析方法。 本检测方法
操作简单，分析快速，而且能应用于多种不同的生物基质。

[0005] 为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为：一种螺环化合物的 生物样品分析方法，该分析方法包括以下步骤：

[0006] (1)标准曲线溶液配制

[0007] 称取10.52mg螺环化合物对照品，置于100ml容量瓶中，加乙腈溶解并稀 释至刻度，摇匀后配制成0.1052mg/ml的标准溶液，再次加入乙腈稀释，配制 成浓度为1‑500ng/mL
的标准曲线溶液；

[0008] (2)质控溶液配制

[0009] 称取10.78mg螺环化合物对照品，置于100ml容量瓶中，加乙腈溶解并稀 释至刻度，摇匀后配制成0.1078mg/ml的质控溶液，再次加入乙腈稀释，配制 成浓度分别为2，40，
400ng/mL的质控溶液；

[0010] (3)内标溶液配制

[0011] 称取11.43mg特非那定对照品，置于100ml容量瓶中，加乙腈溶解并稀释 至刻度，摇匀后配制成0.1143mg/ml的内标溶液，再次加入乙腈稀释，配制成 浓度为100ng/mL的内
标溶液；

[0012] (4)生物样品前处理

[0013] 取生物样品，加入重量：体积比为1g:6mL的生理盐水匀浆，取100μL 匀浆后的生物样品至1.5mLEP管中，加入100μL浓度为100ng/mL的特非那 定特非那定内标溶液，混匀，加
入350‑550μL乙腈沉淀，涡旋1‑2分钟混匀，4℃， 13000‑15000rpm离心15‑20分钟，取200μL
上清液进样；

[0014] (5)LC‑MS/MS方法检测

[0015] 通过LC‑MS/MS方法检测，基于待测物与内标的峰面积比，通过归一化法 得到标准曲线，从而定量得到生物样品中螺环化合物的浓度。

[0016] 优选地，所述LC‑MS/MS方法的色谱及质谱条件如下：

[0017] 色谱条件：液相型号为Agilent 1260；色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB‑C8；流动相A相为5mM乙酸铵水溶液，流动相B相为0.1％甲酸乙腈溶 液，A:B＝10:90；

[0018] 质谱条件：API 4000(ESI源)质谱，负离子，离子喷射电压为5000V，温 度550℃，雾化气压力为55psi，解簇电压压力为60psi，气帘气体压力为30psi， 扫描方式为多重反应监
测(NMRMRM)。

[0019] 优选地，所述生物样品选自受试者的血液或血清样品。

[0020] 优选地，所述螺环化合物具有如下任一通式结构：

[0021]

[0022] 其中，

[0023] R1选自可选地被1‑3个R4取代的5‑10元芳环基或5‑10元杂芳环基；

[0024] R2选自氢、C1‑3烷基、卤代C1‑3烷基或C3‑6环烷基，其中，所述的C3‑6 环烷基可选地被一个或多个选自C1‑3烷基和卤代C1‑3烷基的基团所取代；

[0025] Z选自可选地被1‑3个R4取代的5‑10元芳环基或5‑10元杂芳环基；

[0026] R3选自‑CO2R5、‑CONR5R6、‑CONR5SO2R6、‑CONR5(CR7)1‑4CO2R5、 ‑SO2R5或四唑；

[0027] A选自N或CR8；

[0028] R4选自卤素、C1‑6烷基、卤代C1‑6烷基、C1‑6烷氧基、卤代C1‑6烷氧基 或C3‑6环烷基；

[0029] R5、R6和R7独立地选自氢、C1‑6烷基、卤代C1‑6烷基、C3‑6环烷基或 卤代C3‑6环烷基；

[0030] R8选自氢或羟基。

[0031] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各 较佳实例。

[0032] 本发明所用试剂和原料均市售可得。

[0033] 本发明的积极进步效果在于：本检测方法是通过高效、快速、灵敏的液相‑ 质谱联用系统(LC‑MS)方法对生物样品中的螺环化合物进行分析。此方法采 取了简单的有机溶剂
蛋白沉淀法对生物样本进行前处理，基于待测物与内标的 峰面积比，通过归一化法得到标
准曲线，从而定量得到生物样本中螺环化合物 的浓度。本法为螺环化合物在动物体内的药
代动力学中螺环化合物的检测提供 了简便的分析方法。

附图说明

[0034] 图1为螺环化合物及内标的色谱图，其中图1(A)为螺环化合物色谱图， 图1(B)为内标色谱图。

[0035] 图2为基于待测物与内标的峰面积比，通过归一化法得到的标准曲线。

具体实施方式

[0036] 以下的实施例用于为本领域中的普通技术人员提供有关如何实施和使用本 发明的完整披露和描述，并且这些例子并非意在对发明人所认为的发明范围进 行限制，亦非意
指下文的实验是被实施的全部实验而且是仅可实施的实验。实 验例中未注明具体条件的
实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条 件。

[0037] 本发明所使用的仪器和材料如下：

[0038] 仪器与试剂：高效液相色谱仪：Agilent 1260HPLC(美国安捷伦公司)，DAD 检测器(美国安捷伦公司)；色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB‑C8(250×4.6 mm，5μm，美国安
捷伦公司)；特非那定标准品(中检院)；乙腈、乙酸铵、及甲 酸乙腈溶液均购于国药集团。

[0039] 实施例1检测生物样品中螺环化合物浓度

[0040] (1)标准曲线溶液配制

[0041] 称取10.52mg螺环化合物对照品，置于100ml容量瓶中，加乙腈溶解并稀 释至刻度，摇匀后配制成0.1052mg/ml的标准溶液，再次加入乙腈稀释，配制 成浓度分别为1‑
500ng/mL的标准曲线溶液；

[0042] (2)质控溶液配制

[0043] 称取10.78mg螺环化合物对照品，置于100ml容量瓶中，加乙腈溶解并稀 释至刻度，摇匀后配制成0.1078mg/ml的质控溶液，再次加入乙腈稀释，配制 成浓度分别为2，40，
400ng/mL的质控溶液；

[0044] (3)内标溶液配制

[0045] 称取11.43mg特非那定对照品，置于100ml容量瓶中，加乙腈溶解并稀释 至刻度，摇匀后配制成0.1143mg/ml的内标溶液，再次加入乙腈稀释，配制成 浓度为100ng/mL的内
标溶液；

[0046] (4)生物样品前处理

[0047] 取生物样品，加入重量：体积比为1g:6mL的生理盐水匀浆，取100μL 匀浆后的生物样品至1.5mLEP管中，加入100μL浓度为100ng/mL的特非那 定内标溶液，混匀，加入350‑550
μL乙腈沉淀，涡旋1‑2分钟混匀，4℃，13000‑15000rpm离心15‑20分钟，取200μL上清液进样；

[0048] (5)LC‑MS/MS方法检测

[0049] 色谱条件：液相型号为Agilent 1260；色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB‑C8；流动相A相为5mM乙酸铵水溶液，流动相B相为0.1％甲酸乙腈溶 液，A:B＝10:90；

[0050] 质谱条件：API 4000(ESI源)质谱，负离子，离子喷射电压为5500V，温 度550℃，雾化气压力为55psi，解簇电压压力为60psi，气帘气体压力为20psi， 扫描方式为多重反应监
测(MRM)。

[0051] 源参数如表1所示：

[0052] 表1

[0053]

[0054] 化合物参数如表2所示：

[0055] 表2

[0056]

[0057] (6)色谱图获得

[0058] 经过上述步骤进样分析得到螺环化合物及内标的色谱图，如图1所示。其中 图1(A)为螺环化合物色谱图，图1(B)为内标色谱图。

[0059] (7)标准曲线

[0060] 基于待测物与内标的峰面积比，通过归一化法得到标准曲线，如图2所示。

[0061] (8)定量结果

[0062] 通过标准曲线定量得到生物样品中螺环化合物的浓度如表3所示：

[0063] 表3

[0064] 时间点(h) 浓度(ng/mL)0.25 457
0.5 339
1 307
4 116
6 57.1
8 19.9
12 2.14
24 BLOQ

[0065] 虽然在实施例中已经通过一般性说明、具体实施方式及试验对本发明作出 了详尽的描述，但在不偏离本发明核心的基础上，仍可以作出的修改或改进， 均属于本发明要
求保护的范围。