用于鉴定菜心品种真实性的引物组合

摘要

本发明公开了用于鉴定菜心品种真实性的引物组合。本发明所提供的引物组合由32个引物组组成。每个引物组由3条引物序列组成，用于扩增一个SNP位点。32个引物组中各个引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1至序列SEQ ID NO:144所示。本发明提供的引物组合可用于对菜心品种在种子或幼苗期进行早期鉴定，保证品种的真实性，切实保护生产者和育种家的权益，并为菜心种质资源和新品种保护提供技术支持。本发明提供的方法既可以对未知菜心品种进行鉴定，也可以对已知品种的真实性进行鉴定。本发明提供的方法具有高通量、准确、低成本、操作简单、节约人力、物力等有点，具有十分广阔的应用前景。

权利要求

1.引物组合甲，包括引物组1—引物组32；

所述引物组1由SEQ ID NO:1所示的正向引物01F1、SEQ ID NO:2所示的正向引物01F2和SEQ ID NO:3所示的反向引物01R组成；

所述引物组2由SEQ ID NO:4所示的正向引物02F1、SEQ ID NO:5所示的正向引物02F2和SEQ ID NO:6所示的反向引物02R组成；

所述引物组3由SEQ ID NO:7所示的正向引物03F1、SEQ ID NO:8所示的正向引物03F2和SEQ ID NO:9所示的反向引物03R组成；

所述引物组4由SEQ ID NO:10所示的正向引物04F1、SEQ ID NO:11所示的正向引物

04F2和SEQ ID NO:12所示的反向引物04R组成；

所述引物组5由SEQ ID NO:13所示的正向引物05F1、SEQ ID NO:14所示的正向引物

05F2和SEQ ID NO:15所示的反向引物05R组成；

所述引物组6由SEQ ID NO:16所示的正向引物06F1、SEQ ID NO:17所示的正向引物

06F2和SEQ ID NO:18所示的反向引物06R组成；

所述引物组7由SEQ ID NO:19所示的正向引物07F1、SEQ ID NO:20所示的正向引物

07F2和SEQ ID NO:21所示的反向引物07R组成；

所述引物组8由SEQ ID NO:22所示的正向引物08F1、SEQ ID NO:23所示的正向引物

08F2和SEQ ID NO:24所示的反向引物08R组成；

所述引物组9由SEQ ID NO:25所示的正向引物09F1、SEQ ID NO:26所示的正向引物

09F2和SEQ ID NO:27所示的反向引物09R组成；

所述引物组10由SEQ ID NO:28所示的正向引物10F1、SEQ ID NO:29所示的正向引物

10F2和SEQ ID NO:30所示的反向引物10R组成；

所述引物组11由SEQ ID NO:31所示的正向引物11F1、SEQ ID NO:32所示的正向引物

11F2和SEQ ID NO:33所示的反向引物11R组成；

所述引物组12由SEQ ID NO:34所示的正向引物12F1、SEQ ID NO:35所示的正向引物

12F2和SEQ ID NO:36所示的反向引物12R组成；

所述引物组13由SEQ ID NO:37所示的正向引物13F1、SEQ ID NO:38所示的正向引物

13F2和SEQ ID NO:39所示的反向引物13R组成；

所述引物组14由SEQ ID NO:40所示的正向引物14F1、SEQ ID NO:41所示的正向引物

14F2和SEQ ID NO:42所示的反向引物14R组成；

所述引物组15由SEQ ID NO:43所示的正向引物15F1、SEQ ID NO:44所示的正向引物

15F2和SEQ ID NO:45所示的反向引物15R组成；

所述引物组16由SEQ ID NO:46所示的正向引物16F1、SEQ ID NO:47所示的正向引物

16F2和SEQ ID NO:32所示的反向引物16R组成；

所述引物组17由SEQ ID NO:49所示的正向引物17F1、SEQ ID NO:50所示的正向引物

17F2和SEQ ID NO:51所示的反向引物17R组成；

所述引物组18由SEQ ID NO:52所示的正向引物18F1、SEQ ID NO:53所示的正向引物

18F2和SEQ ID NO:54所示的反向引物18R组成；

所述引物组19由SEQ ID NO:55所示的正向引物19F1、SEQ ID NO:56所示的正向引物

19F2和SEQ ID NO:57所示的反向引物19R组成；

所述引物组20由SEQ ID NO:58所示的正向引物20F1、SEQ ID NO:59所示的正向引物

20F2和SEQ ID NO:60所示的反向引物20R组成；

所述引物组21由SEQ ID NO:61所示的正向引物21F1、SEQ ID NO:62所示的正向引物

21F2和SEQ ID NO:63所示的反向引物21R组成；

所述引物组22由SEQ ID NO:64所示的正向引物22F1、SEQ ID NO:65所示的正向引物

22F2和SEQ ID NO:66所示的反向引物22R组成；

所述引物组23由SEQ ID NO:67所示的正向引物23F1、SEQ ID NO:68所示的正向引物

23F2和SEQ ID NO:69所示的反向引物23R组成；

所述引物组24由SEQ ID NO:70所示的正向引物24F1、SEQ ID NO:71所示的正向引物

24F2和SEQ ID NO:72所示的反向引物24R组成；

所述引物组25由SEQ ID NO:73所示的正向引物25F1、SEQ ID NO:74所示的正向引物

25F2和SEQ ID NO:75所示的反向引物25R组成；

所述引物组26由SEQ ID NO:76所示的正向引物26F1、SEQ ID NO:77所示的正向引物

26F2和SEQ ID NO:78所示的反向引物26R组成；

所述引物组27由SEQ ID NO:79所示的正向引物27F1、SEQ ID NO:80所示的正向引物

27F2和SEQ ID NO:81所示的反向引物27R组成；

所述引物组28由SEQ ID NO:82所示的正向引物28F1、SEQ ID NO:83所示的正向引物

28F2和SEQ ID NO:84所示的反向引物28R组成；

所述引物组29由SEQ ID NO:85所示的正向引物29F1、SEQ ID NO:86所示的正向引物

29F2和SEQ ID NO:87所示的反向引物29R组成；

所述引物组30由SEQ ID NO:88所示的正向引物30F1、SEQ ID NO:89所示的正向引物

30F2和SEQ ID NO:90所示的反向引物30R组成；

所述引物组31由SEQ ID NO:91所示的正向引物31F1、SEQ ID NO:92所示的正向引物

31F2和SEQ ID NO:93所示的反向引物31R组成；

所述引物组32由SEQ ID NO:94所示的正向引物32F1、SEQ ID NO:95所示的正向引物

32F2和SEQ ID NO:96所示的反向引物32R组成。

2.引物组合乙，包括引物组1—引物组32；

所述引物组1由SEQ ID NO:1自5’末端起第22至40位所示的正向引物01F1、SEQ ID NO:

2自5’末端起第22至42位所示的正向引物01F2和SEQ ID NO:3所示的反向引物01R组成；

所述引物组2由SEQ ID NO:4自5’末端起第22至44位所示的正向引物02F1、SEQ ID NO:

5自5’末端起第22至44位所示的正向引物02F2和SEQ ID NO:6所示的反向引物02R组成；

所述引物组3由SEQ ID NO:7自5’末端起第22至48位所示的正向引物03F1、SEQ ID NO:

8自5’末端起第22至49位所示的正向引物03F2和SEQ ID NO:9所示的反向引物03R组成；

所述引物组4由SEQ ID NO:10自5’末端起第22至51位所示的正向引物04F1、SEQ ID NO:11自5’末端起第22至52位所示的正向引物04F2和SEQ ID NO:12所示的反向引物04R组成；

所述引物组5由SEQ ID NO:13自5’末端起第22至51位所示的正向引物05F1、SEQ ID NO:14自5’末端起第22至52位所示的正向引物05F2和SEQ ID NO:15所示的反向引物05R组成；

所述引物组6由SEQ ID NO:16自5’末端起第22至46位所示的正向引物06F1、SEQ ID NO:17自5’末端起第22至46位所示的正向引物06F2和SEQ ID NO:18所示的反向引物06R组成；

所述引物组7由SEQ ID NO:19自5’末端起第22至49位所示的正向引物07F1、SEQ ID NO:20自5’末端起第22至48位所示的正向引物07F2和SEQ ID NO:21所示的反向引物07R组成；

所述引物组8由SEQ ID NO:22自5’末端起第22至45位所示的正向引物08F1、SEQ ID NO:23自5’末端起第22至43位所示的正向引物08F2和SEQ ID NO:24所示的反向引物08R组成；

所述引物组9由SEQ ID NO:25自5’末端起第22至46位所示的正向引物09F1、SEQ ID NO:26自5’末端起第22至44位所示的正向引物09F2和SEQ ID NO:27所示的反向引物09R组成；

所述引物组10由SEQ ID NO:28自5’末端起第22至43位所示的正向引物10F1、SEQ ID NO:29自5’末端起第22至43位所示的正向引物10F2和SEQ ID NO:30所示的反向引物10R组成；

所述引物组11由SEQ ID NO:31自5’末端起第22至49位所示的正向引物11F1、SEQ ID NO:32自5’末端起第22至48位所示的正向引物11F2和SEQ ID NO:33所示的反向引物11R组成；

所述引物组12由SEQ ID NO:34自5’末端起第22至46位所示的正向引物12F1、SEQ ID NO:35自5’末端起第22至44位所示的正向引物12F2和SEQ ID NO:36所示的反向引物12R组成；

所述引物组13由SEQ ID NO:37自5’末端起第22至47位所示的正向引物13F1、SEQ ID NO:38自5’末端起第22至48位所示的正向引物13F2和SEQ ID NO:39所示的反向引物13R组成；

所述引物组14由SEQ ID NO:40自5’末端起第22至48位所示的正向引物14F1、SEQ ID NO:41自5’末端起第22至50位所示的正向引物14F2和SEQ ID NO:42所示的反向引物14R组成；

所述引物组15由SEQ ID NO:43自5’末端起第22至45位所示的正向引物15F1、SEQ ID NO:44自5’末端起第22至44位所示的正向引物15F2和SEQ ID NO:45所示的反向引物15R组成；

所述引物组16由SEQ ID NO:46自5’末端起第22至40位所示的正向引物16F1、SEQ ID NO:47自5’末端起第22至41位所示的正向引物16F2和SEQ ID NO:32所示的反向引物16R组成；

所述引物组17由SEQ ID NO:49自5’末端起第22至43位所示的正向引物17F1、SEQ ID NO:50自5’末端起第22至42位所示的正向引物17F2和SEQ ID NO:51所示的反向引物17R组成；

所述引物组18由SEQ ID NO:52自5’末端起第22至51位所示的正向引物18F1、SEQ ID NO:53自5’末端起第22至53位所示的正向引物18F2和SEQ ID NO:54所示的反向引物18R组成；

所述引物组19由SEQ ID NO:55自5’末端起第22至43位所示的正向引物19F1、SEQ ID NO:56自5’末端起第22至42位所示的正向引物19F2和SEQ ID NO:57所示的反向引物19R组成；

所述引物组20由SEQ ID NO:58自5’末端起第22至45位所示的正向引物20F1、SEQ ID NO:59自5’末端起第22至46位所示的正向引物20F2和SEQ ID NO:60所示的反向引物20R组成；

所述引物组21由SEQ ID NO:61自5’末端起第22至45位所示的正向引物21F1、SEQ ID NO:62自5’末端起第22至46位所示的正向引物21F2和SEQ ID NO:63所示的反向引物21R组成；

所述引物组22由SEQ ID NO:64自5’末端起第22至43位所示的正向引物22F1、SEQ ID NO:65自5’末端起第22至45位所示的正向引物22F2和SEQ ID NO:66所示的反向引物22R组成；

所述引物组23由SEQ ID NO:67自5’末端起第22至46位所示的正向引物23F1、SEQ ID NO:68自5’末端起第22至43位所示的正向引物23F2和SEQ ID NO:69所示的反向引物23R组成；

所述引物组24由SEQ ID NO:70自5’末端起第22至46位所示的正向引物24F1、SEQ ID NO:71自5’末端起第22至43位所示的正向引物24F2和SEQ ID NO:72所示的反向引物24R组成；

所述引物组25由SEQ ID NO:73自5’末端起第22至51位所示的正向引物25F1、SEQ ID NO:74自5’末端起第22至51位所示的正向引物25F2和SEQ ID NO:75所示的反向引物25R组成；

所述引物组26由SEQ ID NO:76自5’末端起第22至46位所示的正向引物26F1、SEQ ID NO:77自5’末端起第22至45位所示的正向引物26F2和SEQ ID NO:78所示的反向引物26R组成；

所述引物组27由SEQ ID NO:79自5’末端起第22至50位所示的正向引物27F1、SEQ ID NO:80自5’末端起第22至51位所示的正向引物27F2和SEQ ID NO:81所示的反向引物27R组成；

所述引物组28由SEQ ID NO:82自5’末端起第22至43位所示的正向引物28F1、SEQ ID NO:83自5’末端起第22至44位所示的正向引物28F2和SEQ ID NO:84所示的反向引物28R组成；

所述引物组29由SEQ ID NO:85自5’末端起第22至48位所示的正向引物29F1、SEQ ID NO:86自5’末端起第22至47位所示的正向引物29F2和SEQ ID NO:87所示的反向引物29R组成；

所述引物组30由SEQ ID NO:88自5’末端起第22至46位所示的正向引物30F1、SEQ ID NO:89自5’末端起第22至47位所示的正向引物30F2和SEQ ID NO:90所示的反向引物30R组成；

所述引物组31由SEQ ID NO:91自5’末端起第22至43位所示的正向引物31F1、SEQ ID NO:92自5’末端起第22至44位所示的正向引物31F2和SEQ ID NO:93所示的反向引物31R组成；

所述引物组32由SEQ ID NO:94自5’末端起第22至47位所示的正向引物32F1、SEQ ID NO:95自5’末端起第22至46位所示的正向引物32F2和SEQ ID NO:96所示的反向引物32R组成。

3.权利要求1所述引物组合甲或权利要求2所述引物组合乙的应用，为x1）至x4）中的任一种：x1）制备用于鉴定179个菜心品种的试剂盒；x2）制备用于鉴别179个菜心品种真伪性的试剂盒；x3）鉴定179个菜心品种；x4）鉴别179个菜心品种真伪性；

所述179个菜心品种为金满田、红亮1号、珠海矮脚、翠绿1号、穗美888、迟80天、06秋保1号、利隆矮脚1号、联记柳叶、东莞尖叶、长合70、名优尖叶、金苗美绿702、长合、佳信、黄心

701、金顺利、红亮2号、红亮3号、广研菜场、金韩、农普绿宝、广绿60、圣达新西兰、欣农50、欣农极品菜心王、红亮50、红亮超级、范记50、日本甜脆、利隆矮脚、利隆矮脚45、一哥白沙、坤记菜心、广研3号、坤记菜心王、菜心4号、19号菜心、19号早菜心、兴田粗苔6号、金韩春梅、金韩春早、金韩冬竹、农家乐8、农家乐、华绿中花油青、惟勤全年粗条、美青一号、坡头31号、旺田翠绿、香港油青、冬竹菜心、广良油青、广良早油青、粤友迟心1号、金韩秋菊、新世纪20号、农鑫抗病油青旺、农鑫抗病油青、09A保、日本油美1号、洲008柄白、广东1只花、288甜菜心、王中王抗热、宝丰矮脚、06秋保‑A、伟兴黄叶四九、金利达19号、农悦49、纯白梗菜心、农鑫夏绿、兴田油青25、伟雄A‑3、绿冠608、新苗002、新苗T28、超级菜心皇、绿满园香脆、星原极早、民安日本、12保、13A9‑保、12菜心1 号、12菜心3号、青梗A、青梗B、14A9‑保‑22号、45天菜心、青翠菜心、尖叶49菜心、佰顺2号、双盈80天、49‑19菜心、日本60丛、桂华特青70天甜菜心、圣农粗条、湘蔬脆嫩四九、揭研31号油青甜菜心、14广州菜心、广府2号、06秋保‑B、四九黄菜心、广研美绿、天牌、恒利达澳选快大甜菜心、农普油绿701、金韩70天菜心、金韩港种70天油青、利隆油青矮脚70天、南蔬极品70天甜菜心、坡头70天油青菜心、伟兴三元里、青翠701、油绿702菜心、联记东莞白沙、特选80天特青菜心、伟星80天尖叶特青、爱普农超级迟心808、爱普农超级迟心809、碧绿80天油青甜菜心、翠绿、翠绿80天菜心、广海超级80天、利坚802、利坚805、联记东莞坡头、油绿801、粤友超靓、伟雄28号菜心、益农80天特青菜心、金韩广府青、林忠民大种迟花赤叶、赤叶翡翠大花菜心、金韩赤叶迟花菜心、丰满迟花2号甜菜心、伟兴迟花、15广州菜心‑10号、15大种、15大种80、62036x62013 RaaC0.5xC2030、PI175054 Aaa‑1 BAREPOP 15376、Aaa‑1、White Stemmed Taitsai、中心苔菜、エウサィタイ、荆楚牌九月鲜红菜苔、早白菜苔、红金秋菜薹、香港新种49菜心、香港宝青60天菜心、迟心2 号、八十天油青菜心、宝青50天油心、金秋红二号、迟花粗苔特青菜苔、019菜心×紫芥菜、20菜心×紫芥菜、

14A‑P2‑21菜心×紫芥菜、CMS1.菜心、CMS2.菜心、CMS3.菜心、CMS4.菜心、CMS5.菜心、CMS6.

菜心、CMS7.菜心、CMS8.菜心、(07‑882×abc3‑1)2、019 菜心、小花菜、16E9‑16②‑24、17E9‑

22③、16E9‑16②‑24×16E9‑13②‑21、16E9‑49①‑24×16E9‑22②‑21、丸叶壬生菜77‑44、千筋京菜、广岛菜、壬生菜和小松菜。

4.一种鉴定待测菜心属于权利要求3中所述179个菜心品种中哪个品种的方法，包括如下步骤：分别检测待测菜心和179个菜心品种基于32个SNP位点的基因型，然后进行如下判断：如果待测菜心基于32个SNP位点的基因型和179个菜心品种中某品种基于32个SNP位点的基因型完全一致，则待测菜心与该菜心品种属于同一个品种；如果待测菜心基于32个SNP位点的基因型和179个菜心品种中各个品种基于32个SNP位点的基因型均不一致，则待测菜心与179个菜心品种的品种均不相同；

32个SNP位点如下：BcSNP192位点为A07号染色体上的第1932762位核苷酸；BcSNP187位点为A06号染色体上的第21770504位核苷酸；BcSNP156位点为A04号染色体上的第17750551位核苷酸；BcSNP149位点为A04号染色体上的第2050068位核苷酸；BcSNP130位点为A02号染色体上的第26102092位核苷酸；BcSNP106位点为A10号染色体上的第5326657位核苷酸；

BcSNP105位点为A10号染色体上的第3142139位核苷酸；BcSNP103位点为A10号染色体上的第1904176位核苷酸；BcSNP095位点为A09号染色体上的第16245846位核苷酸；BcSNP093位点为A09号染色体上的第5980466位核苷酸；BcSNP091位点为A09号染色体上的第130203位核苷酸；BcSNP088位点为A08号染色体上的第14490787位核苷酸；BcSNP082位点为A08号染色体上的第2403185位核苷酸；BcSNP081位点为A08号染色体上的第1596655位核苷酸；

BcSNP080位点为A08号染色体上的第808047位核苷酸；BcSNP078位点为A07号染色体上的第

24737647位核苷酸；BcSNP069位点为A07号染色体上的第4060769位核苷酸；BcSNP066位点为A06号染色体上的第23263524位核苷酸；BcSNP057位点为A06号染色体上的第2907823位核苷酸；BcSNP053位点为A05号染色体上的第21415504位核苷酸；BcSNP052位点为A05号染色体上的第19467019位核苷酸；BcSNP050位点为A05号染色体上的第13449634位核苷酸；

BcSNP035位点为A04号染色体上的第892601位核苷酸；BcSNP034位点为A04号染色体上的第

63723位核苷酸；BcSNP027位点为A03号染色体上的第13165976位核苷酸；BcSNP026位点为A03号染色体上的第7169510位核苷酸；BcSNP024位点为A03号染色体上的第3555387位核苷酸；BcSNP019位点为A02号染色体上的第17613980位核苷酸；BcSNP016位点为A02号染色体上的第13459261位核苷酸；BcSNP007位点为A01号染色体上的第16607628位核苷酸；

BcSNP004位点为A01号染色体上的第7717994位核苷酸；BcSNP002位点为A01号染色体上的第4273285位核苷酸。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述检测待测菜心和179个菜心品种基于32个SNP位点的基因型的步骤如下：

（1）分别以待测菜心的基因组DNA和179个菜心品种的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1所述引物组合甲中引物组的进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

（2）完成步骤（1）后，采用仪器检测PCR扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测菜心和179个菜心品种基于32个SNP位点的基因型。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述检测待测菜心和179个菜心品种基于32个SNP位点的基因型的步骤如下：

（1）分别以待测菜心的基因组DNA和179个菜心品种的基因组DNA为模板，分别采用权利要求2所述引物组合乙中引物组的进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

（2）取步骤（1）得到的PCR扩增产物，测序；

（3）根据步骤（2）得到的测序结果，获得待测菜心和179个菜心品种基于32个SNP位点的基因型。

7.一种鉴定待测菜心属于权利要求3中所述179个菜心品种中哪个品种的方法，包括如下步骤：

（1）以待测菜心的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1所述引物组合甲中引物组的进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；以标准菜心品种群中的各个菜心品种的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1所述引物组合甲中引物组的进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述标准菜心品种群由179个菜心品种组成；

（2）将待测菜心得到的各个PCR扩增产物与每个标准菜心品种对应的PCR扩增产物进行聚类分析，聚类分析中待测菜心与哪个标准菜心品种为同一类，该待测菜心与该标准菜心品种即属于同一个品种。

说明书

用于鉴定菜心品种真实性的引物组合

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及用于鉴定菜心品种真实性的引物组合，该方法可应用于生物技术推广服务，为菜心种质资源和品种保护提供技术支持。

背景技术

[0002] 菜心是我国南方的特产蔬菜之一，又名菜薹。菜心，十字花科芸薹属白菜亚种，一年生或二年生草本植物，被誉为“菜中之后”和“蔬品之冠”。菜心在广东、广西等地为大陆性
蔬菜，在广东地区可一年四季栽培，常年播种面积很大。据2012年广州市菜办统计，全市菜
心年播种面积达25.2万亩次，菜心的播种面积约占叶菜栽培面积的24％。近年来，随着栽培
技术的不断改良，菜心在湖南、江西、浙江、福建、北京、上海、南京等地的种植面积也不断扩
大，成为市民餐桌上的新宠。菜心产业的发展为实现农民增收和提高居民的生活水平发挥
了重要作用。目前，市场上的菜心品种数量已超过100个。由于地区之间品种审定相互不协
调，菜心的品种管理未能有效的进行登记记录。菜心育种企业大小不一且分散，存在较多假
冒伪劣品种，加之良种生产基地管理不严，盗育、套购品种、同名异种现象现象严重，种子生
产质量事故时有发生。因此，建立一套基于DNA指纹有效进行菜心品种真实性鉴定的标准显
得尤为重要。

[0003] 近年来，SNP作为第三代分子标记，以其数量多、分布广、遗传稳定等优点受到广泛重视。随着测序技术的发展和测序成本的降低，获得大量菜心重测序数据。基于分析菜心的
变异组信息，可以挖掘更加稳定高效的SNP位点。采用等位基因竞争性特异PCR法，可以开发
其特异性引物，最终获得样本在SNP位点的基因型。

[0004] 目前，我国还没有专用于菜心品种鉴定的DNA分子标记方法。目前，其它作物多采用SSR分子标记，但是SSR检测方式极易导致不真实、假阳性、假阴性结果；不能适应自动化、
高通量、大规模的要求。与SSR标记相比，SNP具有多个方面的优势：变异清晰稳定容易检测，
真实性准确性高；每个作物均有数以百万计SNP可供选择；适宜于高通量、低成本、自动化快
速检测；SNP分型无需对照品种，以准确的碱基呈现结果，可减少人为误差。

发明内容

[0005] 本发明的目的是鉴定菜心品种，尤其是179个菜心品种。

[0006] 本发明首先保护SNP位点组合，可包括菜心基因组的32个SNP位点；所述32个SNP位点如下：BcSNP192位点为A07号染色体上的第1932762位核苷酸；BcSNP187位点为A06号染色
体上的第21770504位核苷酸；BcSNP156位点为A04号染色体上的第17750551位核苷酸；
BcSNP149位点为A04号染色体上的第2050068位核苷酸；BcSNP130位点为A02号染色体上的
第26102092位核苷酸；BcSNP106位点为A10号染色体上的第5326657位核苷酸；BcSNP105位
点为A10号染色体上的第3142139位核苷酸；BcSNP103位点为A10号染色体上的第1904176位
核苷酸；BcSNP095位点为A09号染色体上的第16245846位核苷酸；BcSNP093位点为A09号染
色体上的第5980466位核苷酸；BcSNP091位点为A09号染色体上的第130203位核苷酸；
BcSNP088位点为A08号染色体上的第14490787位核苷酸；BcSNP082位点为A08号染色体上的
第2403185位核苷酸；BcSNP081位点为A08号染色体上的第1596655位核苷酸；BcSNP080位点
为A08号染色体上的第808047位核苷酸；BcSNP078位点为A07号染色体上的第24737647位核
苷酸；BcSNP069位点为A07号染色体上的第4060769位核苷酸；BcSNP066位点为A06号染色体
上的第23263524位核苷酸；BcSNP057位点为A06号染色体上的第2907823位核苷酸；
BcSNP053位点为A05号染色体上的第21415504位核苷酸；BcSNP052位点为A05号染色体上的
第19467019位核苷酸；BcSNP050位点为A05号染色体上的第13449634位核苷酸；BcSNP035位
点为A04号染色体上的第892601位核苷酸；BcSNP034位点为A04号染色体上的第63723位核
苷酸；BcSNP027位点为A03号染色体上的第13165976位核苷酸；BcSNP026位点为A03号染色
体上的第7169510位核苷酸；BcSNP024位点为A03号染色体上的第3555387位核苷酸；
BcSNP019位点为A02号染色体上的第17613980位核苷酸；BcSNP016位点为A02号染色体上的
第13459261位核苷酸；BcSNP007位点为A01号染色体上的第16607628位核苷酸；BcSNP004位
点为A01号染色体上的第7717994位核苷酸；BcSNP002位点为A01号染色体上的第4273285位
核苷酸。

[0007] 所述SNP位点组合具体可由上述32个SNP位点组成。

[0008] 本发明还保护引物组合，可包括用于扩增所述BcSNP002位点的引物组1、用于扩增所述BcSNP004位点的引物组2、用于扩增所述BcSNP007位点的引物组3、用于扩增所述
BcSNP016位点的引物组4、用于扩增所述BcSNP019位点的引物组5、用于扩增所述BcSNP130
位点的引物组6、用于扩增所述BcSNP024位点的引物组7、用于扩增所述BcSNP026位点的引
物组8、用于扩增所述BcSNP027位点的引物组9、用于扩增所述BcSNP034位点的引物组10、用
于扩增所述BcSNP035位点的引物组11、用于扩增所述BcSNP149位点的引物组12、用于扩增
所述BcSNP156位点的引物组13、用于扩增所述BcSNP050位点的引物组14、用于扩增所述
BcSNP052位点的引物组15、用于扩增所述BcSNP053位点的引物组16、用于扩增所述
BcSNP057位点的引物组17、用于扩增所述BcSNP187位点的引物组18、用于扩增所述
BcSNP066位点的引物组19、用于扩增所述BcSNP192位点的引物组20、用于扩增所述
BcSNP069位点的引物组21、用于扩增所述BcSNP078位点的引物组22、用于扩增所述
BcSNP080位点的引物组23、用于扩增所述BcSNP081位点的引物组24、用于扩增所述
BcSNP082位点的引物组25、用于扩增所述BcSNP088位点的引物组26、用于扩增所述
BcSNP091位点的引物组27、用于扩增所述BcSNP093位点的引物组28、用于扩增所述
BcSNP095位点的引物组29、用于扩增所述BcSNP103位点的引物组30、用于扩增所述
BcSNP105位点的引物组31和用于扩增所述BcSNP106位点的引物组32。

[0009] 所述引物组合中，所述引物组1可由SEQ ID NO:1所示的正向引物01F1、SEQ ID NO:2所示的正向引物01F2和SEQ ID NO:3所示的反向引物01R组成。所述引物组2可由SEQ 
ID NO:4所示的正向引物02F1、SEQ ID NO:5所示的正向引物02F2和SEQ ID NO:6所示的反
向引物02R组成。所述引物组3可由SEQ ID NO:7所示的正向引物03F1、SEQ ID NO:8所示的
正向引物03F2和SEQ ID NO:9所示的反向引物03R组成。所述引物组4可由SEQ ID NO:10所
示的正向引物04F1、SEQ ID NO:11所示的正向引物04F2和SEQ ID NO:12所示的反向引物
04R组成。所述引物组5可由SEQ ID NO:13所示的正向引物05F1、SEQ ID NO:14所示的正向
引物05F2和SEQ ID NO:15所示的反向引物05R组成。所述引物组6可由SEQ ID NO:16所示的
正向引物06F1、SEQ ID NO:17所示的正向引物06F2和SEQ ID NO:18所示的反向引物06R组
成。所述引物组7可由SEQ ID NO:19所示的正向引物07F1、SEQ ID NO:20所示的正向引物
07F2和SEQ ID NO:21所示的反向引物07R组成。所述引物组8可由SEQ ID NO:22所示的正向
引物08F1、SEQ ID NO:23所示的正向引物08F2和SEQ ID NO:24所示的反向引物08R组成。所
述引物组9可由SEQ ID NO:25所示的正向引物09F1、SEQ ID NO:26所示的正向引物09F2和
SEQ ID NO:27所示的反向引物09R组成。所述引物组10可由SEQ ID NO:28所示的正向引物
10F1、SEQ ID NO:29所示的正向引物10F2和SEQ ID NO:30所示的反向引物10R组成。所述引
物组11可由SEQ ID NO:31所示的正向引物11F1、SEQ ID NO:32所示的正向引物11F2和SEQ 
ID NO:33所示的反向引物11R组成。所述引物组12可由SEQ ID NO:34所示的正向引物12F1、
SEQ ID NO:35所示的正向引物12F2和SEQ ID NO:36所示的反向引物12R组成。所述引物组
13可由SEQ ID NO:37所示的正向引物13F1、SEQ ID NO:38所示的正向引物13F2和SEQ ID 
NO:39所示的反向引物13R组成。所述引物组14可由SEQ ID NO:40所示的正向引物14F1、SEQ 
ID NO:41所示的正向引物14F2和SEQ ID NO:42所示的反向引物14R组成。所述引物组15可
由SEQ ID NO:43所示的正向引物15F1、SEQ ID NO:44所示的正向引物15F2和SEQ ID NO:45
所示的反向引物15R组成。所述引物组16可由SEQ ID NO:46所示的正向引物16F1、SEQ ID 
NO:47所示的正向引物16F2和SEQ ID NO:32所示的反向引物16R组成。所述引物组17可由
SEQ ID NO:49所示的正向引物17F1、SEQ ID NO:50所示的正向引物17F2和SEQ ID NO:51所
示的反向引物17R组成。所述引物组18可由SEQ ID NO:52所示的正向引物18F1、SEQ ID NO:
53所示的正向引物18F2和SEQ ID NO:54所示的反向引物18R组成。所述引物组19可由SEQ 
ID NO:55所示的正向引物19F1、SEQ ID NO:56所示的正向引物19F2和SEQ ID NO:57所示的
反向引物19R组成。所述引物组20可由SEQ ID NO:58所示的正向引物20F1、SEQ ID NO:59所
示的正向引物20F2和SEQ ID NO:60所示的反向引物20R组成。所述引物组21可由SEQ ID 
NO:61所示的正向引物21F1、SEQ ID NO:62所示的正向引物21F2和SEQ ID NO:63所示的反
向引物21R组成。所述引物组22可由SEQ ID NO:64所示的正向引物22F1、SEQ ID NO:65所示
的正向引物22F2和SEQ ID NO:66所示的反向引物22R组成。所述引物组23可由SEQ ID NO:
67所示的正向引物23F1、SEQ ID NO:68所示的正向引物23F2和SEQ ID NO:69所示的反向引
物23R组成。所述引物组24可由SEQ ID NO:70所示的正向引物24F1、SEQ ID NO:71所示的正
向引物24F2和SEQ ID NO:72所示的反向引物24R组成。所述引物组25可由SEQ ID NO:73所
示的正向引物25F1、SEQ ID NO:74所示的正向引物25F2和SEQ ID NO:75所示的反向引物
25R组成。所述引物组26可由SEQ ID NO:76所示的正向引物26F1、SEQ ID NO:77所示的正向
引物26F2和SEQ ID NO:78所示的反向引物26R组成。所述引物组27可由SEQ ID NO:79所示
的正向引物27F1、SEQ ID NO:80所示的正向引物27F2和SEQ ID NO:81所示的反向引物27R
组成。所述引物组28可由SEQ ID NO:82所示的正向引物28F1、SEQ ID NO:83所示的正向引
物28F2和SEQ ID NO:84所示的反向引物28R组成。所述引物组29可由SEQ ID NO:85所示的
正向引物29F1、SEQ ID NO:86所示的正向引物29F2和SEQ ID NO:87所示的反向引物29R组
成。所述引物组30可由SEQ ID NO:88所示的正向引物30F1、SEQ ID NO:89所示的正向引物
30F2和SEQ ID NO:90所示的反向引物30R组成。所述引物组31可由SEQ ID NO:91所示的正
向引物31F1、SEQ ID NO:92所示的正向引物31F2和SEQ ID NO:93所示的反向引物31R组成。
所述引物组32可由SEQ ID NO:94所示的正向引物32F1、SEQ ID NO:95所示的正向引物32F2
和SEQ ID NO:96所示的反向引物32R组成。

[0010] 所述引物组合中，所述引物组1可由SEQ ID NO:1自5’末端起第22至40位所示的正向引物01F1、SEQ ID NO:2自5’末端起第22至42位所示的正向引物01F2和SEQ ID NO:3所示
的反向引物01R组成。所述引物组2可由SEQ ID NO:4自5’末端起第22至44位所示的正向引
物02F1、SEQ ID NO:5自5’末端起第22至44位所示的正向引物02F2和SEQ ID NO:6所示的反
向引物02R组成。所述引物组3可由SEQ ID NO:7自5’末端起第22至48位所示的正向引物
03F1、SEQ ID NO:8自5’末端起第22至49位所示的正向引物03F2和SEQ ID NO:9所示的反向
引物03R组成。所述引物组4可由SEQ ID NO:10自5’末端起第22至51位所示的正向引物
04F1、SEQ ID NO:11自5’末端起第22至52位所示的正向引物04F2和SEQ ID NO:12所示的反
向引物04R组成。所述引物组5可由SEQ ID NO:13自5’末端起第22至51位所示的正向引物
05F1、SEQ ID NO:14自5’末端起第22至52位所示的正向引物05F2和SEQ ID NO:15所示的反
向引物05R组成。所述引物组6可由SEQ ID NO:16自5’末端起第22至46位所示的正向引物
06F1、SEQ ID NO:17自5’末端起第22至46位所示的正向引物06F2和SEQ ID NO:18所示的反
向引物06R组成。所述引物组7可由SEQ ID NO:19自5’末端起第22至49位所示的正向引物
07F1、SEQ ID NO:20自5’末端起第22至48位所示的正向引物07F2和SEQ ID NO:21所示的反
向引物07R组成。所述引物组8可由SEQ ID NO:22自5’末端起第22至45位所示的正向引物
08F1、SEQ ID NO:23自5’末端起第22至43位所示的正向引物08F2和SEQ ID NO:24所示的反
向引物08R组成。所述引物组9可由SEQ ID NO:25自5’末端起第22至46位所示的正向引物
09F1、SEQ ID NO:26自5’末端起第22至44位所示的正向引物09F2和SEQ ID NO:27所示的反
向引物09R组成。所述引物组10可由SEQ ID NO:28自5’末端起第22至43位所示的正向引物
10F1、SEQ ID NO:29自5’末端起第22至43位所示的正向引物10F2和SEQ ID NO:30所示的反
向引物10R组成。所述引物组11可由SEQ ID NO:31自5’末端起第22至49位所示的正向引物
11F1、SEQ ID NO:32自5’末端起第22至48位所示的正向引物11F2和SEQ ID NO:33所示的反
向引物11R组成。所述引物组12可由SEQ ID NO:34自5’末端起第22至46位所示的正向引物
12F1、SEQ ID NO:35自5’末端起第22至44位所示的正向引物12F2和SEQ ID NO:36所示的反
向引物12R组成。所述引物组13可由SEQ ID NO:37自5’末端起第22至47位所示的正向引物
13F1、SEQ ID NO:38自5’末端起第22至48位所示的正向引物13F2和SEQ ID NO:39所示的反
向引物13R组成。所述引物组14可由SEQ ID NO:40自5’末端起第22至48位所示的正向引物
14F1、SEQ ID NO:41自5’末端起第22至50位所示的正向引物14F2和SEQ ID NO:42所示的反
向引物14R组成。所述引物组15可由SEQ ID NO:43自5’末端起第22至45位所示的正向引物
15F1、SEQ ID NO:44自5’末端起第22至44位所示的正向引物15F2和SEQ ID NO:45所示的反
向引物15R组成。所述引物组16可由SEQ ID NO:46自5’末端起第22至40位所示的正向引物
16F1、SEQ ID NO:47自5’末端起第22至41位所示的正向引物16F2和SEQ ID NO:32所示的反
向引物16R组成。所述引物组17可由SEQ ID NO:49自5’末端起第22至43位所示的正向引物
17F1、SEQ ID NO:50自5’末端起第22至42位所示的正向引物17F2和SEQ ID NO:51所示的反
向引物17R组成。所述引物组18可由SEQ ID NO:52自5’末端起第22至51位所示的正向引物
18F1、SEQ ID NO:53自5’末端起第22至53位所示的正向引物18F2和SEQ ID NO:54所示的反
向引物18R组成。所述引物组19可由SEQ ID NO:55自5’末端起第22至43位所示的正向引物
19F1、SEQ ID NO:56自5’末端起第22至42位所示的正向引物19F2和SEQ ID NO:57所示的反
向引物19R组成。所述引物组20可由SEQ ID NO:58自5’末端起第22至45位所示的正向引物
20F1、SEQ ID NO:59自5’末端起第22至46位所示的正向引物20F2和SEQ ID NO:60所示的反
向引物20R组成。所述引物组21可由SEQ ID NO:61自5’末端起第22至45位所示的正向引物
21F1、SEQ ID NO:62自5’末端起第22至46位所示的正向引物21F2和SEQ ID NO:63所示的反
向引物21R组成。所述引物组22可由SEQ ID NO:64自5’末端起第22至43位所示的正向引物
22F1、SEQ ID NO:65自5’末端起第22至45位所示的正向引物22F2和SEQ ID NO:66所示的反
向引物22R组成。所述引物组23可由SEQ ID NO:67自5’末端起第22至46位所示的正向引物
23F1、SEQ ID NO:68自5’末端起第22至43位所示的正向引物23F2和SEQ ID NO:69所示的反
向引物23R组成。所述引物组24可由SEQ ID NO:70自5’末端起第22至46位所示的正向引物
24F1、SEQ ID NO:71自5’末端起第22至43位所示的正向引物24F2和SEQ ID NO:72所示的反
向引物24R组成。所述引物组25可由SEQ ID NO:73自5’末端起第22至51位所示的正向引物
25F1、SEQ ID NO:74自5’末端起第22至51位所示的正向引物25F2和SEQ ID NO:75所示的反
向引物25R组成。所述引物组26可由SEQ ID NO:76自5’末端起第22至46位所示的正向引物
26F1、SEQ ID NO:77自5’末端起第22至45位所示的正向引物26F2和SEQ ID NO:78所示的反
向引物26R组成。所述引物组27可由SEQ ID NO:79自5’末端起第22至50位所示的正向引物
27F1、SEQ ID NO:80自5’末端起第22至51位所示的正向引物27F2和SEQ ID NO:81所示的反
向引物27R组成。所述引物组28可由SEQ ID NO:82自5’末端起第22至43位所示的正向引物
28F1、SEQ ID NO:83自5’末端起第22至44位所示的正向引物28F2和SEQ ID NO:84所示的反
向引物28R组成。所述引物组29可由SEQ ID NO:85自5’末端起第22至48位所示的正向引物
29F1、SEQ ID NO:86自5’末端起第22至47位所示的正向引物29F2和SEQ ID NO:87所示的反
向引物29R组成。所述引物组30可由SEQ ID NO:88自5’末端起第22至46位所示的正向引物
30F1、SEQ ID NO:89自5’末端起第22至47位所示的正向引物30F2和SEQ ID NO:90所示的反
向引物30R组成。所述引物组31可由SEQ ID NO:91自5’末端起第22至43位所示的正向引物
31F1、SEQ ID NO:92自5’末端起第22至44位所示的正向引物31F2和SEQ ID NO:93所示的反
向引物31R组成。所述引物组32可由SEQ ID NO:94自5’末端起第22至47位所示的正向引物
32F1、SEQ ID NO:95自5’末端起第22至46位所示的正向引物32F2和SEQ ID NO:96所示的反
向引物32R组成。

[0011] 上述任一所述引物组中，名称中含有“F1”的引物、名称中含有“F2”的引物和名称中含有“R”的引物的摩尔比具体可为2:2:5。

[0012] 上述任一所述引物组合具体可由所述引物组1—所述引物组32组成。

[0013] 上文中，序列表中序列1自5′末端起第1至21位所示的核苷酸序列为荧光标签序列(即FAM荧光标签序列)，荧光信号具体为蓝色。序列表中序列2自5′末端起第1至21位所示的
核苷酸序列也为荧光标签序列(即HEX荧光标签序列)，荧光信号具体为红色。

[0014] 含有上述任一所述引物组合的试剂盒也属于本发明的保护范围。

[0015] 所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的制备方法包括将上述任一所述引物组中的各条引物分别单独包装的步骤。

[0016] 所述试剂盒的应用也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的应用可为x3)或x4)：x3)鉴定菜心品种；x4)鉴别菜心品种真伪性。

[0017] 本发明还保护上述任一所述SNP位点组合或上述任一所述引物组合的应用，可为x1)至x4)中的任一种：x1)制备用于鉴定菜心品种的试剂盒；x2)制备用于鉴别菜心品种真
伪性的试剂盒；x3)鉴定菜心品种；x4)鉴别菜心品种真伪性。

[0018] 本发明还保护一种鉴定待测菜心属于179个菜心品种中哪个品种的方法，包括如下步骤：分别检测待测菜心和179个菜心品种基于所述32个SNP位点的基因型，然后进行如
下判断：如果待测菜心基于所述32个SNP位点的基因型和179个菜心品种中某品种基于所述
32个SNP位点的基因型完全一致，则待测菜心与该菜心品种属于同一个品种；如果待测菜心
基于所述32个SNP位点的基因型和179个菜心品种中各个品种基于所述32个SNP位点的基因
型均不一致，则待测菜心与179个菜心品种的品种均不相同。

[0019] 上述方法中，所述“检测待测菜心和179个菜心品种基于所述32个SNP位点的基因型”的步骤可如下：

[0020] (1)分别以待测菜心的基因组DNA和179个菜心品种的基因组DNA为模板，分别采用上述任一所述引物组合中引物组的进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

[0021] (2)完成步骤(1)后，采用仪器检测PCR扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测菜心和179个菜心品种基于所述32个SNP位点的基因型。

[0022] 上述方法中，所述“检测检测待测菜心和179个菜心品种基于所述32个SNP位点的基因型”的步骤可如下：

[0023] (1)分别以待测菜心的基因组DNA和179个菜心品种的基因组DNA为模板，分别采用上述任一所述引物组合中引物组的进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

[0024] (2)取步骤(1)得到的PCR扩增产物，测序；

[0025] (3)根据步骤(2)得到的测序结果，获得待测菜心和179个菜心品种基于所述32个SNP位点的基因型。

[0026] 本发明还保护一种鉴定待测菜心属于179个菜心品种中哪个品种的方法，可包括如下步骤：

[0027] (1)以待测菜心的基因组DNA为模板，分别采用上述任一所述引物组合中引物组的进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；以标准菜心品种群中的各个菜心品种的基因组DNA为模
板，分别采用上述任一所述引物组合中引物组的进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述标准
菜心品种群由179个菜心品种组成；

[0028] (2)将待测菜心得到的各个PCR扩增产物与每个标准菜心品种对应的PCR扩增产物进行聚类分析，聚类分析中待测菜心与哪个标准菜心品种为同一类，该待测菜心与该标准
菜心品种即属于同一个品种。

[0029] 上述任一所述179个菜心品种可为金满田、红亮1号、珠海矮脚、翠绿1号、穗美888、迟80天、06秋保1号、利隆矮脚1号、联记柳叶、东莞尖叶、长合70、名优尖叶、金苗美绿702、长
合、佳信、黄心701、金顺利、红亮2号、红亮3号、广研菜场、金韩、农普绿宝、广绿60、圣达新西
兰、欣农50、欣农极品菜心王、红亮50、红亮超级、范记50、日本甜脆、利隆矮脚、利隆矮脚45、
一哥白沙、坤记菜心、广研3号、坤记菜心王、菜心4号、19号菜心、19号早菜心、兴田粗苔6号、
金韩春梅、金韩春早、金韩冬竹、农家乐8、农家乐、华绿中花油青、惟勤全年粗条、美青一号、
坡头31号、旺田翠绿、香港油青、冬竹菜心、广良油青、广良早油青、粤友迟心1号、金韩秋菊、
新世纪20号、农鑫抗病油青旺、农鑫抗病油青、09A保、日本油美1号、洲008柄白、广东1只花、
288甜菜心、王中王抗热、宝丰矮脚、06秋保‑A、伟兴黄叶四九、金利达19号、农悦49、纯白梗
菜心、农鑫夏绿、兴田油青25、伟雄A‑3、绿冠608、新苗002、新苗T28、超级菜心皇、绿满园香
脆、星原极早、民安日本、12保、13A9‑保、12菜心1号、12菜心3号、青梗A、青梗B、14A9‑保‑22
号、45天菜心、青翠菜心、尖叶49菜心、佰顺2号、双盈80天、49‑19菜心、日本60丛、桂华特青
70天甜菜心、圣农粗条、湘蔬脆嫩四九、揭研31号油青甜菜心、14广州菜心、广府2号、06秋
保‑B、四九黄菜心、广研美绿、天牌、恒利达澳选快大甜菜心、农普油绿701、金韩70天菜心、
金韩港种70天油青、利隆油青矮脚70天、南蔬极品70天甜菜心、坡头70天油青菜心、伟兴三
元里、青翠701、油绿702菜心、联记东莞白沙、特选80天特青菜心、伟星80天尖叶特青、爱普
农超级迟心808、爱普农超级迟心809、碧绿80天油青甜菜心、翠绿、翠绿80天菜心、广海超级
80天、利坚802、利坚805、联记东莞坡头、油绿801、粤友超靓、伟雄28号菜心、益农80天特青
菜心、金韩广府青、林忠民大种迟花赤叶、赤叶翡翠大花菜心、金韩赤叶迟花菜心、丰满迟花
2号甜菜心、伟兴迟花、15广州菜心‑10号、15大种、15大种80、62036x62013 RaaC0.5xC2030、
PI175054Aaa‑1 BAREPOP 15376、Aaa‑1,1976 FAST FLOWEING PO、White Stemmed 
Taitsai、中心苔菜、エウサィタイ、荆楚牌九月鲜红菜苔、早白菜苔、红金秋菜薹、香港新种
49菜心、香港宝青60天菜心、迟心2号、八十天油青菜心、宝青50天油心、金秋红二号、迟花粗
苔特青菜苔、019菜心(平)×紫芥菜、20菜心(平)×紫芥菜、14A‑P2‑21菜心×紫芥菜、CMS1.
菜心、CMS2.菜心、CMS3.菜心、CMS4.菜心、CMS5.菜心、CMS6.菜心、CMS7.菜心、CMS8.菜心、
(07‑882×abc3‑1)2、019菜心、小花菜、16E9‑16②‑24、17E9‑22③、16E9‑16②‑24×16E9‑13
②‑21、16E9‑49①‑24×16E9‑22②‑21、丸叶壬生菜77‑44、千筋京菜、广岛菜、壬生菜和小松
菜。

[0030] 上述任一所述的方法中，“分别采用上述任一所述引物组合中引物组的进行PCR扩增”的反应程序具体可为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃‑55℃(选用touch down程
序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增
26个循环。若PCR扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复
性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。

[0031] 本发明建立了基于等位基因竞争性特异PCR法鉴定菜心品种真实性的DNA指纹数据库，可用于对菜心品种在种子或幼苗期进行早期鉴定，保证品种的真实性，切实保护生产
者和育种家的权益，并为菜心种质资源和新品种保护提供技术支持。本发明提供的方法既
可以对未知菜心品种进行鉴定，也可以对已知品种的真实性进行鉴定。本发明提供的方法
具有高通量、准确、低成本、操作简单、节约人力、物力等有点，具有十分广阔的应用前景。本
发明具有重要的应用价值。

附图说明

[0032] 图1为32个引物组在部分供试菜心品种中的SNP分型效果。

[0033] 图2为建立在32个SNP引物组上的179个供试菜心品种的聚类图。

[0034] 图3为SNP标记个数(即SNP位点个数)与区分179个供试菜心品种的关系图。

具体实施方式

[0035] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

[0036] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0037] 下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。

[0038] 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0039] 实施例1、用于鉴定菜心品种真实性的引物组合的获得

[0040] 一、32个SNP位点的发现

[0041] 本发明基于20份菜心代表资源的重测序数据，获得32个SNP位点。这20份菜心代表资源类型丰富，涵盖厚皮菜心(8份)、薄皮菜心(7份)、野生菜心(1份)和中间型(4份)，基本
包括了菜心主要的生态类型，在农艺性状方面具有较高的遗传多样性，尽可能多地体现了
种质代表性。

[0042] 具体的，SNP位点的筛选标准如下：在全基因组范围内选择位置均匀、多态性好、杂合度小、MAF>0.3、PCA聚类效果好、区分度高且两翼50bp序列保守(无InDel，无SSR，无其它
SNP)的SNP位点。

[0043] 32个SNP位点的基本信息详见表1中第1至4列。其中SNP位点在染色体上的位置是基于22‑2参考基因组序列比对确定的(下载地址为：http://brassicadb.org/brad/
downloadOverview.php)。

[0044] 表1.32个SNP位点基本信息

[0045]

[0046]

[0047] 二、用于鉴定菜心品种真实性的引物组合的获得

[0048] 根据步骤一发现的32个SNP位点，开发出具有较高的多态性信息量(PIC值)(见表1中第5列)且适合用等位基因竞争性特异PCR法鉴定菜心品种真实性的引物组合。

[0049] 引物组合由32个引物组组成。每个引物组的名称见表2中第2列。每个引物组由3条引物序列组成，用于扩增一个SNP位点。32个引物组中各个引物的核苷酸序列如表2中第4列
所示。

[0050] 表2.32个引物组及其引物的核苷酸序列

[0051]

[0052]

[0053]

[0054]

[0055] 注：单下划线为FAM荧光标签序列，双下划线为HEX荧光标签序列。

[0056] 实施例2、实施例1开发的引物组合的有效性检验

[0057] 随机选择179个供试菜心品种对实施例1开发的引物组合的有效性检验。

[0058] 179个供试菜心品种的基本信息见表3。179个供试菜心品种均为常见的优良品种或部分国外引进品种。

[0059] 表3.179个供试菜心品种的基本信息

[0060]

[0061]

[0062]

[0063] 1、供试菜心品种的基因组DNA的获得

[0064] 采用CTAB法分别提取179个供试菜心品种的叶片(混取30粒种子的真叶)的基因组DNA，得到供试菜心品种的基因组DNA。

[0065] 供试菜心品种的基因组DNA的质量和浓度均须满足PCR要求，达标标准为：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；紫外分光光度计Nanodrop2000(Thermo)检测A260/
A280比值在1.8左右，A260/A230比值大于1.8；供试菜心品种的基因组DNA的浓度在10‑
30ng/μL。

[0066] 2、分别以179个供试菜心品种的基因组DNA为模板，分别采用32个引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。各个PCR反应体系中，名称中含有“F1”的引物、名称中含有“F2”的
引物和名称中含有“R”的引物的浓度比为2:2:5。

[0067] 反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃‑55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个
循环。

[0068] 3、完成步骤2后，待PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光
标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断179个供
试菜心品种基于每个SNP位点的基因型。具体的判断原则如下：如果某供试菜心品种基于某
SNP位点显示蓝色荧光信号，则该供试菜心品种基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP位点
且名称中含有“F1”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；如果某供试菜心品种基
于某SNP位点显示红色荧光信号，则该供试菜心品种基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP
位点且名称中含有“F2”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；如果某供试菜心品
种基于某SNP位点显示绿色荧光信号，则该供试菜心品种基于该SNP位点的基因型为杂合
型，一个碱基为“扩增该SNP位点且名称中含有“F1”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱
基”，另一个碱基“扩增该SNP位点且名称中含有“F2”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱
基”。

[0069] 需要说明的是，若PCR扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。

[0070] 部分结果见图1。结果表明，各个引物组在供试菜心品种中可以得到很好的分型效果。

[0071] 4、聚类分析

[0072] 根据179个供试菜心品种基于32个SNP位点的基因型，利用MiniMarker和MEGA7软件对179个供试菜心品种进行聚类分析。

[0073] 建立在32个引物组上的179个供试菜心品种的聚类图如图2所示。结果表明，32个引物组可以完全区分表3中的179个供试菜心品种。由此可见，实施例1开发的引物组合可以
应用于菜心品种DNA指纹数据库构建和品种真实性鉴定。

[0074] 5、效率评价

[0075] 品种真实性鉴定可以采用序贯分析方式减少工作量。本发明的发明人比较了SNP标记个数(即引物组数)与区分179个供试菜心品种区分率的关系。

[0076] 实验结果表明(图3)，32个引物组(即32个SNP标记个数)在179个供试菜心品种中的区分率达到100％。

[0077] 实施例3、建立检测待测菜心属于实施例2中179个菜心品种中哪个品种的方法

[0078] 一、建立检测待测菜心属于实施例2中179个菜心品种中哪个品种的方法

[0079] 1、待测菜心的基因组DNA的获得

[0080] 按照实施例2中步骤1的方法，将“供试菜心品种的叶片”替换为“待测菜心的叶片”，其它步骤均不变，得到待测菜心的基因组DNA。

[0081] 2、以待测菜心的基因组DNA为模板，分别采用32个引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。各个PCR反应体系中，名称中含有“F1”的引物、名称中含有“F2”的引物和名称中含
有“R”的引物的浓度比为2:2:5。

[0082] 反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃‑55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个
循环。

[0083] 3、完成步骤2后，待PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光
标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断待测菜心
基于每个SNP位点的基因型。需要说明的是，若PCR扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，
可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。

[0084] 具体的判断原则同实施例2中步骤3的判断原则。

[0085] 4、完成步骤3后进行如下判断：如果待测菜心基于32个SNP位点的基因型和179个菜心品种中某品种相应的SNP位点的基因型完全一致，则待测菜心与该菜心品种属于同一
个品种；如果待测菜心基于32个SNP位点的基因型和179个菜心品种中各个品种相应的SNP
位点的基因型均不一致，则待测菜心与179个供试菜心品种的品种均不相同。

[0086] 二、步骤一建立的方法的准确性鉴定

[0087] 待测菜心1‑待测菜心5的品种依次为金满田、红亮1号、珠海矮脚、翠绿1号和穗美888。待测菜心1‑待测菜心5的叶片均取自北京市农林科学院蔬菜研究中心试验基地。

[0088] 1、按照步骤一中1‑3的方法，获得待测菜心1‑待测菜心5基于32个SNP位点的基因型。

[0089] 2、将待测菜心1‑待测菜心5基于32个SNP位点的基因型和179个菜心品种基于32个SNP位点的基因型进行比较。

[0090] 结果表明，待测菜心1基于32个SNP位点的基因型和金满田相应的SNP位点的基因型完全一致，待测菜心1属于金满田；待测菜心2基于32个SNP位点的基因型和红亮1号相应
的SNP位点的基因型完全一致，待测菜心2属于红亮1号；待测菜心3基于32个SNP位点的基因
型和珠海矮脚相应的SNP位点的基因型完全一致，待测菜心3属于珠海矮脚；待测菜心4基于
32个SNP位点的基因型和翠绿1号相应的SNP位点的基因型完全一致，待测菜心4属于翠绿1
号；待测菜心5基于32个SNP位点的基因型和穗美888相应的SNP位点的基因型完全一致，待
测菜心5属于穗美888。检测结果与预期结果完全一致。

[0091] 由此可见，步骤一建立的方法具有较高的准确性。