一种桔霉素含量的检测方法转让专利
申请号 : CN202010999108.1
文献号 : CN112098559B
文献日 : 2021-12-28
发明人 : 倪莉 , 周康熙 , 肖炎钦 , 吕旭聪
申请人 : 福州大学
摘要 :
本发明公开了一种桔霉素的测定方法，采用外标法测定桔霉素的含量，步骤如下：（1）配置一定浓度梯度的桔霉素标准溶液，用液相色谱绘制浓度‑峰面积的标准曲线；（2）将样品溶液过0.22μm滤膜后采用液相色谱法进行测定，并根据（1）中的标准曲线计算浓度。本发明所述的桔霉素测定方法适用于红曲霉发酵液、红曲提取液、麦曲黄酒或红曲黄酒中桔霉素的检测，最低检出限和定量限分别为3ng/mL和10ng/mL，在10~1000ng/mL范围内线性良好，能克服红曲霉产生的其他荧光物质的干扰。
权利要求 :
1.一种桔霉素含量的测定方法，其特征在于：采用外标法测定桔霉素的含量，步骤如下：（1）配置一定浓度梯度的桔霉素标准溶液，用液相色谱绘制浓度‑峰面积的标准曲线；
（2）将样品溶液过0.22μm滤膜后采用液相色谱法进行测定，并根据（1）中的标准曲线计算浓度；
步骤（1）和（2）中所述液相色谱的条件为：色谱柱：4.6×250mm、5μ的Agilent Zorbax SB‑C18，激发波长331nm，发射波长500nm，进样量20μL，流速1.0mL/min，检测时间15min，流动相：A相为100%甲醇，B相为同时含有0.02%体积分数的三乙胺、0.32%体积分数的四氢呋喃和0.1%体积分数的磷酸的水溶液，C相为含有0.1%体积分数的甲酸的乙腈，流动相的洗脱梯度为：0 7min，30%B+70%C；7 10min，A液由0%增加至30%，B液由30%减少至0%，C液保持70%；10~ ~
12min，A液由30%减少至0%，B液由0%增加至30%，C液保持70%；12 15min，30%B+70%C；
~ ~
所述桔霉素标准溶液的配置方法：在电子分析天平中准确称取1mg桔霉素，加入
10mL75%体积分数的乙醇充分溶解，配置成100μg/mL桔霉素储备液，分装成10管，取其中一管用75%体积分数的乙醇分别稀释成1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、
25ng/mL的桔霉素标准溶液，其余储备液于‑80℃冻存，桔霉素标准溶液现配现用，桔霉素储备液能保藏1年；
所述样品溶液为红曲霉发酵液、红曲提取液、麦曲黄酒或红曲黄酒中的一种。
说明书 :
一种桔霉素含量的检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于桔霉素的测定技术领域，具体涉及一种桔霉素含量的检测方法。
背景技术
[0002] 红曲由红曲霉接种发酵而得，红曲又能作为发酵剂用于红曲黄酒的酿造。红曲霉是一类小型丝状腐生真菌，其初级代谢产物（如淀粉酶、蛋白酶等）和次级代谢产物（如红曲
色素、洛伐他汀等）在食品医药领域应用广泛，但其生长过程中可能会代谢具有肾毒性的桔
霉素，因此桔霉素含量的检测和控制尤为重要。中国轻工业行业标准QB/T 2847‑2007对功
能性红曲米（粉）的桔霉素限量为50μg/kg（50ppb），日本限量为100ppb，美国食品和药物管
理局FDA对其限量为20ppb。已废止的旧国标（GB/T 5009.222‑2008红曲类产品中桔青霉素
的测定）定量限液态样品为50ng/mL，固态样品为1000μg/kg，准确性欠佳，只能对桔霉素超
标的样品进行定量分析；而新国标（GB 5009.222‑2016 食品中桔青霉素的测定）法一中红
曲类产品桔青霉素的测定的检测方法虽然灵敏度高（检出限25μg/kg），但需要用到价格高
昂的免疫亲和柱，且HPLC方法可能会导致标品出峰拖尾，不利于红曲类产品的桔霉素检测。
针对新旧国标中关于桔霉素HPLC检测方法的缺陷，本发明提供了一种有效准确测定的方
法。
色素、洛伐他汀等）在食品医药领域应用广泛，但其生长过程中可能会代谢具有肾毒性的桔
霉素，因此桔霉素含量的检测和控制尤为重要。中国轻工业行业标准QB/T 2847‑2007对功
能性红曲米（粉）的桔霉素限量为50μg/kg（50ppb），日本限量为100ppb，美国食品和药物管
理局FDA对其限量为20ppb。已废止的旧国标（GB/T 5009.222‑2008红曲类产品中桔青霉素
的测定）定量限液态样品为50ng/mL，固态样品为1000μg/kg，准确性欠佳，只能对桔霉素超
标的样品进行定量分析；而新国标（GB 5009.222‑2016 食品中桔青霉素的测定）法一中红
曲类产品桔青霉素的测定的检测方法虽然灵敏度高（检出限25μg/kg），但需要用到价格高
昂的免疫亲和柱，且HPLC方法可能会导致标品出峰拖尾，不利于红曲类产品的桔霉素检测。
针对新旧国标中关于桔霉素HPLC检测方法的缺陷，本发明提供了一种有效准确测定的方
法。
发明内容
[0003] 本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种桔霉素含量的检测方法。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0005] 一种桔霉素含量的测定方法：采用外标法测定桔霉素的含量。配置一定浓度梯度的桔霉素标准溶液，用液相色谱绘制浓度‑峰面积的标准曲线；将样品溶液过0.22μm滤膜后
采用液相色谱法进行测定，并根据标准曲线计算浓度。所述的样品溶液为红曲霉发酵液、红
曲提取液、麦曲黄酒或红曲黄酒中的一种。
采用液相色谱法进行测定，并根据标准曲线计算浓度。所述的样品溶液为红曲霉发酵液、红
曲提取液、麦曲黄酒或红曲黄酒中的一种。
[0006] （1）桔霉素标准溶液的配置方法：在电子分析天平中准确称取1mg桔霉素，加入10mL75%乙醇充分溶解，配置成100μg/mL桔霉素储备液，分装成10管，取其中一管用75%乙醇
稀释成1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL的桔霉素标准溶液，其
余储备液于‑80℃冻存。桔霉素标准溶液现配现用，桔霉素储备液可保藏1年。
稀释成1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL的桔霉素标准溶液，其
余储备液于‑80℃冻存。桔霉素标准溶液现配现用，桔霉素储备液可保藏1年。
[0007] （2）液相色谱的检测条件为：色谱柱：Agilent Zorbax SB‑C18（4.6×250mm，5μ），激发波长331nm，发射波长500nm，进样量20μL，流速1.0mL/min，检测时间15min，流动相为A
液为100%甲醇，B液为同时含有0.02%（v/v）三乙胺、0.32%（v/v）四氢呋喃和0.1%（v/v）磷酸
的水溶液，C液为含有0.1%（v/v）甲酸的乙腈，流动相的洗脱梯度如表1所示。
液为100%甲醇，B液为同时含有0.02%（v/v）三乙胺、0.32%（v/v）四氢呋喃和0.1%（v/v）磷酸
的水溶液，C液为含有0.1%（v/v）甲酸的乙腈，流动相的洗脱梯度如表1所示。
[0008] 表1 液相流动相的洗脱梯度条件
[0009]
[0010] 本发明的有益效果在于：
[0011] 本发明所述的方法能够将桔霉素与红曲霉代谢的荧光类物质相分离，适用于红曲霉发酵液、红曲和黄酒类产品中桔霉素的检测，相比于2008年桔霉素检测的旧国标提高了
检测灵敏度，相比于2016年桔霉素检测的新国标HPLC方法（法一中适用于红曲类产品的检
测方法）桔霉素的出峰时间更早，峰形更加完善，不拖尾，方法准确可行，可信度高。
检测灵敏度，相比于2016年桔霉素检测的新国标HPLC方法（法一中适用于红曲类产品的检
测方法）桔霉素的出峰时间更早，峰形更加完善，不拖尾，方法准确可行，可信度高。
附图说明
[0012] 图1为本发明中500ng/mL桔霉素标品的液相色谱图。
[0013] 图2为2008年国标中500ng/mL桔霉素标品的液相色谱图。
[0014] 图3为2016年国标中500ng/mL桔霉素标品的液相色谱图。
[0015] 图4为2016年国标中25ng/mL桔霉素标品的液相色谱图。
[0016] 图5为本发明中桔霉素的标准曲线。
[0017] 图6为本发明中红曲霉发酵液的桔霉素液相色谱图。
[0018] 图7为本发明中红曲乙醇提取液的桔霉素液相色谱图。
[0019] 图8为本发明中红曲黄酒的桔霉素液相色谱图。
[0020] 图9为本发明中麦曲黄酒的桔霉素液相色谱图。
[0021] 图10为aQ‑C18柱条件下红曲霉发酵液的桔霉素液相色谱图。
具体实施方式
[0022] 以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于此实施例。
[0023] 实施例1
[0024] 本发明的一种桔霉素含量的测定方法，具体包括如下步骤：
[0025] （1）桔霉素标品的配置：在电子分析天平中准确称取1mg桔霉素，加入10mL75%（v/v）乙醇充分溶解，配置成100μg/mL桔霉素储备液，分装成10管，取其中一管用75%（v/v）乙醇
稀释成1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL的桔霉素标准溶液，其
余储备液于‑80℃冻存。桔霉素标准溶液现配现用，桔霉素储备液可保藏1年。
稀释成1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL的桔霉素标准溶液，其
余储备液于‑80℃冻存。桔霉素标准溶液现配现用，桔霉素储备液可保藏1年。
[0026] （2）样品的前处理：对于红曲等固态样品，用研磨将其研磨破碎，准确称取一定质量的固态粉末，加入75%（v/v）乙醇60℃提取2h，4500r/min离心15min，取上清液用0.22μm滤
膜过滤后待测；对于红曲霉发酵液、黄酒等液态样品，直接4500r/min离心15min，取上清液
用0.22μm滤膜过滤后待测。
膜过滤后待测；对于红曲霉发酵液、黄酒等液态样品，直接4500r/min离心15min，取上清液
用0.22μm滤膜过滤后待测。
[0027] （3）液相色谱的检测条件为：色谱柱：Agilent Zorbax SB‑C18（4.6×250mm，5μ），激发波长331nm，发射波长500nm，进样量20μL，流速1.0mL/min，检测时间15min，流动相为A
液为100%甲醇，B液为同时含有0.02%（v/v）三乙胺、0.32%（v/v）四氢呋喃和0.1%（v/v）磷酸
的水溶液，C液为含有0.1%（v/v）甲酸的乙腈，流动相的洗脱条件见表1。
液为100%甲醇，B液为同时含有0.02%（v/v）三乙胺、0.32%（v/v）四氢呋喃和0.1%（v/v）磷酸
的水溶液，C液为含有0.1%（v/v）甲酸的乙腈，流动相的洗脱条件见表1。
[0028] 本实施例中所用的08年旧国标的HPLC方法如下：液相色谱柱Luna C18（2）（4.6×150mm，5μ），柱温28℃，激发波长331nm，发射波长500nm，进样量20μL，流速1.0mL/min，流动
相A液为100%乙腈，B液为pH=2.5的磷酸水，A：B=35：65。
相A液为100%乙腈，B液为pH=2.5的磷酸水，A：B=35：65。
[0029] 本实施例中所用的16年新国标的HPLC方法如下：液相色谱柱Luna C18（2）（4.6×150mm，5μ），柱温30℃，激发波长350nm，发射波长500nm，进样量20μL，流速0.7mL/min，流动
相A液为100%乙腈，B液为0.1%（v/v）磷酸，流动相及梯度洗脱条件见表2。
相A液为100%乙腈，B液为0.1%（v/v）磷酸，流动相及梯度洗脱条件见表2。
[0030] 表2 2016版新国标中红曲及其制品中桔霉素检测的HPLC流动相梯度洗脱条件
[0031]
[0032] 本发明的方法，500ng/mL高浓度的桔霉素标品的保留时间提前至4.3min（图1），整个出峰时间为2.25min，而08年旧国标的HPLC方法，500ng/mL桔霉素标品的保留时间为
10.56min，整个出峰时间拖尾严重（图2）；16年新国标中红曲及其制品的HPLC方法，500ng/
mL桔霉素标品的保留时间为9.63min，整个出峰时间较为拖尾（图3），且对于25ng/mL低浓度
的桔霉素而言，该梯度洗脱条件下基线不平（图4）。说明本发明的桔霉素HPLC测定方法优于
当前的两项国标方法。
10.56min，整个出峰时间拖尾严重（图2）；16年新国标中红曲及其制品的HPLC方法，500ng/
mL桔霉素标品的保留时间为9.63min，整个出峰时间较为拖尾（图3），且对于25ng/mL低浓度
的桔霉素而言，该梯度洗脱条件下基线不平（图4）。说明本发明的桔霉素HPLC测定方法优于
当前的两项国标方法。
[0033] 在本发明方法下，绘制桔霉素浓度与标品的标准曲线为y=60.357x‑225.75，R2=0.9999，线性范围良好（图5）。以基线信噪比3倍为检出限，该方法的检出限为3ng/mL，以基
线信噪比10倍为定量限，该方法的定量限为10ng/mL。该方法可实现红曲霉发酵液（图6）、红
曲乙醇提取液（图7）、红曲黄酒（图8）和麦曲黄酒（图9）的测定，四个样品中桔霉素的含量分
别为：2059.44ng/mL、108.77ng/mL、180.10ng/mL、180.97ng/mL，测定过程中不受样品中其
他荧光物质的干扰，且与新旧国标方法相比检测结果偏差不超10%，在国标限定的可接受范
围内。此处红曲霉发酵液为将紫色红曲霉CZ接入发酵培养基中发酵7d后的样品，发酵培养
基的配方为：味精22.33g/L、硫酸铵9.72g/L、籼米粉30.00g/L、葡萄糖12.50 g/L、磷酸二氢
钾9.00 g/L、一水合硫酸锰0.21 g/L、七水合硫酸镁2.1 g/L；红曲采自福建宁德，红曲黄酒
来源于福建宁德，麦曲黄酒来源于浙江绍兴。
线信噪比10倍为定量限，该方法的定量限为10ng/mL。该方法可实现红曲霉发酵液（图6）、红
曲乙醇提取液（图7）、红曲黄酒（图8）和麦曲黄酒（图9）的测定，四个样品中桔霉素的含量分
别为：2059.44ng/mL、108.77ng/mL、180.10ng/mL、180.97ng/mL，测定过程中不受样品中其
他荧光物质的干扰，且与新旧国标方法相比检测结果偏差不超10%，在国标限定的可接受范
围内。此处红曲霉发酵液为将紫色红曲霉CZ接入发酵培养基中发酵7d后的样品，发酵培养
基的配方为：味精22.33g/L、硫酸铵9.72g/L、籼米粉30.00g/L、葡萄糖12.50 g/L、磷酸二氢
钾9.00 g/L、一水合硫酸锰0.21 g/L、七水合硫酸镁2.1 g/L；红曲采自福建宁德，红曲黄酒
来源于福建宁德，麦曲黄酒来源于浙江绍兴。
[0034] 此外，本实施例中还涉及，虽然色谱柱都是C18柱，但品牌或填料不同可能会影响检测效果，例如将Agilent Zorbax SB‑C18（4.6×250mm，5μ）替换为Thermo syncronls aQ
C18（4.6×250mm，5μ），对红曲霉发酵液中桔霉素的分离效果较差，有其他荧光物质干扰（图
10）。
C18（4.6×250mm，5μ），对红曲霉发酵液中桔霉素的分离效果较差，有其他荧光物质干扰（图
10）。