荧光编码微球和阵列及制备方法转让专利
申请号 : CN202011030055.9
文献号 : CN112111268B
文献日 : 2021-11-23
发明人 : 王耀 , 徐宏 , 古宏晨
申请人 : 上海交通大学 , 上海迈景纳米科技有限公司
摘要 :
本发明提供了一种荧光编码微球和阵列及制备方法，其中所述编码微球包括微球载体，所述微球载体为介孔微球，所述微球载体的内部设置至少一种荧光标记物，所述荧光标记物由荧光染料与中介物质连接形成，各所述荧光标记物所对应的荧光染料的中心发射波长各不相同，从而每一种荧光染料限定所述编码微球的一个维度的编码信息。
权利要求 :
1.一种编码微球，其特征在于，包括微球载体，所述微球载体为介孔微球，所述微球载体的内部设置至少一种荧光标记物，所述荧光标记物由荧光染料与聚合物通过共价键相连接形成，各所述荧光标记物所对应的荧光染料的中心发射波长各不相同，从而每一种荧光染料限定所述编码微球的一个维度的编码信息。
2.如权利要求1所述的编码微球，其特征在于，所述微球载体的基质成分采用无机物或聚合物。
3.如权利要求1所述的编码微球，其特征在于，所述微球载体的基质成分采用二氧化硅或二氧化钛。
4.如权利要求1所述的编码微球，其特征在于，所述微球载体的基质成分采用聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二乙烯基苯和/或由上述聚合物中所涉及的两种或两种以上单体所形成的共聚物。
5.如权利要求1所述的编码微球，其特征在于，所述微球载体的直径选择范围是0.1~
100 μm。
6.如权利要求1所述的编码微球，其特征在于，所述微球载体的孔径选择范围是2 100 ~
nm。
7.如权利要求1所述的编码微球，其特征在于，各所述荧光标记物所对应的荧光染料的中心发射波长相差大于30 nm。
8.如权利要求1所述的编码微球，其特征在于，根据所述荧光标记物的含量调整其所限定维度的编码信息。
9.如权利要求1所述的编码微球，其特征在于，所述微球载体的内部还设置有所述聚合物，根据所述聚合物及各所述荧光标记物的比例调整各所述荧光标记物的含量。
10.如权利要求1所述的编码微球，其特征在于，还包括磁性纳米颗粒。
11.如权利要求10所述的编码微球，其特征在于，所述磁性纳米颗粒设置在所述微球载体的外部。
12.如权利要求10所述的编码微球，其特征在于，所述磁性纳米颗粒采用Fe3O4纳米颗粒或γ‑Fe2O3纳米颗粒。
13.如权利要求1所述的编码微球，其特征在于，所述编码微球的外表面为氧化硅包覆层。
14.如权利要求1所述的编码微球，其特征在于，所述编码微球的外表面为氧化硅包覆层和功能分子修饰层，所述功能分子修饰层处于最外层。
15.一种编码微球的制备方法，其特征在于，包括：步骤一、选择微球载体，所述微球载体为介孔微球；
步骤二、将至少一种荧光染料分别与聚合物通过共价键相连接形成至少一种荧光标记物，每一种荧光染料限定所述编码微球的一个维度的编码信息；
步骤三、将所述荧光标记物设置于所述微球载体的内部。
16.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述微球载体的基质成分采用无机物或聚合物。
17.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述微球载体的基质成分采用二氧化硅或二氧化钛。
18.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述微球载体的基质成分采用聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二乙烯基苯和/或由上述聚合物中所涉及的两种或两种以上单体所形成的共聚物。
19.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述微球载体的直径选择范围是0.1~
100 μm。
20.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述微球载体的孔径选择范围是2~
100 nm。
21.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述微球载体采用多孔二氧化硅微球、羧基化的多孔聚苯乙烯微球、修饰环氧基团的多孔二氧化硅微球、修饰环氧基团的多孔聚苯乙烯微球、氨基化的多孔二氧化硅微球、氨基化的多孔聚苯乙烯微球中的一种或多种。
22.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，各所述荧光标记物所对应的荧光染料的中心发射波长相差大于30 nm。
23.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，根据所述荧光标记物的含量调整其所限定维度的编码信息。
24.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述荧光染料的分子结构中含有的官能团为异硫氰酸酯、羧基、N‑羟基琥珀酰亚胺酯、环氧基团中的一种或多种，所述聚合物的分子结构中含有的官能团为氨基。
25.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述荧光染料的分子结构中含有的官能团为氨基，所述聚合物的分子结构中含有的官能团为羧基、环氧基团中的一种或多种。
26.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述荧光染料采用异硫氰酸荧光素、异硫氰酸罗丹明B、Cy5‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯、5‑氨基荧光素中的一种或多种。
27.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述聚合物采用聚乙烯亚胺和/或聚丙烯酸。
28.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述步骤三具体包括：通过物理/化学作用将所述荧光标记物或所述荧光标记物与所述聚合物的混合物设置于所述微球载体的内部空间。
29.如权利要求28所述的制备方法，其特征在于，根据所述混合物中的各荧光标记物及所述聚合物的比例调整各维度的编码信息。
30.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，还包括：步骤四、将磁性纳米颗粒设置在所述微球载体的外表面。
31.如权利要求30所述的制备方法，其特征在于，所述磁性纳米颗粒采用Fe3O4纳米颗粒或γ‑Fe2O3纳米颗粒。
32.如权利要求30所述的制备方法，其特征在于，所述步骤四具体包括：通过物理/化学作用将所述磁性纳米颗粒包覆于所述微球载体的外表面。
33.如权利要求28或32所述的制备方法，其特征在于，所述物理/化学作用包括静电作用、亲疏水作用、氢键作用、配位作用和/或共价键作用。
34.如权利要求30所述的制备方法，其特征在于，所述步骤四还包括：在将所述磁性纳米颗粒包覆于所述微球载体的外表面后，再在所述微球载体的外表面包覆聚合物。
35.如权利要求15或34所述的制备方法，其特征在于，在所有步骤完成后，再在所述微球载体的外表面包覆氧化硅。
36.如权利要求35所述的制备方法，其特征在于，在所述微球载体的外表面包覆氧化硅后，再在所述微球载体的外表面修饰功能分子，从而得到表面功能化的微球载体。
37.一种编码微球阵列，其特征在于，包括至少两种如权利要求1 14任一所述的编码微~
球，或者至少两种如权利要求15 36任一所述制备方法制得的编码微球，各种所述编码微球~
间具有不同的编码信息。
说明书 :
荧光编码微球和阵列及制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及微纳米生物材料和多指标检测领域，尤其涉及一种荧光编码微球和阵列及制备方法。
背景技术
[0002] 基于编码微球的悬浮阵列技术是近年来广受关注的多指标检测技术之一，它可实现在单反应中对多种待测目标靶分子(包括核酸、蛋白、小分子化合物等)的同时鉴定和定
量分析，在疾病诊断、药物开发、环境污染监控等领域具有重要的应用价值。与传统的固相
芯片相比，悬浮阵列技术将平板载体替换为具有微纳米尺度的编码微球，每类微球都携带
一种可被仪器识别的编码信息以鉴别固定在其表面的探针种类，在特异性地与相应靶分子
反应后，所得复合物带有可被仪器读取的检测信号，即可进行检测结果分析。编码微球作为
悬浮阵列技术的核心载体，具有三维结构并拥有较大的比表面积，与靶分子的反应近似为
液相反应动力学过程，具有较高的检测灵敏度；编码微球表面的探针可根据检测项目需求
进行个性化定制，将表面连接不同探针的编码微球混合即可实现单反应多指标检测，具有
更高的组合灵活性。
量分析，在疾病诊断、药物开发、环境污染监控等领域具有重要的应用价值。与传统的固相
芯片相比，悬浮阵列技术将平板载体替换为具有微纳米尺度的编码微球，每类微球都携带
一种可被仪器识别的编码信息以鉴别固定在其表面的探针种类，在特异性地与相应靶分子
反应后，所得复合物带有可被仪器读取的检测信号，即可进行检测结果分析。编码微球作为
悬浮阵列技术的核心载体，具有三维结构并拥有较大的比表面积，与靶分子的反应近似为
液相反应动力学过程，具有较高的检测灵敏度；编码微球表面的探针可根据检测项目需求
进行个性化定制，将表面连接不同探针的编码微球混合即可实现单反应多指标检测，具有
更高的组合灵活性。
[0003] 对微球载体赋予编码功能，是实现单反应多指标检测的基础。迄今为止，研究者们提出了不同的编码方式以实现对微球载体的编码，与图案编码、物理编码、磁编码等相比，
基于荧光元素的光学编码方式因为编码灵活方便、解码方式成熟且快速，应用最为广泛。其
中，荧光染料因易于制备、成本低、溶剂耐受性好、生物毒性低、编码过程可控等优势，仍然
是目前最为主流的荧光编码元素。美国Luminex公司发展的xMap系统是成功商业化的基于
荧光编码微球的多指标检测平台，它是利用溶胀法将有机荧光染料装载于聚合物微球中。
公告号为US6514295B1的美国专利公开了其制备方法，聚合物微球首先在有机溶剂中浸泡
溶胀，使溶解于有机溶剂的荧光染料分子通过微球的高分子链空隙扩散进入，去除溶剂后，
微球收缩并将染料分子截留于内部，通过调节染料的种类和浓度，可以获得一系列不同的
荧光编码微球。但溶胀法必须要选择可同时溶胀聚合物微球且溶解荧光染料的溶剂，具有
体系兼容的问题；同时该方法只适用于有机微球，无法扩展到利用无机微球载体制备荧光
编码微球，具有限制性。公布号为CN106634945A的中国专利公开了一种荧光编码微球的制
备方法，通过将单体、荧光染料、引发剂、分散剂等物质共混，利用聚合的方法将染料分子包
裹于聚合物微球中得到荧光编码微球。但荧光染料的掺杂增加了聚合过程对微球粒径的控
制难度，而粒径均一性的下降会对编码的精准性造成影响。公告号为CN101846676B的中国
专利公开了一种氨基化微球的荧光编码方法，利用荧光染料与微球表面氨基的共价结合实
现荧光编码。虽然该方法具有操作简洁、荧光稳定等优点，但它也同时对微球表面功能化基
团进行了限定，并且仅利用微球的外表面进行荧光分子的标记使得编码容量受到了较大的
限制。
基于荧光元素的光学编码方式因为编码灵活方便、解码方式成熟且快速，应用最为广泛。其
中，荧光染料因易于制备、成本低、溶剂耐受性好、生物毒性低、编码过程可控等优势，仍然
是目前最为主流的荧光编码元素。美国Luminex公司发展的xMap系统是成功商业化的基于
荧光编码微球的多指标检测平台，它是利用溶胀法将有机荧光染料装载于聚合物微球中。
公告号为US6514295B1的美国专利公开了其制备方法，聚合物微球首先在有机溶剂中浸泡
溶胀，使溶解于有机溶剂的荧光染料分子通过微球的高分子链空隙扩散进入，去除溶剂后，
微球收缩并将染料分子截留于内部，通过调节染料的种类和浓度，可以获得一系列不同的
荧光编码微球。但溶胀法必须要选择可同时溶胀聚合物微球且溶解荧光染料的溶剂，具有
体系兼容的问题；同时该方法只适用于有机微球，无法扩展到利用无机微球载体制备荧光
编码微球，具有限制性。公布号为CN106634945A的中国专利公开了一种荧光编码微球的制
备方法，通过将单体、荧光染料、引发剂、分散剂等物质共混，利用聚合的方法将染料分子包
裹于聚合物微球中得到荧光编码微球。但荧光染料的掺杂增加了聚合过程对微球粒径的控
制难度，而粒径均一性的下降会对编码的精准性造成影响。公告号为CN101846676B的中国
专利公开了一种氨基化微球的荧光编码方法，利用荧光染料与微球表面氨基的共价结合实
现荧光编码。虽然该方法具有操作简洁、荧光稳定等优点，但它也同时对微球表面功能化基
团进行了限定，并且仅利用微球的外表面进行荧光分子的标记使得编码容量受到了较大的
限制。
[0004] 因此，本领域的技术人员致力于开发一种制备工艺简单可控、适用范围广、编码准确、编码容量高的荧光染料掺杂编码微球及其制备方法。
发明内容
[0005] 鉴于现有技术中的问题，本发明提供了一种编码微球，所述编码微球包括微球载体，所述微球载体为介孔微球，所述微球载体的基质成分和孔径被用于限定所述编码微球
的第一维度编码信息。
的第一维度编码信息。
[0006] 进一步地，所述基质成分采用无机物或聚合物。
[0007] 进一步地，所述基质成分采用二氧化硅或二氧化钛。
[0008] 进一步地，所述基质成分采用聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二乙烯基苯和/或由上述聚合物中所涉及的两种或两种以上单体所
形成的共聚物。
形成的共聚物。
[0009] 进一步地，所述微球载体的直径选择范围是0.2～20μm，优选范围是3～6μm。
[0010] 进一步地，所述微球载体的孔径选择范围是2～100nm，优选范围是10～60nm。
[0011] 进一步地，根据所述微球载体的基质成分和/或孔径调整所述第一维度信息，不同的所述第一维度信息通过流式细胞仪对所述编码微球的检测所获得的FSC‑SSC(前向散射
光‑侧向散射光)二维散点图的信号分布来区分。
光‑侧向散射光)二维散点图的信号分布来区分。
[0012] 进一步地，所述微球载体内部还设置有中介物质。
[0013] 进一步地，所述编码微球还包括至少一种荧光材料，各所述荧光材料的中心发射波长各不相同，从而每一种所述荧光材料限定所述编码微球的一个维度的编码信息。
[0014] 进一步地，各所述荧光材料间的中心发射波长相差大于30nm。
[0015] 进一步地，所述荧光材料设置在所述微球载体的内部和/或外部。
[0016] 进一步地，所述编码微球还包括第一荧光材料，所述第一荧光材料限定所述编码微球的第二维度编码信息。
[0017] 进一步地，所述第一荧光材料设置在所述微球载体的内部。
[0018] 进一步地，根据所述第一荧光材料的含量调整所述第二维度编码信息。
[0019] 进一步地，所述第一荧光材料是荧光染料和/或稀土配合物，优选为发射波长为517nm的绿色荧光染料异硫氰酸荧光素(FITC)。
[0020] 进一步地，所述第一荧光材料与中介物质连接形成荧光标记物，所述第一荧光材料通过所述荧光标记物的形式被设置在所述微球载体的内部。
[0021] 进一步地，所述中介物质是聚合物。
[0022] 进一步地，所述微球载体的内部还设置有所述中介物质，根据所述中介物质与所述荧光标记物的比例调整所述第一荧光材料的含量。在本发明的一个实施例中，所述中介
物质是氨基聚合物。
物质是氨基聚合物。
[0023] 进一步地，所述编码微球还包括第二荧光材料，所述第二荧光材料限定所述编码微球的第三维度编码信息。
[0024] 进一步地，所述第二荧光材料设置在所述微球载体的外部。
[0025] 进一步地，根据所述第二荧光材料的含量调整所述第三维度编码信息。
[0026] 进一步地，所述第二荧光材料是量子点、共轭聚合物荧光纳米颗粒、聚集诱导发光纳米颗粒或上转换荧光纳米颗粒，优选为发射波长为600nm的CdSe/ZnS红色量子点。
[0027] 进一步地，所述编码微球还包括磁性纳米颗粒。
[0028] 进一步地，所述磁性纳米颗粒设置在所述微球载体的外部。
[0029] 进一步地，所述磁性纳米颗粒采用Fe3O4纳米颗粒或γ‑Fe2O3纳米颗粒，优选为Fe3O4纳米颗粒。
[0030] 进一步地，所述编码微球的外表面为氧化硅包覆层。
[0031] 进一步地，所述编码微球的外表面为氧化硅包覆层和功能分子修饰层，所述功能分子修饰层处于最外层，优选的功能分子为γ‑氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和聚丙烯酸
(PAA)。
(PAA)。
[0032] 本发明还提供了一种编码微球阵列，所述编码微球阵列包括至少两种编码微球，各种所述编码微球间具有不同的编码信息；所述编码微球包括微球载体，所述微球载体为
介孔微球，所述微球载体的基质成分和孔径被用于限定所述编码微球的第一维度编码信
息。
介孔微球，所述微球载体的基质成分和孔径被用于限定所述编码微球的第一维度编码信
息。
[0033] 进一步地，各种所述编码微球的微球载体间具有基本相近的直径尺寸。在一些实施方式中，不同种类的所述微球载体间的直径偏差被限定为≤15％。
[0034] 进一步地，所述编码微球阵列至少包括两种不同基质成分的所述编码微球。
[0035] 进一步地，同一基质成分的多种所述编码微球分别选用不同的孔径尺寸。
[0036] 进一步地，所述基质成分采用无机物或聚合物。
[0037] 进一步地，所述基质成分采用二氧化硅或二氧化钛。
[0038] 进一步地，所述基质成分采用聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二乙烯基苯和/或由上述聚合物中所涉及的两种或两种以上单体所
形成的共聚物。
形成的共聚物。
[0039] 进一步地，所述微球载体的直径选择范围是0.2～20μm，优选范围是3～6μm。
[0040] 进一步地，所述微球载体的孔径选择范围是2～100nm，优选范围是10～60nm。
[0041] 进一步地，采用流式细胞仪检测各所述编码微球，根据检测获得的FSC‑SSC二维散点图的信号分布来对各所述编码微球做第一维度的区分。
[0042] 进一步地，所述微球载体内部还设置有中介物质。
[0043] 进一步地，所述编码微球还包括至少一种荧光材料，各所述荧光材料的中心发射波长各不相同，从而每一种所述荧光材料限定所述编码微球的一个维度的编码信息。
[0044] 进一步地，各所述荧光材料间的中心发射波长相差大于30nm。
[0045] 进一步地，所述荧光材料设置在所述微球载体的内部和/或外部。
[0046] 进一步地，所述编码微球还包括第一荧光材料，所述第一荧光材料限定所述编码微球的第二维度编码信息。
[0047] 进一步地，所述第一荧光材料设置在所述微球载体的内部。
[0048] 进一步地，根据所述第一荧光材料的含量调整所述第二维度编码信息。
[0049] 进一步地，所述第一荧光材料是荧光染料和/或稀土配合物，优选为发射波长为517nm的绿色荧光染料异硫氰酸荧光素(FITC)。
[0050] 进一步地，所述第一荧光材料与中介物质连接形成荧光标记物，所述第一荧光材料通过所述荧光标记物的形式被设置在所述微球载体的内部。
[0051] 进一步地，所述中介物质是聚合物。
[0052] 进一步地，所述微球载体的内部还设置有所述中介物质，根据所述中介物质与所述荧光标记物的比例调整所述第一荧光材料的含量。在本发明的一个实施例中，所述中介
物质是氨基聚合物。
物质是氨基聚合物。
[0053] 进一步地，所述编码微球还包括第二荧光材料，所述第一荧光材料限定所述编码微球的第三维度编码信息。
[0054] 进一步地，所述第二荧光材料设置在所述微球载体的外部。
[0055] 进一步地，根据所述第二荧光材料的含量调整所述第三维度编码信息。
[0056] 进一步地，所述第二荧光材料是量子点、共轭聚合物荧光纳米颗粒、聚集诱导发光纳米颗粒或上转换荧光纳米颗粒，优选为发射波长为600nm的CdSe/ZnS红色量子点。
[0057] 进一步地，所述编码微球还包括磁性纳米颗粒。
[0058] 进一步地，所述磁性纳米颗粒设置在所述微球载体的外部。
[0059] 进一步地，所述磁性纳米颗粒采用Fe3O4纳米颗粒或γ‑Fe2O3纳米颗粒。
[0060] 进一步地，所述编码微球的外表面为氧化硅包覆层。
[0061] 进一步地，所述编码微球的外表面为氧化硅包覆层和功能分子修饰层，所述功能分子修饰层处于最外层，优选的功能分子为γ‑氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和聚丙烯酸
(PAA)。
(PAA)。
[0062] 本发明还提供了一种编码微球的制备方法，所述制备方法包括：
[0063] 步骤一、选择微球载体，所述微球载体为介孔微球，确定所述微球载体的基质成分、直径和孔径，以用于限定所述编码微球的第一维度编码信息。
[0064] 进一步地，所述基质成分采用无机物或聚合物。
[0065] 进一步地，所述基质成分采用二氧化硅或二氧化钛。
[0066] 进一步地，所述基质成分采用聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二乙烯基苯和/或由上述聚合物中所涉及的两种或两种以上单体所
形成的共聚物。
形成的共聚物。
[0067] 进一步地，所述微球载体的直径选择范围是0.2～20μm，优选范围是3～6μm。
[0068] 进一步地，所述微球载体的孔径选择范围是2～100nm，优选范围是10～60nm。
[0069] 进一步地，所述制备方法还包括：
[0070] 步骤二、将荧光染料设置于所述微球载体的内部，以限定所述编码微球的第二维度编码信息；或者将中介物质设置在所述微球载体的内部。
[0071] 进一步地，所述步骤二中将荧光染料设置于所述微球载体的内部，具体包括：
[0072] 将荧光染料与中介物质连接形成荧光标记物，通过物理/化学作用将所述荧光标记物或所述荧光标记物与所述中介物质的混合物设置于所述微球载体的内部空间。
[0073] 进一步地，所述中介物质是聚合物。如在一些实施例中步骤二中采用带负电的微球载体，对于不带负电的微球载体可先进行表面修饰，得到内部空间和外表面均带有负电
修饰分子的微球载体，在步骤二中使用带正电的氨基聚合物，用以形成荧光标记聚合物，以
及与荧光标记聚合物形成混合物，从而可以使荧光标记聚合物吸附于微球载体的内部空
间。
修饰分子的微球载体，在步骤二中使用带正电的氨基聚合物，用以形成荧光标记聚合物，以
及与荧光标记聚合物形成混合物，从而可以使荧光标记聚合物吸附于微球载体的内部空
间。
[0074] 进一步地，形成所述荧光标记物的荧光染料与所述中介物质通过共价键相连接。
[0075] 进一步地，根据所述混合物中的荧光标记物与所述中介物质的比例调整所述第二维度编码信息。
[0076] 进一步地，所述制备方法还包括：
[0077] 步骤三、将磁性纳米颗粒设置在所述微球载体的外表面。
[0078] 进一步地，所述磁性纳米颗粒采用Fe3O4纳米颗粒或γ‑Fe2O3纳米颗粒。
[0079] 进一步地，所述制备方法中所述步骤三具体包括：
[0080] 通过物理/化学作用将所述磁性纳米颗粒包覆于所述微球载体的外表面。如当步骤二中使用带正电的氨基聚合物，则步骤二完成后的微球载体的外表面也会吸附有带正电
的氨基聚合物，则步骤三中可使用带有负电荷的磁性纳米颗粒，从而使磁性纳米颗粒包覆
于当前微球载体的外表面。
的氨基聚合物，则步骤三中可使用带有负电荷的磁性纳米颗粒，从而使磁性纳米颗粒包覆
于当前微球载体的外表面。
[0081] 进一步地，所述步骤三还包括：
[0082] 在将所述磁性纳米颗粒包覆于所述微球载体的外表面后，再在所述微球载体的外表面包覆聚合物。
[0083] 进一步地，所述制备方法还包括：
[0084] 步骤四、将荧光纳米颗粒设置于所述微球载体的外表面，以限定所述编码微球的第三维编码信息。
[0085] 进一步地，所述荧光纳米颗粒是量子点、共轭聚合物荧光纳米颗粒、聚集诱导发光纳米颗粒或上转换荧光纳米颗粒，优选为发射波长为600nm的CdSe/ZnS红色量子点。
[0086] 进一步地，所述制备方法中所述步骤四具体包括：
[0087] 通过物理/化学作用将所述荧光纳米颗粒包覆于所述微球载体的外表面。
[0088] 进一步地，所述步骤四还包括：
[0089] 在将所述荧光纳米颗粒包覆于所述微球载体的外表面后，再在所述微球载体的外表面包覆聚合物。
[0090] 进一步地，所述物理/化学作用包括静电作用、亲疏水作用、氢键作用、配位作用和/或共价键作用。
[0091] 进一步地，在所有步骤完成后，再在所述微球载体的外表面包覆氧化硅。
[0092] 进一步地，在所述微球载体的外表面包覆氧化硅后，再在所述微球载体的外表面修饰功能分子，从而得到表面功能化的微球载体，优选的功能分子为γ‑氨丙基三乙氧基硅
烷(APTES)和聚丙烯酸(PAA)。
烷(APTES)和聚丙烯酸(PAA)。
[0093] 本发明还提供了一种掺杂荧光染料的编码微球，所述编码微球包括微球载体，所述微球载体为介孔微球，所述微球载体的内部设置至少一种荧光标记物，所述荧光标记物
由荧光染料与中介物质连接形成，各所述荧光标记物所对应的荧光染料的中心发射波长各
不相同，从而每一种荧光染料限定所述编码微球的一个维度的编码信息。
由荧光染料与中介物质连接形成，各所述荧光标记物所对应的荧光染料的中心发射波长各
不相同，从而每一种荧光染料限定所述编码微球的一个维度的编码信息。
[0094] 进一步地，所述微球载体的基质成分采用无机物或聚合物。
[0095] 进一步地，所述微球载体的基质成分采用二氧化硅或二氧化钛。
[0096] 进一步地，所述微球载体的基质成分采用聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二乙烯基苯和/或由上述聚合物中所涉及的两种或两种
以上单体所形成的共聚物。
以上单体所形成的共聚物。
[0097] 进一步地，所述微球载体的直径选择范围是0.1～100μm。
[0098] 进一步地，所述微球载体的孔径选择范围是2～100nm。
[0099] 进一步地，各所述荧光标记物所对应的荧光染料的中心发射波长相差大于30nm。
[0100] 进一步地，所述中介物质是聚合物。
[0101] 进一步地，根据所述荧光标记物的含量调整其所限定维度的编码信息。
[0102] 进一步地，所述微球载体的内部还设置有所述中介物质，根据所述中介物质及各所述荧光标记物的比例调整各所述荧光标记物的含量。
[0103] 进一步地，所述编码微球还包括磁性纳米颗粒。
[0104] 进一步地，所述磁性纳米颗粒设置在所述微球载体的外部。
[0105] 进一步地，所述磁性纳米颗粒采用Fe3O4纳米颗粒或γ‑Fe2O3纳米颗粒。
[0106] 进一步地，所述编码微球的外表面为氧化硅包覆层。
[0107] 进一步地，所述编码微球的外表面为氧化硅包覆层和功能分子修饰层，所述功能分子修饰层处于最外层。
[0108] 本发明还提供了一种掺杂荧光染料的编码微球的制备方法，所述制备方法包括：
[0109] 步骤一、选择微球载体，所述微球载体为介孔微球；
[0110] 步骤二、将至少一种荧光染料分别与中介物质连接形成至少一种荧光标记物，每一种荧光染料限定所述编码微球的一个维度的编码信息；
[0111] 步骤三、将所述荧光标记物设置于所述微球载体的内部。
[0112] 进一步地，所述微球载体的基质成分采用无机物或聚合物。
[0113] 进一步地，所述微球载体的基质成分采用二氧化硅或二氧化钛。
[0114] 进一步地，所述微球载体的基质成分采用聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二乙烯基苯和/或由上述聚合物中所涉及的两种或两种
以上单体所形成的共聚物。
以上单体所形成的共聚物。
[0115] 进一步地，所述微球载体的直径选择范围是0.1～100μm。
[0116] 进一步地，所述微球载体的孔径选择范围是2～100nm。
[0117] 进一步地，所述微球载体采用多孔二氧化硅微球、羧基化的多孔聚苯乙烯微球、修饰环氧基团的多孔二氧化硅微球、修饰环氧基团的多孔聚苯乙烯微球、氨基化的多孔二氧
化硅微球、氨基化的多孔聚苯乙烯微球中的一种或多种。
化硅微球、氨基化的多孔聚苯乙烯微球中的一种或多种。
[0118] 进一步地，各所述荧光标记物所对应的荧光染料的中心发射波长相差大于30nm。
[0119] 进一步地，所述中介物质是聚合物。
[0120] 进一步地，根据所述荧光标记物的含量调整其所限定维度的编码信息。
[0121] 进一步地，形成所述荧光标记物的荧光染料与所述中介物质通过共价键相连接。
[0122] 进一步地，所述荧光染料的分子结构中含有的官能团为氨基，所述中介物质的分子结构中含有的官能团为羧基、环氧基团中的一种或多种。
[0123] 进一步地，所述荧光染料的分子结构中含有的官能团为异硫氰酸酯、羧基、N‑羟基琥珀酰亚胺酯、环氧基团中的一种或多种，所述中介物质的分子结构中含有的官能团为氨
基。
基。
[0124] 进一步地，所述荧光染料采用异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸罗丹明B(RITC)、Cy5‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯(Cy5‑NHS)、5‑氨基荧光素(5‑AF)中的一种或多种。
[0125] 进一步地，所述中介物质采用聚乙烯亚胺(PEI)和/或聚丙烯酸(PAA)。
[0126] 进一步地，所述制备方法中所述步骤三具体包括：
[0127] 通过物理/化学作用将所述荧光标记聚合物或所述荧光标记聚合物与聚合物的混合物设置于所述微球载体的内部空间。
[0128] 进一步地，根据所述混合物中的各荧光标记聚合物及聚合物的比例调整各维度的编码信息。
[0129] 进一步地，所述制备方法还包括：
[0130] 步骤四、将磁性纳米颗粒设置在所述微球载体的外表面。
[0131] 进一步地，所述磁性纳米颗粒采用Fe3O4纳米颗粒或γ‑Fe2O3纳米颗粒。
[0132] 进一步地，所述制备方法中所述步骤四具体包括：
[0133] 通过物理/化学作用将所述磁性纳米颗粒包覆于所述微球载体的外表面。
[0134] 进一步地，所述物理/化学作用包括静电作用、亲疏水作用、氢键作用、配位作用和/或共价键作用。
[0135] 进一步地，所述步骤四还包括：
[0136] 在将所述磁性纳米颗粒包覆于所述微球载体的外表面后，再在所述微球载体的外表面包覆聚合物。
[0137] 进一步地，在所有步骤完成后，再在所述微球载体的外表面包覆氧化硅。
[0138] 进一步地，在所述微球载体的外表面包覆氧化硅后，再在所述微球载体的外表面修饰功能分子，从而得到表面功能化的微球载体。
[0139] 本发明还提供了一种编码微球阵列，其包括至少两种上述的掺杂荧光染料的编码微球，或者至少两种上述关于掺杂荧光染料的编码微球的制备方法所制得的编码微球，各
种所述编码微球间具有不同的编码信息。
种所述编码微球间具有不同的编码信息。
[0140] 本发明的编码微球和阵列及制备方法的有益效果包括：
[0141] 1、针对现有编码微球阵列编码容量不足的问题，本发明首先开发了一种新的编码方式，即利用微球载体的不同内部结构进行编码。在编码微球阵列的构建领域，内部结构作
为微球载体的内在固有属性，尚未被作为编码元素加以利用。本发明仅通过改变具有相近
直径微球载体的内部结构(包括基质成分和/或孔径大小不同)，同时读取微球载体在流式
细胞仪上的前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)信号，在FSC‑SSC的二维散点图中获得了
不同种类微球载体的不同信号分群，实现了结构编码。一旦微球载体的内部结构确定，其产
生的FSC‑SSC光学信号也将确定，这是一种稳定的编码信息，几乎不受外界环境的影响，结
构编码是一种全新的编码方式。
为微球载体的内在固有属性，尚未被作为编码元素加以利用。本发明仅通过改变具有相近
直径微球载体的内部结构(包括基质成分和/或孔径大小不同)，同时读取微球载体在流式
细胞仪上的前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)信号，在FSC‑SSC的二维散点图中获得了
不同种类微球载体的不同信号分群，实现了结构编码。一旦微球载体的内部结构确定，其产
生的FSC‑SSC光学信号也将确定，这是一种稳定的编码信息，几乎不受外界环境的影响，结
构编码是一种全新的编码方式。
[0142] 2、本发明中利用具有相近直径的不同种类微球作为载体，直径偏差≤15％，仅利用不同种类微球的内部结构进行编码，相近的直径保证了对应不同检测指标的微球载体具
有相似的反应动力学，对于多指标检测过程来说是一种“公平”的反应环境；此外，本发明限
定了微球载体的直径为0.2～20μm，在实际的检测应用过程中，尺寸较小的微球载体在液相
中具有更好的悬浮特性，不易发生沉降，因此具有更快的反应动力学，有利于提高检测灵敏
度。
有相似的反应动力学，对于多指标检测过程来说是一种“公平”的反应环境；此外，本发明限
定了微球载体的直径为0.2～20μm，在实际的检测应用过程中，尺寸较小的微球载体在液相
中具有更好的悬浮特性，不易发生沉降，因此具有更快的反应动力学，有利于提高检测灵敏
度。
[0143] 3、本发明针对现有编码微球阵列编码容量不足的问题及其它技术缺陷，在开发了新的编码元素结构编码的基础上(即扩展了编码维度)，进一步提出了新型的结构‑荧光联
合编码策略，实现了具有超高编码容量的编码微球阵列的制备；本发明利用微球载体的内
部结构差异、微球内部空间的荧光强度水平和微球外表面的荧光强度水平，将原本独立的
不同编码元素相结合，显著提升了微球载体的编码容量。
合编码策略，实现了具有超高编码容量的编码微球阵列的制备；本发明利用微球载体的内
部结构差异、微球内部空间的荧光强度水平和微球外表面的荧光强度水平，将原本独立的
不同编码元素相结合，显著提升了微球载体的编码容量。
[0144] 4、本发明提出的编码微球阵列中的微球载体可以同时具有结构编码、内部空间的荧光编码、外表面的荧光编码、以及磁响应性等多个功能特性。微球载体的空间体积有限，
本发明充分利用了载体微球的多孔结构特征及其拥有的三个区域，即载体材料骨架、内部
孔道和载体的外表面，进行了合理的分区域的功能设计，具体如下：(1)通过改变微球载体
的内部构成，即基质成分和/或孔径大小，得到特异性的结构编码信息；(2)利用微球载体的
多孔结构(即内部空间)可以装载荧光染料分子，在实现荧光编码功能的同时也使微球被功
能化基团修饰，并且聚合物分子主要通过物理/化学作用结合在内部孔壁上，有利于减少对
微球载体结构编码性能的影响；(3)利用微球载体的外表面可以进行磁性纳米颗粒和以量
子点为代表的荧光纳米颗粒的组装，既赋予了微球载体磁响应性能和荧光编码性能，同时
也尽可能的保护了微球载体的内部结构编码性能。以上分区域的功能结构设计，实现了微
球载体各个独立区域发挥各自功能并减少相互影响，保证了编码过程的可控性和重复性。
本发明充分利用了载体微球的多孔结构特征及其拥有的三个区域，即载体材料骨架、内部
孔道和载体的外表面，进行了合理的分区域的功能设计，具体如下：(1)通过改变微球载体
的内部构成，即基质成分和/或孔径大小，得到特异性的结构编码信息；(2)利用微球载体的
多孔结构(即内部空间)可以装载荧光染料分子，在实现荧光编码功能的同时也使微球被功
能化基团修饰，并且聚合物分子主要通过物理/化学作用结合在内部孔壁上，有利于减少对
微球载体结构编码性能的影响；(3)利用微球载体的外表面可以进行磁性纳米颗粒和以量
子点为代表的荧光纳米颗粒的组装，既赋予了微球载体磁响应性能和荧光编码性能，同时
也尽可能的保护了微球载体的内部结构编码性能。以上分区域的功能结构设计，实现了微
球载体各个独立区域发挥各自功能并减少相互影响，保证了编码过程的可控性和重复性。
[0145] 5、本发明采用的制备方法为层层自组装方法，首先通过物理/化学作用将标记有荧光染料的氨基聚合物与微球载体组装，从而将荧光染料装载于内部空间，并同时实现了
微球表面的氨基化修饰；其次，通过磁性纳米颗粒与氨基聚合物的物理/化学作用将磁性纳
米颗粒组装于微球载体的外表面；再者，通过将量子点等为代表的荧光纳米颗粒与氨基聚
合物的配位或静电作用将其自组装于微球载体的外表面；最后，再在最外层包覆氧化硅保
护层并进行功能分子的修饰。上述荧光染料、磁性纳米颗粒和荧光纳米颗粒的装载过程均
利用层层组装方法，并根据不同的分子作用方式改变自组装的溶剂环境，制备方法简便、重
复性好。
微球表面的氨基化修饰；其次，通过磁性纳米颗粒与氨基聚合物的物理/化学作用将磁性纳
米颗粒组装于微球载体的外表面；再者，通过将量子点等为代表的荧光纳米颗粒与氨基聚
合物的配位或静电作用将其自组装于微球载体的外表面；最后，再在最外层包覆氧化硅保
护层并进行功能分子的修饰。上述荧光染料、磁性纳米颗粒和荧光纳米颗粒的装载过程均
利用层层组装方法，并根据不同的分子作用方式改变自组装的溶剂环境，制备方法简便、重
复性好。
[0146] 6、本发明提出的编码微球阵列在应用过程中，可以选择合适的荧光编码元素(例如本发明优选的微球载体内部空间装载的绿色荧光染料FITC，以及微球载体外表面组装的
CdSe/ZnS红色量子点)，再结合载体微球结构编码与FSC‑SSC散射光信号的关系，可实现单
色激光对所有编码信号的同时激发(即结构信号、绿色荧光信号和红色荧光信号，均可被
488nm激光源激发)。可以极大的降低解码成本，使解码过程变得更加简单便捷。
CdSe/ZnS红色量子点)，再结合载体微球结构编码与FSC‑SSC散射光信号的关系，可实现单
色激光对所有编码信号的同时激发(即结构信号、绿色荧光信号和红色荧光信号，均可被
488nm激光源激发)。可以极大的降低解码成本，使解码过程变得更加简单便捷。
[0147] 本发明的掺杂荧光染料的编码微球和阵列及制备方法的有益效果包括：
[0148] 1、本发明提出的通过中介物质介导的荧光染料掺杂方法对不同种类的微球载体(包括无机微球和聚合物微球)具有普适性。在商业化产品中，通常采用溶胀法使荧光分子
扩散进入聚合物微球中以制备编码微球，但该方法并不适用于无机微球载体，不具有普适
性。本发明利用荧光分子共价键标记的中介物质作为掺杂原料，通过物理/化学作用结合至
多孔微球的内部，从而实现微球载体对荧光染料的装载；这里的物理/化学作用可根据微球
和聚合物分子的理化特性进行选择，包括静电作用、亲疏水作用、氢键作用、配位作用、共价
键作用，对于无机微球和聚合物微球均具有适用性。
扩散进入聚合物微球中以制备编码微球，但该方法并不适用于无机微球载体，不具有普适
性。本发明利用荧光分子共价键标记的中介物质作为掺杂原料，通过物理/化学作用结合至
多孔微球的内部，从而实现微球载体对荧光染料的装载；这里的物理/化学作用可根据微球
和聚合物分子的理化特性进行选择，包括静电作用、亲疏水作用、氢键作用、配位作用、共价
键作用，对于无机微球和聚合物微球均具有适用性。
[0149] 2、本发明中以具有高比表面积和大孔容积的多孔微球为载体，充分利用了微球的内部空间装载荧光染料，可以实现较高的荧光分子荷载量，即可实现较宽的荧光强度调节
范围；再结合不同荧光染料的共同掺杂，最终可以实现较高的荧光编码容量，满足实际多指
标检测的需求。
范围；再结合不同荧光染料的共同掺杂，最终可以实现较高的荧光编码容量，满足实际多指
标检测的需求。
[0150] 3、本发明提出的编码方法简单，编码控制精准。仅需用不同的荧光染料分别对中介物质进行共价键标记，再以不同的比例与未荧光标记的聚合物分子进行混合，即可便捷
和精确地调控微球的荧光编码强度；此外，荧光染料标记的聚合物分子不需要进一步纯化，
可直接与多孔微球通过物理/化学作用装载于微球内部，并在后续洗涤过程中可将游离荧
光分子去除，制备方法和编码过程十分简便、可控。
和精确地调控微球的荧光编码强度；此外，荧光染料标记的聚合物分子不需要进一步纯化，
可直接与多孔微球通过物理/化学作用装载于微球内部，并在后续洗涤过程中可将游离荧
光分子去除，制备方法和编码过程十分简便、可控。
[0151] 4、本发明在荧光编码的基础上，可将磁性纳米颗粒通过物理/化学作用组装在微球的外表面，赋予编码微球超顺磁性，便于后续磁场作用下的分离操纵。
[0152] 5、本发明制备所得的荧光编码微球表面为二氧化硅保护壳层，可以防止微球内部荧光染料的泄漏；同时壳层表面的硅羟基有利于进一步修饰各类功能基团，为编码微球偶
联探针提供反应位点。
联探针提供反应位点。
[0153] 以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
[0154] 图1是本发明的一个实施例中采用SiO2‑17、SiO2‑48、PS‑14、PS‑37和PS‑51五类微球，利用其结构编码得到的5重编码微球阵列对应的流式解码结果图；
[0155] 图2是本发明的一个实施例中采用SiO2‑17、SiO2‑48、PS‑14、PS‑37和PS‑51五类微球，利用其内部结构+内部空间荧光+外表面荧光进行联合编码，并通过磁性纳米颗粒的自
组装赋予微球磁响应性能，制备所得到的五类编码微球的磁滞回线；
组装赋予微球磁响应性能，制备所得到的五类编码微球的磁滞回线；
[0156] 图3是本发明的一个实施例中采用SiO2‑17、SiO2‑48、PS‑14、PS‑37和PS‑51五类微球，利用其内部结构+内部空间荧光+外表面荧光进行联合编码，并通过磁性纳米颗粒的自
组装赋予微球磁响应性能，制备所得到的300重编码微球阵列对应的流式解码结果图；
组装赋予微球磁响应性能，制备所得到的300重编码微球阵列对应的流式解码结果图；
[0157] 图4是本发明的一个实施例中采用直径为1.7μm的多孔二氧化硅为微球载体，利用FITC作为掺杂染料，并通过磁性纳米颗粒的自组装赋予微球磁响应性能，制备得到的7重荧
光编码微球的流式解码结果图；
光编码微球的流式解码结果图；
[0158] 图5是本发明的一个实施例中采用直径为5.5μm的多孔二氧化硅为微球载体，利用RITC作为掺杂染料，并通过磁性纳米颗粒的自组装赋予微球磁响应性能，制备得到的6重荧
光编码微球的流式解码结果图；
光编码微球的流式解码结果图；
[0159] 图6是本发明的一个实施例中采用直径为3.3μm的多孔二氧化硅为微球载体，利用FITC和RITC作为掺杂染料，并通过磁性纳米颗粒的自组装赋予微球磁响应性能，制备得到
的32重荧光编码微球的流式解码结果图；
的32重荧光编码微球的流式解码结果图；
[0160] 图7是本发明的一个实施例中采用直径为3.3μm的多孔二氧化硅为微球载体，利用FITC和RITC作为掺杂染料，并通过磁性纳米颗粒的自组装赋予微球磁响应性能，制备得到
的荧光编码微球的磁场分离照片；
的荧光编码微球的磁场分离照片；
[0161] 图8是本发明的一个实施例中采用直径为5.5μm的多孔二氧化硅为微球载体，利用FITC和RITC作为掺杂染料，并通过磁性纳米颗粒的自组装赋予微球磁响应性能，制备得到
的51重荧光编码微球的流式解码结果图；
的51重荧光编码微球的流式解码结果图；
[0162] 图9是本发明的一个实施例中采用直径为5.5μm的多孔二氧化硅为微球载体，利用FITC和RITC作为掺杂染料，并通过磁性纳米颗粒的自组装赋予微球磁响应性能，制备所得
51重荧光编码微球的激光共聚焦荧光显微镜下的二维阵列排布图。
51重荧光编码微球的激光共聚焦荧光显微镜下的二维阵列排布图。
具体实施方式
[0163] 实施例一
[0164] 本实施例的编码微球，其所采用的一组微球载体具备相近的直径和不同的内部结构，将微球载体内部结构变化作为第一维度编码信息；其中微球载体是介孔微球，其具有多
孔结构，不同的内部结构可以是基质成分不同，也可以是孔径大小不同，或者也可以是基质
成分和孔径大小均不同。
孔结构，不同的内部结构可以是基质成分不同，也可以是孔径大小不同，或者也可以是基质
成分和孔径大小均不同。
[0165] 微球载体的直径选择范围是0.2～20μm，优选范围是3～6μm。微球载体的孔径选择范围是2～100nm，优选范围是10～60nm。微球载体的基质成分包括无机物和聚合物。无机物
包括二氧化硅和/或二氧化钛。聚合物包括聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯
酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二乙烯基苯和/或上述聚合物的共聚物。
包括二氧化硅和/或二氧化钛。聚合物包括聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯
酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二乙烯基苯和/或上述聚合物的共聚物。
[0166] 为了有效区分结构编码信息，不同种类的微球载体在流式FSC‑SSC的二维散点图中应具有显著不同的信号分群，为达到更好的效果，本实施例优选以下五类直径为～5μm的
微球载体：
微球载体：
[0167] (1)直径为5.2μm、孔径为17nm的介孔二氧化硅微球，以下记为SiO2‑17；
[0168] (2)直径为5.3μm、孔径为48nm的介孔二氧化硅微球，以下记为SiO2‑48；
[0169] (3)直径为4.8μm、孔径为14nm的介孔聚苯乙烯微球，以下记为PS‑14；
[0170] (4)直径为5.5μm、孔径为37nm的介孔聚苯乙烯微球，以下记为PS‑37；
[0171] (5)直径为5.0μm、孔径为51nm的介孔聚苯乙烯微球，以下记为PS‑51。
[0172] 本实施例的微球载体的内部空间和外表面可装载荧光材料，内部空间荧光材料的中心发射波长和外表面荧光材料的中心发射波长相差30nm以上，为达到更好的效果，实施
例中微球载体内部空间包含的荧光元素优选发射波长为517nm的绿色荧光染料FITC作为第
二维度的编码元素，微球载体外表面包含的荧光元素优选发射波长为600nm的CdSe/ZnS红
色量子点作为第三维度的编码元素。需要说明的是，本发明可以通过许多不同的形式来实
现，并不限于本文所描述的优选参数和实施例。提供这些优选参数和实施例的目的是使对
本发明公开内容的理解更加透彻全面。
例中微球载体内部空间包含的荧光元素优选发射波长为517nm的绿色荧光染料FITC作为第
二维度的编码元素，微球载体外表面包含的荧光元素优选发射波长为600nm的CdSe/ZnS红
色量子点作为第三维度的编码元素。需要说明的是，本发明可以通过许多不同的形式来实
现，并不限于本文所描述的优选参数和实施例。提供这些优选参数和实施例的目的是使对
本发明公开内容的理解更加透彻全面。
[0173] 以下详述本实施例中一种编码微球的制备方法。
[0174] 步骤1、选择微球载体。
[0175] 根据微球载体的基质成分、直径和孔径可以限定编码微球的第一维度编码信息。如在本实施例中，选择如上所述的五类直径为～5μm的微球载体。
[0176] 步骤2、对选择的介孔聚苯乙烯微球进行羧基功能化修饰，如步骤1中选择的是介孔二氧化硅微球可以跳过本步骤。
[0177] 取8×109个介孔聚苯乙烯微球加入到5mL氯仿中并超声分散30min，然后加入溶解有500mg PSMA的氯仿溶液，混合溶液超声40min。再加入35mL NaOH溶液(0.1M)，搅拌乳化，
并继续超声处理40min。微球样品离心去掉上清，依次用乙醇和水清洗三次。最后所得微球
分散于10mL水溶液中，即得到修饰有羧基的介孔聚苯乙烯微球。
并继续超声处理40min。微球样品离心去掉上清，依次用乙醇和水清洗三次。最后所得微球
分散于10mL水溶液中，即得到修饰有羧基的介孔聚苯乙烯微球。
[0178] 步骤3、在微球载体的内部空间装载荧光染料。
[0179] 首先，将150mg的PEI(分子量为750K)溶解于15mL的NaCl溶液(0.5M)中，将pH调为8.0，记为空白PEI溶液。向上述空白PEI溶液中加入4.4mg的FITC，在30℃条件下避光震荡过
夜反应，得到标记有FITC的PEI溶液(记为FITC‑PEI)。接着，以不同的比例混合FITC‑PEI溶
7
液和空白PEI溶液，配制总体积为1.5mL的混合溶液，加入2×10个介孔二氧化硅微球或步
骤2所得修饰有羧基的介孔聚苯乙烯微球，超声混合均匀后避光旋转反应20min。反应后离
心去上清，用水清洗三次，所得微球分散于0.4mL水溶液中，即得到内部空间装载有荧光染
料的微球载体。
夜反应，得到标记有FITC的PEI溶液(记为FITC‑PEI)。接着，以不同的比例混合FITC‑PEI溶
7
液和空白PEI溶液，配制总体积为1.5mL的混合溶液，加入2×10个介孔二氧化硅微球或步
骤2所得修饰有羧基的介孔聚苯乙烯微球，超声混合均匀后避光旋转反应20min。反应后离
心去上清，用水清洗三次，所得微球分散于0.4mL水溶液中，即得到内部空间装载有荧光染
料的微球载体。
[0180] 步骤4、在微球载体的外表面装配磁性纳米颗粒。
[0181] 将步骤3所得的0.4mL微球分散液在超声条件下逐滴加入到1.1mL含有Fe3O4磁性纳米颗粒(粒径为8nm，表面带有羧基)的水溶液中，避光旋转反应30min。反应后磁分离去上
清，用水清洗三次。然后将所得微球再加入至1.5mL步骤2提及的空白PEI溶液中，避光旋转
反应20min，反应后磁分离去上清，用水清洗三次，即得到外表面装配有Fe3O4磁性纳米颗粒
且在最外层修饰有PEI的微球载体。
清，用水清洗三次。然后将所得微球再加入至1.5mL步骤2提及的空白PEI溶液中，避光旋转
反应20min，反应后磁分离去上清，用水清洗三次，即得到外表面装配有Fe3O4磁性纳米颗粒
且在最外层修饰有PEI的微球载体。
[0182] 步骤5、在微球载体的外表面装配量子点。
[0183] 配制量子点的氯仿/正丁醇混合溶液：取一定量的量子点(以直径为6nm，发射波长为600nm的CdSe/ZnS量子点为例)加入至总体积为1mL的氯仿/正丁醇(v/v＝1:20)混合溶液
7
中，配制不同的量子点浓度并混合均匀。取2×10个步骤3或4得到的表面修饰有PEI的微
球，离心或磁分离去上清，微球用无水乙醇清洗三次，然后加入至上述含有量子点的氯仿/
正丁醇混合溶剂中，避光旋转反应1h，反应后去上清，依次用氯仿/正丁醇的混合溶剂、乙
醇、水进行清洗。再将所得微球加入到1mL含有PEI(分子量为25K)浓度为9mg/mL的NaCl溶液
(0.1M，pH＝8.0)中，避光旋转反应1h，反应后去上清，用水清洗三次，即得到外表面装配有
量子点且在最外层修饰有PEI的微球载体。
7
中，配制不同的量子点浓度并混合均匀。取2×10个步骤3或4得到的表面修饰有PEI的微
球，离心或磁分离去上清，微球用无水乙醇清洗三次，然后加入至上述含有量子点的氯仿/
正丁醇混合溶剂中，避光旋转反应1h，反应后去上清，依次用氯仿/正丁醇的混合溶剂、乙
醇、水进行清洗。再将所得微球加入到1mL含有PEI(分子量为25K)浓度为9mg/mL的NaCl溶液
(0.1M，pH＝8.0)中，避光旋转反应1h，反应后去上清，用水清洗三次，即得到外表面装配有
量子点且在最外层修饰有PEI的微球载体。
[0184] 步骤6、微球载体的氧化硅包覆及表面功能化修饰。
[0185] 取2×107个步骤3或4或5得到的表面修饰有PEI的微球，离心或磁分离去上清，微球用无水乙醇清洗两次，加入到含有3mL乙醇、0.3mL水和40μL TEOS的混合体系中，避光旋
转反应30min。然后，加入22μL的浓氨水，在30℃条件下继续避光旋转反应22h，反应后去上
清，依次用无水乙醇和水清洗三次，即得到表面包覆有氧化硅的微球载体。将所得微球分散
于0.25mL乙醇中，加入11.5μL的浓氨水和50μL含有APTES的乙醇溶液(4.2μL的APTES稀释于
1.5mL的乙醇中)，在40℃条件下旋转反应4h，反应后去上清，用无水乙醇洗三次，即得到表
面修饰有氨基的微球载体。将所得微球用MEST(10mM，pH＝5.0)溶液清洗三次，并分散于1mL
的MEST(10mM，pH＝5.0)中，加入2.5mg的PAA(分子量为5K)和0.5mg的EDC，旋转反应2h，反应
后去上清，用水清洗三次，即得到表面修饰有羧基的微球载体。
转反应30min。然后，加入22μL的浓氨水，在30℃条件下继续避光旋转反应22h，反应后去上
清，依次用无水乙醇和水清洗三次，即得到表面包覆有氧化硅的微球载体。将所得微球分散
于0.25mL乙醇中，加入11.5μL的浓氨水和50μL含有APTES的乙醇溶液(4.2μL的APTES稀释于
1.5mL的乙醇中)，在40℃条件下旋转反应4h，反应后去上清，用无水乙醇洗三次，即得到表
面修饰有氨基的微球载体。将所得微球用MEST(10mM，pH＝5.0)溶液清洗三次，并分散于1mL
的MEST(10mM，pH＝5.0)中，加入2.5mg的PAA(分子量为5K)和0.5mg的EDC，旋转反应2h，反应
后去上清，用水清洗三次，即得到表面修饰有羧基的微球载体。
[0186] 根据上述的制备方法，可以获得最多采用三种编码方式的编码微球，包括基于微球载体内部结构的编码方式、基于微球载体内部荧光材料的编码方式以及基于微球载体外
部荧光材料的编码方式。同样可以根据需要选择其中的任意一种或两种编码方式，并且也
可以选择性地加入磁性纳米颗粒。
部荧光材料的编码方式。同样可以根据需要选择其中的任意一种或两种编码方式，并且也
可以选择性地加入磁性纳米颗粒。
[0187] 对于编码微球所涉及的编码维度，除根据微球载体内部结构可限定一个维度的编码信息外，微球载体内部和外部可根据荧光材料的选择来限定多个维度的编码信息，如在
微球载体内部采用两种不同中心发射波长的荧光染料，即可以限定两个维度的编码信息；
可以通过重复步骤5的方法装载两种不同中心发射波长的量子点，以限定两个维度的编码
信息。
微球载体内部采用两种不同中心发射波长的荧光染料，即可以限定两个维度的编码信息；
可以通过重复步骤5的方法装载两种不同中心发射波长的量子点，以限定两个维度的编码
信息。
[0188] 当采用不同直径的微球载体时(例如～1μm、～3μm、～7μm等)，编码微球的制备方法与上述基本相同，仅需根据微球表面积的变化对相关反应物用量稍作调整。
[0189] 以下列出几组编码微球阵列的组合，以便于进一步理解编码微球的多维度的编码信息，以及编码微球阵列中各种编码微球间编码信息的差异。
[0190] 编码微球阵列1(SiO2‑17、SiO2‑48、PS‑14、PS‑37和PS‑51五类微球的结构编码)：
[0191] 1.采用SiO2‑17原始微球直接作为微球载体，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I1＝1，按照荧光强度水平划分的微球外表面的编码数量O1＝1，该类微球
的编码容量X1＝I1×O1＝1。
的编码容量X1＝I1×O1＝1。
[0192] 2.采用SiO2‑48原始微球直接作为微球载体，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I2＝1，按照荧光强度水平划分的微球外表面的编码数量O2＝1，该类微球
的编码容量X2＝I2×O2＝1。
的编码容量X2＝I2×O2＝1。
[0193] 3.采用经过步骤2得到的羧基化PS‑14微球作为微球载体，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I3＝1，按照荧光强度水平划分的微球外表面的编码数量O3＝
1，该类微球的编码容量X3＝I3×O3＝1。
1，该类微球的编码容量X3＝I3×O3＝1。
[0194] 4.采用经过步骤2得到的羧基化PS‑37微球作为微球载体，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I4＝1，按照荧光强度水平划分的微球外表面的编码数量O4＝
1，该类微球的编码容量X4＝I4×O4＝1。
1，该类微球的编码容量X4＝I4×O4＝1。
[0195] 5.采用经过步骤2得到的羧基化PS‑51微球作为微球载体，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I5＝1，按照荧光强度水平划分的微球外表面的编码数量O5＝
1，该类微球的编码容量X5＝I5×O5＝1。
1，该类微球的编码容量X5＝I5×O5＝1。
[0196] 6.将上述五类微球相组合，即引入结构编码信息，通过流式细胞仪的FSC和SSC两个散射光通道对结构信息进行解码，最终构建了具有5重的编码微球阵列，即Y＝(I1×O1)+
(I2×O2)+(I3×O3)+(I4×O4)+(I5×O5)＝5。
(I2×O2)+(I3×O3)+(I4×O4)+(I5×O5)＝5。
[0197] 如图1所示，利用五类直径为～5μm左右的微球载体，通过改变微球的内部结构(包括基质成分和/或孔径大小的不同)，以流式细胞仪作为解码平台读取微球的特征散射光学
信号(FSC和SSC)，得到了在FSC‑SSC二维解码图中具有显著信号强度差异的五个分群，揭示
了微球载体的内部结构可以有效转变为编码信息。尽管五类微球具有相近的直径，按照本
领域公知的技术常识，各微球应具有接近的FSC值；然而分析后发现，微球载体的内部结构
不同除了会影响SSC信号值，还使得部分载体的FSC信号值也出现了显著性差异，这是本领
域未曾有过的发现。也就是说，微球载体的内部结构作为其内在固有属性，可以有效转变为
光学编码信息，而这种新的编码维度素可以和其它编码元素进行合理组合，大幅度提升编
码容量。
信号(FSC和SSC)，得到了在FSC‑SSC二维解码图中具有显著信号强度差异的五个分群，揭示
了微球载体的内部结构可以有效转变为编码信息。尽管五类微球具有相近的直径，按照本
领域公知的技术常识，各微球应具有接近的FSC值；然而分析后发现，微球载体的内部结构
不同除了会影响SSC信号值，还使得部分载体的FSC信号值也出现了显著性差异，这是本领
域未曾有过的发现。也就是说，微球载体的内部结构作为其内在固有属性，可以有效转变为
光学编码信息，而这种新的编码维度素可以和其它编码元素进行合理组合，大幅度提升编
码容量。
[0198] 编码微球阵列2(SiO2‑17、SiO2‑48、PS‑14、PS‑37和PS‑51五类磁性微球的结构编码)：
[0199] 1.采用SiO2‑17原始微球作为载体基质，按照上述制备方法中步骤3、步骤4和步骤6在微球载体的外表面装配磁性纳米颗粒并进行表面包覆和修饰，步骤3中采用空白PEI进
行制备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I1＝1，按照荧光强度水平划
分的微球外表面的编码数量O1＝1，该类磁性微球的编码容量X1＝I1×O1＝1。
行制备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I1＝1，按照荧光强度水平划
分的微球外表面的编码数量O1＝1，该类磁性微球的编码容量X1＝I1×O1＝1。
[0200] 2.采用SiO2‑48原始微球作为载体基质，按照上述制备方法中步骤3、步骤4和步骤6在微球载体的外表面装配磁性纳米颗粒并进行表面包覆和修饰，步骤3中采用空白PEI进
行制备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I2＝1，按照荧光强度水平划
分的微球外表面的编码数量O2＝1，该类磁性微球的编码容量X2＝I2×O2＝1。
行制备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I2＝1，按照荧光强度水平划
分的微球外表面的编码数量O2＝1，该类磁性微球的编码容量X2＝I2×O2＝1。
[0201] 3.采用经过上述制备方法中步骤2得到的羧基化PS‑14微球作为载体基质，按照步骤3、步骤4和步骤6在微球载体的外表面装配磁性纳米颗粒并进行表面包覆和修饰，步骤3
中采用空白PEI进行制备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I3＝1，按
照荧光强度水平划分的微球外表面的编码数量O3＝1，该类磁性微球的编码容量X3＝I3×O3
＝1。
中采用空白PEI进行制备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I3＝1，按
照荧光强度水平划分的微球外表面的编码数量O3＝1，该类磁性微球的编码容量X3＝I3×O3
＝1。
[0202] 4.采用经过上述制备方法中步骤2得到的羧基化PS‑37微球作为载体基质，按照步骤3、步骤4和步骤6在微球载体的外表面装配磁性纳米颗粒并进行表面包覆和修饰，步骤3
中采用空白PEI进行制备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I4＝1，按
照荧光强度水平划分的微球外表面的编码数量O4＝1，该类磁性微球的编码容量X4＝I4×O4
＝1。
中采用空白PEI进行制备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I4＝1，按
照荧光强度水平划分的微球外表面的编码数量O4＝1，该类磁性微球的编码容量X4＝I4×O4
＝1。
[0203] 5.采用经过上述制备方法中步骤2得到的羧基化PS‑51微球作为载体基质，按照步骤3、步骤4和步骤6在微球载体的外表面装配磁性纳米颗粒并进行表面包覆和修饰，步骤3
中采用空白PEI进行制备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I5＝1，按
照荧光强度水平划分的微球外表面的编码数量O5＝1，该类磁性微球的编码容量X5＝I5×O5
＝1。
中采用空白PEI进行制备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I5＝1，按
照荧光强度水平划分的微球外表面的编码数量O5＝1，该类磁性微球的编码容量X5＝I5×O5
＝1。
[0204] 6.将上述五类磁性微球相组合，即引入结构编码信息，通过流式细胞仪的FSC和SSC两个散射光通道对结构信息进行解码，最终构建了具有5重的磁性编码微球阵列，即Y＝
(I1×O1)+(I2×O2)+(I3×O3)+(I4×O4)+(I5×O5)＝5。
(I1×O1)+(I2×O2)+(I3×O3)+(I4×O4)+(I5×O5)＝5。
[0205] 编码微球阵列3(SiO2‑17、SiO2‑48、PS‑14和PS‑51四类微球的结构+内部空间荧光的联合编码)：
[0206] 1.采用SiO2‑17原始微球作为载体基质，按照上述制备方法中步骤3和步骤6在微球载体的内部空间装载荧光染料FITC并进行表面包覆和修饰，步骤3中通过调节FITC‑PEI
溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分的微球内部空间编码的
11重编码微球，即I1＝11，而按照荧光强度水平划分的微球外表面的编码数量O1＝1，该类微
球的编码容量X1＝I1×O1＝11。
溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分的微球内部空间编码的
11重编码微球，即I1＝11，而按照荧光强度水平划分的微球外表面的编码数量O1＝1，该类微
球的编码容量X1＝I1×O1＝11。
[0207] 2.采用SiO2‑48原始微球作为载体基质，按照上述制备方法中步骤3和步骤6在微球载体的内部空间装载荧光染料FITC并进行表面包覆和修饰，步骤3中通过调节FITC‑PEI
溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分的微球内部空间编码的
10重编码微球，即I2＝10，而按照荧光强度水平划分的微球外表面的编码数量O2＝1，该类微
球的编码容量X2＝I2×O2＝10。
溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分的微球内部空间编码的
10重编码微球，即I2＝10，而按照荧光强度水平划分的微球外表面的编码数量O2＝1，该类微
球的编码容量X2＝I2×O2＝10。
[0208] 3.采用经过上述制备方法中步骤2得到的羧基化PS‑14微球作为载体基质，按照步骤3和步骤6在微球载体的内部空间装载荧光染料FITC并进行表面包覆和修饰，步骤3中通
过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分的微球
内部空间编码的10重编码微球，即I3＝10，而按照荧光强度水平划分的微球外表面的编码
数量O3＝1，该类微球的编码容量X3＝I3×O3＝10。
过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分的微球
内部空间编码的10重编码微球，即I3＝10，而按照荧光强度水平划分的微球外表面的编码
数量O3＝1，该类微球的编码容量X3＝I3×O3＝10。
[0209] 4.采用经过上述制备方法中步骤2得到的羧基化PS‑51微球作为载体基质，按照步骤3和步骤6在微球载体的内部空间装载荧光染料FITC并进行表面包覆和修饰，步骤3中通
过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分的微球
内部空间编码的9重编码微球，即I4＝9，而按照荧光强度水平划分的微球外表面的编码数
量O4＝1，该类微球的编码容量X4＝I4×O4＝9。
过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分的微球
内部空间编码的9重编码微球，即I4＝9，而按照荧光强度水平划分的微球外表面的编码数
量O4＝1，该类微球的编码容量X4＝I4×O4＝9。
[0210] 5.将上述四类微球相组合，即引入结构编码信息，通过流式细胞仪的FSC和SSC两个散射光通道对结构信息进行解码，再通过荧光检测通道对内部空间荧光信息进行解码，
最终构建了具有40重的编码微球阵列，即Y＝(I1×O1)+(I2×O2)+(I3×O3)+(I4×O4)＝40。
最终构建了具有40重的编码微球阵列，即Y＝(I1×O1)+(I2×O2)+(I3×O3)+(I4×O4)＝40。
[0211] 编码微球阵列4(SiO2‑17、SiO2‑48和PS‑51三类磁性微球的结构+内部空间荧光的联合编码)：
[0212] 1.采用SiO2‑17原始微球作为载体基质，按照上述制备方法中步骤3、步骤4和步骤6在微球载体的内部空间装载荧光染料FITC、外表面装配磁性纳米颗粒并进行表面包覆和
修饰，步骤3中通过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC荧光强度
水平划分的微球内部空间编码的11重编码微球，即I1＝11，而按照荧光强度水平划分的微
球外表面的编码数量O1＝1，该类磁性微球的编码容量X1＝I1×O1＝11。
修饰，步骤3中通过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC荧光强度
水平划分的微球内部空间编码的11重编码微球，即I1＝11，而按照荧光强度水平划分的微
球外表面的编码数量O1＝1，该类磁性微球的编码容量X1＝I1×O1＝11。
[0213] 2.采用SiO2‑48原始微球作为载体基质，按照上述制备方法中步骤3、步骤4和步骤6在微球载体的内部空间装载荧光染料FITC、外表面装配磁性纳米颗粒并进行表面包覆和
修饰，步骤3中通过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC荧光强度
水平划分的微球内部空间编码的10重编码微球，即I2＝10，而按照荧光强度水平划分的微
球外表面的编码数量O2＝1，该类磁性微球的编码容量X2＝I2×O2＝10。
修饰，步骤3中通过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC荧光强度
水平划分的微球内部空间编码的10重编码微球，即I2＝10，而按照荧光强度水平划分的微
球外表面的编码数量O2＝1，该类磁性微球的编码容量X2＝I2×O2＝10。
[0214] 3.采用经过上述制备方法中步骤2得到的羧基化PS‑51微球作为载体基质，按照步骤3、步骤4和步骤6在微球载体的内部空间装载荧光染料FITC并进行表面包覆和修饰，步骤
3中通过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分的
微球内部空间编码的9重编码微球，即I3＝9，而按照荧光强度水平划分的微球外表面的编
码数量O3＝1，该类磁性微球的编码容量X3＝I3×O3＝9。
3中通过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分的
微球内部空间编码的9重编码微球，即I3＝9，而按照荧光强度水平划分的微球外表面的编
码数量O3＝1，该类磁性微球的编码容量X3＝I3×O3＝9。
[0215] 4.将上述三类磁性微球相组合，即引入结构编码信息，通过流式细胞仪的FSC和SSC两个散射光通道对结构信息进行解码，再通过荧光检测通道对内部空间荧光信息进行
解码，最终构建了具有30重的磁性编码微球阵列，即Y＝(I1×O1)+(I2×O2)+(I3×O3)＝30。
解码，最终构建了具有30重的磁性编码微球阵列，即Y＝(I1×O1)+(I2×O2)+(I3×O3)＝30。
[0216] 编码微球阵列5(SiO2‑17、PS‑14和PS‑51三类微球的结构+外表面荧光的联合编码)：
[0217] 1.采用SiO2‑17原始微球作为载体基质，按照上述制备方法中步骤3、步骤5和步骤6在微球载体的外表面装配量子点并进行表面包覆和修饰，步骤3中采用空白PEI进行制备，
则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I1＝1，步骤5中通过调节量子点的加
入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编码的6重编码微球，即O1＝6，该
类微球的编码容量X1＝I1×O1＝6。
则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I1＝1，步骤5中通过调节量子点的加
入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编码的6重编码微球，即O1＝6，该
类微球的编码容量X1＝I1×O1＝6。
[0218] 2.采用经过上述制备方法中步骤2得到的羧基化PS‑14微球作为载体基质，按照步骤3、步骤5和步骤6在微球载体的外表面装配量子点并进行表面包覆和修饰，步骤3中采用
空白PEI进行制备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I2＝1，步骤5中通
过调节量子点的加入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编码的6重编
码微球，即O2＝6，该类微球的编码容量X2＝I2×O2＝6。
空白PEI进行制备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I2＝1，步骤5中通
过调节量子点的加入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编码的6重编
码微球，即O2＝6，该类微球的编码容量X2＝I2×O2＝6。
[0219] 3.采用经过上述制备方法中步骤2得到的羧基化PS‑51微球作为载体基质，按照步骤3、步骤5和步骤6在微球载体的外表面装配量子点并进行表面包覆和修饰，步骤3中采用
空白PEI进行制备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I3＝1，步骤5中通
过调节量子点的加入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编码的6重编
码微球，即O3＝6，该类微球的编码容量X3＝I3×O3＝6。
空白PEI进行制备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I3＝1，步骤5中通
过调节量子点的加入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编码的6重编
码微球，即O3＝6，该类微球的编码容量X3＝I3×O3＝6。
[0220] 4.将上述三类微球相组合，即引入结构编码信息，通过流式细胞仪的FSC和SSC两个散射光通道对结构信息进行解码，再通过荧光检测通道对外表面荧光信息进行解码，最
终构建了具有18重的编码微球阵列，即Y＝(I1×O1)+(I2×O2)+(I3×O3)＝18。
终构建了具有18重的编码微球阵列，即Y＝(I1×O1)+(I2×O2)+(I3×O3)＝18。
[0221] 编码微球阵列6(SiO2‑17、SiO2‑48、PS‑14和PS‑51四类磁性微球的结构+外表面荧光的联合编码)：
[0222] 1.采用SiO2‑17原始微球作为载体基质，按照上述制备方法中步骤3、步骤4、步骤5和步骤6在微球载体的外表面装配磁性纳米颗粒和量子点并进行表面包覆和修饰，步骤3中
采用空白PEI进行制备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I1＝1，步骤5
中通过调节量子点的加入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编码的6
重编码微球，即O1＝6，该类磁性微球的编码容量X1＝I1×O1＝6。
采用空白PEI进行制备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I1＝1，步骤5
中通过调节量子点的加入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编码的6
重编码微球，即O1＝6，该类磁性微球的编码容量X1＝I1×O1＝6。
[0223] 2.采用SiO2‑48原始微球作为载体基质，按照上述制备方法中步骤3、步骤4、步骤5和步骤6在微球载体的外表面装配磁性纳米颗粒和量子点并进行表面包覆和修饰，步骤3中
采用空白PEI进行制备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I2＝1，步骤5
中通过调节量子点的加入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编码的6
重编码微球，即O2＝6，该类磁性微球的编码容量X2＝I2×O2＝6。
采用空白PEI进行制备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I2＝1，步骤5
中通过调节量子点的加入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编码的6
重编码微球，即O2＝6，该类磁性微球的编码容量X2＝I2×O2＝6。
[0224] 3.采用经过上述制备方法中步骤2得到的羧基化PS‑14微球作为载体基质，按照步骤3、步骤4、步骤5和步骤6在微球载体的外表面装配磁性纳米颗粒和量子点并进行表面包
覆和修饰，步骤3中采用空白PEI进行制备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编
码数量I3＝1，步骤5中通过调节量子点的加入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的
微球外表面编码的6重编码微球，即O3＝6，该类磁性微球的编码容量X3＝I3×O3＝6。
覆和修饰，步骤3中采用空白PEI进行制备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编
码数量I3＝1，步骤5中通过调节量子点的加入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的
微球外表面编码的6重编码微球，即O3＝6，该类磁性微球的编码容量X3＝I3×O3＝6。
[0225] 4.采用经过上述制备方法中步骤2得到的羧基化PS‑51微球作为载体基质，按照步骤3、步骤4、步骤5和步骤6在微球载体的外表面装配磁性纳米颗粒和量子点并进行表面包
覆和修饰，步骤3中采用空白PEI进行制备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编
码数量I4＝1，步骤5中通过调节量子点的加入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的
微球外表面编码的6重编码微球，即O4＝6，该类磁性微球的编码容量X4＝I4×O4＝6。
覆和修饰，步骤3中采用空白PEI进行制备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编
码数量I4＝1，步骤5中通过调节量子点的加入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的
微球外表面编码的6重编码微球，即O4＝6，该类磁性微球的编码容量X4＝I4×O4＝6。
[0226] 5.将上述四类磁性微球相组合，即引入结构编码信息，通过流式细胞仪的FSC和SSC两个散射光通道对结构信息进行解码，再通过荧光检测通道对外表面荧光信息进行解
码，最终构建了具有24重的磁性编码微球阵列，即Y＝(I1×O1)+(I2×O2)+(I3×O3)+(I4×O4)
＝24。
码，最终构建了具有24重的磁性编码微球阵列，即Y＝(I1×O1)+(I2×O2)+(I3×O3)+(I4×O4)
＝24。
[0227] 编码微球阵列7(SiO2‑17、SiO2‑48、PS‑14和PS‑37四类磁性微球的结构+外表面荧光的联合编码)：
[0228] 本组合中，将微球载体外表面优选组装的发射波长为600nm的CdSe/ZnS量子点调整为发射波长为535nm的NaYF4:Er,Yb上转换荧光纳米颗粒。将上述制备方法中步骤5调整
为：在微球载体的外表面通过配位反应装配上转换荧光纳米颗粒。配制上转换荧光纳米颗
粒的氯仿/正丁醇混合溶液：取一定量的上转换荧光纳米颗粒(直径为25nm，发射波长为
535nm的NaYF4:Er,Yb上转换荧光纳米颗粒)加入至总体积为1mL的氯仿/正丁醇(v/v＝1:
7
20)混合溶液中，配制不同的上转换荧光纳米颗粒浓度并混合均匀。取2×10个步骤4得到
的表面修饰有PEI的微球，磁分离去上清，微球用无水乙醇清洗三次，然后加入至上述含有
上转换荧光纳米颗粒的氯仿/正丁醇混合溶剂中，避光旋转反应1h，反应后去上清，依次用
氯仿/正丁醇的混合溶剂、乙醇、水进行清洗。再将所得微球加入到1mL含有PEI(分子量为
25K)浓度为9mg/mL的NaCl溶液(0.1M，pH＝8.0)中，避光旋转反应1h，反应后去上清，用水清
洗三次，即得到外表面装配有上转换荧光纳米颗粒且在最外层修饰有PEI的微球载体。
为：在微球载体的外表面通过配位反应装配上转换荧光纳米颗粒。配制上转换荧光纳米颗
粒的氯仿/正丁醇混合溶液：取一定量的上转换荧光纳米颗粒(直径为25nm，发射波长为
535nm的NaYF4:Er,Yb上转换荧光纳米颗粒)加入至总体积为1mL的氯仿/正丁醇(v/v＝1:
7
20)混合溶液中，配制不同的上转换荧光纳米颗粒浓度并混合均匀。取2×10个步骤4得到
的表面修饰有PEI的微球，磁分离去上清，微球用无水乙醇清洗三次，然后加入至上述含有
上转换荧光纳米颗粒的氯仿/正丁醇混合溶剂中，避光旋转反应1h，反应后去上清，依次用
氯仿/正丁醇的混合溶剂、乙醇、水进行清洗。再将所得微球加入到1mL含有PEI(分子量为
25K)浓度为9mg/mL的NaCl溶液(0.1M，pH＝8.0)中，避光旋转反应1h，反应后去上清，用水清
洗三次，即得到外表面装配有上转换荧光纳米颗粒且在最外层修饰有PEI的微球载体。
[0229] 1.采用SiO2‑17原始微球作为载体基质，按照上述制备方法中步骤3、步骤4、步骤5(根据编码微球阵列7所调整的步骤5)和步骤6在微球载体的外表面装配磁性纳米颗粒和上
转换荧光纳米颗粒并进行表面包覆和修饰，步骤3中采用空白PEI进行制备，则按照荧光强
度水平划分的微球内部空间的编码数量I1＝1，步骤5(根据编码微球阵列7所调整的步骤5)
中通过调节上转换荧光纳米颗粒的加入浓度，得到按照上转换荧光纳米颗粒荧光强度水平
划分的微球外表面编码的5重编码微球，即O1＝5，该类磁性微球的编码容量X1＝I1×O1＝5。
转换荧光纳米颗粒并进行表面包覆和修饰，步骤3中采用空白PEI进行制备，则按照荧光强
度水平划分的微球内部空间的编码数量I1＝1，步骤5(根据编码微球阵列7所调整的步骤5)
中通过调节上转换荧光纳米颗粒的加入浓度，得到按照上转换荧光纳米颗粒荧光强度水平
划分的微球外表面编码的5重编码微球，即O1＝5，该类磁性微球的编码容量X1＝I1×O1＝5。
[0230] 2.采用SiO2‑48原始微球作为载体基质，按照上述制备方法中步骤3、步骤4、步骤5(根据编码微球阵列7所调整的步骤5)和步骤6在微球载体的外表面装配磁性纳米颗粒和上
转换荧光纳米颗粒并进行表面包覆和修饰，步骤3中采用空白PEI进行制备，则按照荧光强
度水平划分的微球内部空间的编码数量I2＝1，步骤5(根据编码微球阵列7所调整的步骤5)
中通过调节上转换荧光纳米颗粒的加入浓度，得到按照上转换荧光纳米颗粒荧光强度水平
划分的微球外表面编码的5重编码微球，即O2＝5，该类磁性微球的编码容量X2＝I2×O2＝5。
转换荧光纳米颗粒并进行表面包覆和修饰，步骤3中采用空白PEI进行制备，则按照荧光强
度水平划分的微球内部空间的编码数量I2＝1，步骤5(根据编码微球阵列7所调整的步骤5)
中通过调节上转换荧光纳米颗粒的加入浓度，得到按照上转换荧光纳米颗粒荧光强度水平
划分的微球外表面编码的5重编码微球，即O2＝5，该类磁性微球的编码容量X2＝I2×O2＝5。
[0231] 3.采用经过上述制备方法中步骤2得到的羧基化PS‑14微球作为载体基质，按照步骤3、步骤4、步骤5(根据编码微球阵列7所调整的步骤5)和步骤6在微球载体的外表面装配
磁性纳米颗粒和上转换荧光纳米颗粒并进行表面包覆和修饰，步骤3中采用空白PEI进行制
备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I3＝1，步骤5(根据编码微球阵列
7所调整的步骤5)中通过调节上转换荧光纳米颗粒的加入浓度，得到按照上转换荧光纳米
颗粒荧光强度水平划分的微球外表面编码的5重编码微球，即O3＝5，该类磁性微球的编码
容量X3＝I3×O3＝5。
磁性纳米颗粒和上转换荧光纳米颗粒并进行表面包覆和修饰，步骤3中采用空白PEI进行制
备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I3＝1，步骤5(根据编码微球阵列
7所调整的步骤5)中通过调节上转换荧光纳米颗粒的加入浓度，得到按照上转换荧光纳米
颗粒荧光强度水平划分的微球外表面编码的5重编码微球，即O3＝5，该类磁性微球的编码
容量X3＝I3×O3＝5。
[0232] 4.采用经过上述制备方法中步骤2得到的羧基化PS‑37微球作为载体基质，按照步骤3、步骤4、步骤5(根据编码微球阵列7所调整的步骤5)和步骤6在微球载体的外表面装配
磁性纳米颗粒和上转换荧光纳米颗粒并进行表面包覆和修饰，步骤3中采用空白PEI进行制
备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I4＝1，步骤5(根据编码微球阵列
7所调整的步骤5)中通过调节上转换荧光纳米颗粒的加入浓度，得到按照上转换荧光纳米
颗粒荧光强度水平划分的微球外表面编码的5重编码微球，即O4＝5，该类磁性微球的编码
容量X4＝I4×O4＝5。
磁性纳米颗粒和上转换荧光纳米颗粒并进行表面包覆和修饰，步骤3中采用空白PEI进行制
备，则按照荧光强度水平划分的微球内部空间的编码数量I4＝1，步骤5(根据编码微球阵列
7所调整的步骤5)中通过调节上转换荧光纳米颗粒的加入浓度，得到按照上转换荧光纳米
颗粒荧光强度水平划分的微球外表面编码的5重编码微球，即O4＝5，该类磁性微球的编码
容量X4＝I4×O4＝5。
[0233] 5.将上述四类磁性微球相组合，即引入结构编码信息，通过流式细胞仪的FSC和SSC两个散射光通道对结构信息进行解码，再通过荧光检测通道对外表面荧光信息进行解
码，最终构建了具有20重的磁性编码微球阵列，即Y＝(I1×O1)+(I2×O2)+(I3×O3)+(I4×O4)
＝20。
码，最终构建了具有20重的磁性编码微球阵列，即Y＝(I1×O1)+(I2×O2)+(I3×O3)+(I4×O4)
＝20。
[0234] 编码微球阵列8(SiO2‑17、SiO2‑48和PS‑51三类微球的结构+内部空间荧光+外表面荧光的联合编码)：
[0235] 1.采用SiO2‑17原始微球作为载体基质，按照上述制备方法中步骤3、步骤5和步骤6在微球载体的内部空间装载荧光染料FITC、外表面装配量子点并进行表面包覆和修饰，步
骤3中通过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分
的微球内部空间编码的11重编码微球，即I1＝11，步骤5中通过调节量子点的加入浓度，得
到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编码的6重编码微球，即O1＝6，该类微球的
编码容量X1＝I1×O1＝66。
骤3中通过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分
的微球内部空间编码的11重编码微球，即I1＝11，步骤5中通过调节量子点的加入浓度，得
到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编码的6重编码微球，即O1＝6，该类微球的
编码容量X1＝I1×O1＝66。
[0236] 2.采用SiO2‑48原始微球作为载体基质，按照上述制备方法中步骤3、步骤5和步骤6在微球载体的内部空间装载荧光染料FITC、外表面装配量子点并进行表面包覆和修饰，步
骤3中通过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分
的微球内部空间编码的10重编码微球，即I2＝10，步骤5中通过调节量子点的加入浓度，得
到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编码的6重编码微球，即O2＝6，该类微球的
编码容量X2＝I2×O2＝60。
骤3中通过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分
的微球内部空间编码的10重编码微球，即I2＝10，步骤5中通过调节量子点的加入浓度，得
到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编码的6重编码微球，即O2＝6，该类微球的
编码容量X2＝I2×O2＝60。
[0237] 3.采用经过上述制备方法中步骤2得到的羧基化PS‑51微球作为载体基质，按照步骤3、步骤5和步骤6在微球载体的内部空间装载荧光染料FITC、外表面装配量子点并进行表
面包覆和修饰，步骤3中通过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC
荧光强度水平划分的微球内部空间编码的9重编码微球，即I3＝9，步骤5中通过调节量子点
的加入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编码的6重编码微球，即O3＝
6，该类微球的编码容量X3＝I3×O3＝54。
面包覆和修饰，步骤3中通过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC
荧光强度水平划分的微球内部空间编码的9重编码微球，即I3＝9，步骤5中通过调节量子点
的加入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编码的6重编码微球，即O3＝
6，该类微球的编码容量X3＝I3×O3＝54。
[0238] 4.将上述三类微球相组合，即引入结构编码信息，通过流式细胞仪的FSC和SSC两个散射光通道对结构信息进行解码，再通过荧光检测通道分别对内部空间和外表面的荧光
信息进行解码，最终构建了具有180重的编码微球阵列，即Y＝(I1×O1)+(I2×O2)+(I3×O3)
＝180。
信息进行解码，最终构建了具有180重的编码微球阵列，即Y＝(I1×O1)+(I2×O2)+(I3×O3)
＝180。
[0239] 编码微球阵列9(SiO2‑17、SiO2‑48和PS‑37三类微球的结构+内部空间荧光+外表面荧光的联合编码)：
[0240] 本组合中，将微球载体外表面优选组装的发射波长为600nm的CdSe/ZnS量子点调整为发射波长为580nm的共轭聚合物荧光纳米颗粒。将步骤5调整为：在微球载体的外表面
通过静电反应装配共轭聚合物荧光纳米颗粒。将步骤3所得的0.4mL微球分散液在超声条件
下逐滴加入到1.1mL含有不同浓度共轭聚合物荧光纳米颗粒(粒径为30nm，表面带有羧基)
的水溶液中，避光旋转反应30min。反应后离心去上清，用水清洗三次。然后将所得微球再加
入至1.5mL步骤3提及的空白PEI溶液中，避光旋转反应20min，反应后离心去上清，用水清洗
三次，即得到外表面装配有共轭聚合物荧光纳米颗粒且在最外层修饰有PEI的微球载体。
通过静电反应装配共轭聚合物荧光纳米颗粒。将步骤3所得的0.4mL微球分散液在超声条件
下逐滴加入到1.1mL含有不同浓度共轭聚合物荧光纳米颗粒(粒径为30nm，表面带有羧基)
的水溶液中，避光旋转反应30min。反应后离心去上清，用水清洗三次。然后将所得微球再加
入至1.5mL步骤3提及的空白PEI溶液中，避光旋转反应20min，反应后离心去上清，用水清洗
三次，即得到外表面装配有共轭聚合物荧光纳米颗粒且在最外层修饰有PEI的微球载体。
[0241] 1.采用SiO2‑17原始微球作为载体基质，按照上述制备方法中步骤3、步骤5(根据编码微球阵列9所调整的步骤5)和步骤6在微球载体的内部空间装载荧光染料FITC、外表面
装配共轭聚合物荧光纳米颗粒并进行表面包覆和修饰，步骤3中通过调节FITC‑PEI溶液和
空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分的微球内部空间编码的11重编
码微球，即I1＝11，步骤5(根据编码微球阵列9所调整的步骤5)中通过调节共轭聚合物荧光
纳米颗粒的加入浓度，得到按照共轭聚合物荧光纳米颗粒荧光强度水平划分的微球外表面
编码的5重编码微球，即O1＝5，该类微球的编码容量X1＝I1×O1＝55。
装配共轭聚合物荧光纳米颗粒并进行表面包覆和修饰，步骤3中通过调节FITC‑PEI溶液和
空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分的微球内部空间编码的11重编
码微球，即I1＝11，步骤5(根据编码微球阵列9所调整的步骤5)中通过调节共轭聚合物荧光
纳米颗粒的加入浓度，得到按照共轭聚合物荧光纳米颗粒荧光强度水平划分的微球外表面
编码的5重编码微球，即O1＝5，该类微球的编码容量X1＝I1×O1＝55。
[0242] 2.采用SiO2‑48原始微球作为载体基质，按照上述制备方法中步骤3、步骤5(根据编码微球阵列9所调整的步骤5)和步骤6在微球载体的内部空间装载荧光染料FITC、外表面
装配共轭聚合物荧光纳米颗粒并进行表面包覆和修饰，步骤3中通过调节FITC‑PEI溶液和
空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分的微球内部空间编码的10重编
码微球，即I2＝10，步骤5(根据编码微球阵列9所调整的步骤5)中通过调节共轭聚合物荧光
纳米颗粒的加入浓度，得到按照共轭聚合物荧光纳米颗粒荧光强度水平划分的微球外表面
编码的5重编码微球，即O2＝5，该类微球的编码容量X2＝I2×O2＝50。
装配共轭聚合物荧光纳米颗粒并进行表面包覆和修饰，步骤3中通过调节FITC‑PEI溶液和
空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分的微球内部空间编码的10重编
码微球，即I2＝10，步骤5(根据编码微球阵列9所调整的步骤5)中通过调节共轭聚合物荧光
纳米颗粒的加入浓度，得到按照共轭聚合物荧光纳米颗粒荧光强度水平划分的微球外表面
编码的5重编码微球，即O2＝5，该类微球的编码容量X2＝I2×O2＝50。
[0243] 3.采用经过上述制备方法中步骤2得到的羧基化PS‑37微球作为载体基质，按照步骤3、步骤5(根据编码微球阵列9所调整的步骤5)和步骤6在微球载体的内部空间装载荧光
染料FITC、外表面装配共轭聚合物荧光纳米颗粒并进行表面包覆和修饰，步骤3中通过调节
FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分的微球内部空
间编码的10重编码微球，即I3＝10，步骤5(根据编码微球阵列9所调整的步骤5)中通过调节
共轭聚合物荧光纳米颗粒的加入浓度，得到按照共轭聚合物荧光纳米颗粒荧光强度水平划
分的微球外表面编码的5重编码微球，即O3＝5，该类微球的编码容量X3＝I3×O3＝50。
染料FITC、外表面装配共轭聚合物荧光纳米颗粒并进行表面包覆和修饰，步骤3中通过调节
FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分的微球内部空
间编码的10重编码微球，即I3＝10，步骤5(根据编码微球阵列9所调整的步骤5)中通过调节
共轭聚合物荧光纳米颗粒的加入浓度，得到按照共轭聚合物荧光纳米颗粒荧光强度水平划
分的微球外表面编码的5重编码微球，即O3＝5，该类微球的编码容量X3＝I3×O3＝50。
[0244] 4.将上述三类微球相组合，即引入结构编码信息，通过流式细胞仪的FSC和SSC两个散射光通道对结构信息进行解码，再通过荧光检测通道分别对内部空间和外表面的荧光
信息进行解码，最终构建了具有155重的编码微球阵列，即Y＝(I1×O1)+(I2×O2)+(I3×O3)
＝155。
信息进行解码，最终构建了具有155重的编码微球阵列，即Y＝(I1×O1)+(I2×O2)+(I3×O3)
＝155。
[0245] 编码微球阵列10(SiO2‑17、SiO2‑48、PS‑14、PS‑37和PS‑51五类磁性微球的结构+内部空间荧光+外表面荧光的联合编码)：
[0246] 1.采用SiO2‑17原始微球作为载体基质，按照上述制备方法中步骤3、步骤4、步骤5和步骤6在微球载体的内部空间装载荧光染料FITC、外表面装配磁性纳米颗粒和量子点并
进行表面包覆和修饰，步骤3中通过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按
照FITC荧光强度水平划分的微球内部空间编码的11重编码微球，即I1＝11，步骤5中通过调
节量子点的加入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编码的6重编码微
球，即O1＝6，该类磁性微球的编码容量X1＝I1×O1＝66。
进行表面包覆和修饰，步骤3中通过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按
照FITC荧光强度水平划分的微球内部空间编码的11重编码微球，即I1＝11，步骤5中通过调
节量子点的加入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编码的6重编码微
球，即O1＝6，该类磁性微球的编码容量X1＝I1×O1＝66。
[0247] 2.采用SiO2‑48原始微球作为载体基质，按照上述制备方法中步骤3、步骤4、步骤5和步骤6在微球载体的内部空间装载荧光染料FITC、外表面装配磁性纳米颗粒和量子点并
进行表面包覆和修饰，步骤3中通过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按
照FITC荧光强度水平划分的微球内部空间编码的10重编码微球，即I2＝10，步骤5中通过调
节量子点的加入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编码的6重编码微
球，即O2＝6，该类磁性微球的编码容量X2＝I2×O2＝60。
进行表面包覆和修饰，步骤3中通过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混合比例，得到按
照FITC荧光强度水平划分的微球内部空间编码的10重编码微球，即I2＝10，步骤5中通过调
节量子点的加入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编码的6重编码微
球，即O2＝6，该类磁性微球的编码容量X2＝I2×O2＝60。
[0248] 3.采用经过上述制备方法中步骤2得到的羧基化PS‑14微球作为载体基质，按照步骤3、步骤4、步骤5和步骤6在微球载体的内部空间装载荧光染料FITC、外表面装配磁性纳米
颗粒和量子点并进行表面包覆和修饰，步骤3中通过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混
合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分的微球内部空间编码的10重编码微球，即I3＝10，
步骤5中通过调节量子点的加入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编
码的6重编码微球，即O3＝6，该类磁性微球的编码容量X3＝I3×O3＝60。
颗粒和量子点并进行表面包覆和修饰，步骤3中通过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混
合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分的微球内部空间编码的10重编码微球，即I3＝10，
步骤5中通过调节量子点的加入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编
码的6重编码微球，即O3＝6，该类磁性微球的编码容量X3＝I3×O3＝60。
[0249] 4.采用经过上述制备方法中步骤2得到的羧基化PS‑37微球作为载体基质，按照步骤3、步骤4、步骤5和步骤6在微球载体的内部空间装载荧光染料FITC、外表面装配磁性纳米
颗粒和量子点并进行表面包覆和修饰，步骤3中通过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混
合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分的微球内部空间编码的10重编码微球，即I4＝10，
步骤5中通过调节量子点的加入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编
码的6重编码微球，即O4＝6，该类磁性微球的编码容量X4＝I4×O4＝60。
颗粒和量子点并进行表面包覆和修饰，步骤3中通过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混
合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分的微球内部空间编码的10重编码微球，即I4＝10，
步骤5中通过调节量子点的加入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编
码的6重编码微球，即O4＝6，该类磁性微球的编码容量X4＝I4×O4＝60。
[0250] 5.采用经过上述制备方法中步骤2得到的羧基化PS‑51微球作为载体基质，按照步骤3、步骤4、步骤5和步骤6在微球载体的内部空间装载荧光染料FITC、外表面装配磁性纳米
颗粒和量子点并进行表面包覆和修饰，步骤3中通过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混
合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分的微球内部空间编码的9重编码微球，即I5＝9，步
骤5中通过调节量子点的加入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编码
的6重编码微球，即O5＝6，该类磁性微球的编码容量X5＝I5×O5＝54。
颗粒和量子点并进行表面包覆和修饰，步骤3中通过调节FITC‑PEI溶液和空白PEI溶液的混
合比例，得到按照FITC荧光强度水平划分的微球内部空间编码的9重编码微球，即I5＝9，步
骤5中通过调节量子点的加入浓度，得到按照量子点荧光强度水平划分的微球外表面编码
的6重编码微球，即O5＝6，该类磁性微球的编码容量X5＝I5×O5＝54。
[0251] 6.将上述五类磁性微球相组合，即引入结构编码信息，通过流式细胞仪的FSC和SSC两个散射光通道对结构信息进行解码，再通过荧光检测通道分别对内部空间和外表面
的荧光信息进行解码，最终构建了具有300重的磁性编码微球阵列，即Y＝(I1×O1)+(I2×
O2)+(I3×O3)+(I4×O4)+(I5×O5)＝300。
的荧光信息进行解码，最终构建了具有300重的磁性编码微球阵列，即Y＝(I1×O1)+(I2×
O2)+(I3×O3)+(I4×O4)+(I5×O5)＝300。
[0252] 如图2所示，五类磁性编码微球的磁滞回线显示，五类微球均没有剩磁且矫顽力为零，具有典型的超顺磁性特征，便于微球在磁场下的操纵。此外，五类磁性编码微球的饱和
磁化强度为0.81‑1.71emu/g，体现了良好的磁响应性能。
磁化强度为0.81‑1.71emu/g，体现了良好的磁响应性能。
[0253] 如图3所示，利用五类具有不同内部结构的微球作为载体基质，依次在微球载体的内部空间装载荧光染料FITC、外表面装配磁性纳米颗粒和量子点，并进行表面包覆和修饰，
最终所得的五类磁性编码微球在流式的FSC‑SSC二维散射光解码图中仍具有显著的信号强
度差异。虽然位置较原始微球有所改变，但五类微球之间的相互分群明显，也再次证明微球
的结构与FSC‑SSC散射信号具有对应关系；同时，每类微球均含有54～66重的荧光编码微
球，但同一类微球的FSC‑SSC编码位置分布在较小的范围内，证明了本发明中制备方法的可
控性和重复性。在五类微球结构解码的基础上，继续读取每一类微球的FITC通道和QDs通道
的荧光信息进行解码，可以得到编码重数为54～66重的五个独立二维编码阵列，且每重散
点之间区分明显。将五类磁性编码微球的二维编码阵列进行组合，得到了300重超高通量的
磁性编码微球阵列。此结果说明，微球载体的结构编码作为本发明开发的新的编码元素，联
合荧光编码可以显著提升编码微球阵列的编码容量。此外，该编码微球阵列涉及的四个解
码参数，即FSC强度、SSC强度、FITC荧光强度和QDs荧光强度，均可用488nm的单色激发光进
行激发，极大的降低了解码成本，使解码过程变得更加简单便捷，而300重也是目前已见报
道的单色激光激发所得的最高重数的编码容量。本发明提出的编码微球阵列在超高通量的
多指标检测中具有极大的应用前景。
最终所得的五类磁性编码微球在流式的FSC‑SSC二维散射光解码图中仍具有显著的信号强
度差异。虽然位置较原始微球有所改变，但五类微球之间的相互分群明显，也再次证明微球
的结构与FSC‑SSC散射信号具有对应关系；同时，每类微球均含有54～66重的荧光编码微
球，但同一类微球的FSC‑SSC编码位置分布在较小的范围内，证明了本发明中制备方法的可
控性和重复性。在五类微球结构解码的基础上，继续读取每一类微球的FITC通道和QDs通道
的荧光信息进行解码，可以得到编码重数为54～66重的五个独立二维编码阵列，且每重散
点之间区分明显。将五类磁性编码微球的二维编码阵列进行组合，得到了300重超高通量的
磁性编码微球阵列。此结果说明，微球载体的结构编码作为本发明开发的新的编码元素，联
合荧光编码可以显著提升编码微球阵列的编码容量。此外，该编码微球阵列涉及的四个解
码参数，即FSC强度、SSC强度、FITC荧光强度和QDs荧光强度，均可用488nm的单色激发光进
行激发，极大的降低了解码成本，使解码过程变得更加简单便捷，而300重也是目前已见报
道的单色激光激发所得的最高重数的编码容量。本发明提出的编码微球阵列在超高通量的
多指标检测中具有极大的应用前景。
[0254] 实施例二
[0255] 如前所述，根据实施例一的制备方法，可以重复其中的步骤5以在微球载体的外表面装配多层具有不同中心发射波长的量子点，从而进一步增加编码的维度，扩增编码的数
量。
量。
[0256] 同样地，在实施例一的制备方法的基础上，也可以在微球载体内部装载两种或两种以上具有不同中心发射波长的荧光染料。本实施例的重点即在于进一步地详述在微球载
体内部装载有一种及一种以上的荧光染料的编码微球的制备方法，本实施例中的编码微球
可以单独应用，也可以将本实施例的方法应用于实施例一的步骤2中，从而扩大实施例一中
编码微球的编码维度。
体内部装载有一种及一种以上的荧光染料的编码微球的制备方法，本实施例中的编码微球
可以单独应用，也可以将本实施例的方法应用于实施例一的步骤2中，从而扩大实施例一中
编码微球的编码维度。
[0257] 本实施例的编码微球的制备方法的设计主要包括以下步骤：
[0258] 步骤1、用X种荧光染料分别对聚合物分子进行共价键标记得到X种荧光标记的聚合物分子溶液，X≥1；再将得到的X种聚合物分子溶液，与未荧光标记的聚合物分子溶液以
不同比例进行混合，得到混合溶液M；
不同比例进行混合，得到混合溶液M；
[0259] 步骤2、将多孔微球加入到步骤1得到的混合溶液M中，通过物理/化学作用将聚合物分子结合至微球内部，离心并用去离子水清洗，从而获得荧光染料掺杂微球；
[0260] 步骤3、将磁性纳米颗粒加入到步骤2得到的荧光染料掺杂微球中进行物理吸附使其组装在微球的外表面，反应后进行清洗；然后再将产物与氨基聚合物进行物理吸附，得到
外表面装配有磁性纳米颗粒且在最外层带有氨基聚合物的荧光染料掺杂微球；磁性纳米颗
粒的添加量占荧光染料掺杂微球的质量比重≥0％；
外表面装配有磁性纳米颗粒且在最外层带有氨基聚合物的荧光染料掺杂微球；磁性纳米颗
粒的添加量占荧光染料掺杂微球的质量比重≥0％；
[0261] 步骤4、在步骤2或3得到微球表面包覆氧化硅保护壳层，从而获得荧光染料掺杂的编码微球。在氧化硅包覆完成后，可对微球载体的外表面修饰功能分子，从而得到表面功能
化的编码微球。
化的编码微球。
[0262] 其中，多孔微球的直径为0.1～100μm，孔径为2～100nm，微球的基质成分包括无机物和聚合物。无机物包括二氧化硅和/或二氧化钛。聚合物包括聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯
酸甲酯、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二乙烯基苯和/或上述聚合物的共聚物。
酸甲酯、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二乙烯基苯和/或上述聚合物的共聚物。
[0263] 物理/化学作用包括静电作用、亲疏水作用、氢键作用、配位作用、共价键作用，优选为静电作用。
[0264] 磁性纳米颗粒采用Fe3O4纳米颗粒或γ‑Fe2O3纳米颗粒，优选Fe3O4纳米颗粒。
[0265] 荧光染料的分子结构中含有的官能团为异硫氰酸酯、羧基、N‑羟基琥珀酰亚胺酯、环氧基团中的一种或多种，聚合物分子的链段结构中含有的官能团为氨基；或者荧光染料
的分子结构中含有的官能团为氨基，聚合物分子结构中含有的官能团为羧基、环氧基团中
的一种或多种。
的分子结构中含有的官能团为氨基，聚合物分子结构中含有的官能团为羧基、环氧基团中
的一种或多种。
[0266] 荧光染料包括异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸罗丹明B(RITC)、Cy5‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯(Cy5‑NHS)、5‑氨基荧光素(5‑AF)；聚合物分子包括聚乙烯亚胺(PEI)、聚丙烯酸
(PAA)；多孔微球包括多孔二氧化硅微球、羧基化的多孔聚苯乙烯微球、修饰环氧基团的多
孔二氧化硅微球、修饰环氧基团的多孔聚苯乙烯微球、氨基化的多孔二氧化硅微球、氨基化
的多孔聚苯乙烯微球。
(PAA)；多孔微球包括多孔二氧化硅微球、羧基化的多孔聚苯乙烯微球、修饰环氧基团的多
孔二氧化硅微球、修饰环氧基团的多孔聚苯乙烯微球、氨基化的多孔二氧化硅微球、氨基化
的多孔聚苯乙烯微球。
[0267] 以下通过具体的制备方法进行进一步的说明。
[0268] 制备方法1包括以下步骤：
[0269] 1、将150mg的PEI(分子量为750K)溶解于15mL的NaCl溶液(0.5M)中，将pH调为8.0，记为空白PEI溶液；向上述空白PEI溶液中加入4.4mg的FITC，在30℃条件下避光震荡过夜反
应，得到标记有FITC的PEI溶液(记为FITC‑PEI)；以不同的比例混合FITC‑PEI溶液和空白
PEI溶液，配制总体积为1.5mL的混合溶液；
应，得到标记有FITC的PEI溶液(记为FITC‑PEI)；以不同的比例混合FITC‑PEI溶液和空白
PEI溶液，配制总体积为1.5mL的混合溶液；
[0270] 2、将6.4×108个直径为1.7μm的多孔二氧化硅微球加入至上述混合溶液中，超声混合均匀后避光旋转反应20min，通过静电作用将FITC‑PEI和PEI结合至微球内部；反应后
离心去上清，用水清洗三次，所得微球分散于0.4mL水溶液中，即得到内部空间装载有荧光
染料的微球；
离心去上清，用水清洗三次，所得微球分散于0.4mL水溶液中，即得到内部空间装载有荧光
染料的微球；
[0271] 3、将上述所得的0.4mL微球分散液在超声条件下逐滴加入到1.1mL含有Fe3O4磁性纳米颗粒(粒径为8nm，表面带有羧基)的水溶液中，避光旋转反应30min。反应后磁分离去上
清，用水清洗三次；然后将所得微球再加入至1.5mL步骤1提及的空白PEI溶液中，避光旋转
反应20min，反应后磁分离去上清，用水清洗三次，即得到外表面装配有Fe3O4磁性纳米颗粒
且在最外层修饰有PEI的荧光微球；
清，用水清洗三次；然后将所得微球再加入至1.5mL步骤1提及的空白PEI溶液中，避光旋转
反应20min，反应后磁分离去上清，用水清洗三次，即得到外表面装配有Fe3O4磁性纳米颗粒
且在最外层修饰有PEI的荧光微球；
[0272] 4、将上述步骤3得到的微球磁分离去上清，微球用无水乙醇清洗两次，加入到含有3mL乙醇、0.3mL水和40μL TEOS的混合体系中，避光旋转反应30min；然后，加入22μL的浓氨
水，在30℃条件下继续避光旋转反应22h，反应后去上清，依次用无水乙醇和水清洗三次，即
得到表面包覆有氧化硅的FITC荧光染料掺杂的磁性编码微球。
水，在30℃条件下继续避光旋转反应22h，反应后去上清，依次用无水乙醇和水清洗三次，即
得到表面包覆有氧化硅的FITC荧光染料掺杂的磁性编码微球。
[0273] 由制备方法1制备得到的磁性荧光编码微球，FITC染料的荧光编码信息可被流式细胞仪的488nm激发光激发，滤光片接收的发射波段为515±10nm；也可被荧光显微镜的
488nm激发光激发，滤光片接收的发射波段为515±15nm。
488nm激发光激发，滤光片接收的发射波段为515±15nm。
[0274] 如图4所示，采用直径为1.7μm的多孔二氧化硅为微球载体，利用FITC作为掺杂染料，制备得到了7重在流式细胞仪上可区分的荧光染料掺杂编码微球。
[0275] 制备方法2包括以下步骤：
[0276] 1、将150mg的PEI(分子量为750K)溶解于15mL的NaCl溶液(0.5M)中，将pH调为8.0，记为空白PEI溶液；向上述空白PEI溶液中加入7.0mg的Cy5‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯(Cy5‑
NHS)，在30℃条件下避光震荡过夜反应，得到标记有Cy5的PEI溶液(记为Cy5‑PEI)；以不同
的比例混合Cy5‑PEI溶液和空白PEI溶液，配制总体积为1.5mL的混合溶液；
NHS)，在30℃条件下避光震荡过夜反应，得到标记有Cy5的PEI溶液(记为Cy5‑PEI)；以不同
的比例混合Cy5‑PEI溶液和空白PEI溶液，配制总体积为1.5mL的混合溶液；
[0277] 2、将8×107个直径为3.3μm的羧基化多孔聚苯乙烯微球加入至上述混合溶液中，超声混合均匀后避光旋转反应20min，通过静电作用将Cy5‑PEI和PEI结合至微球内部；反应
后离心去上清，用水清洗三次，所得微球分散于0.4mL水溶液中，即得到内部空间装载有荧
光染料的微球；
后离心去上清，用水清洗三次，所得微球分散于0.4mL水溶液中，即得到内部空间装载有荧
光染料的微球；
[0278] 3、将上述步骤2得到的微球离心去上清，微球用无水乙醇清洗两次，加入到含有3mL乙醇、0.3mL水和40μL TEOS的混合体系中，避光旋转反应30min；然后，加入22μL的浓氨
水，在30℃条件下继续避光旋转反应22h，反应后去上清，依次用无水乙醇和水清洗三次，即
得到表面包覆有氧化硅的Cy5荧光染料掺杂的编码微球。
水，在30℃条件下继续避光旋转反应22h，反应后去上清，依次用无水乙醇和水清洗三次，即
得到表面包覆有氧化硅的Cy5荧光染料掺杂的编码微球。
[0279] 由制备方法2制备得到的荧光编码微球，Cy5染料的荧光编码信息可被流式细胞仪的640nm激发光激发，滤光片接收的发射波段为675±12.5nm；也可被荧光显微镜的633nm激
发光激发，滤光片接收的发射波段为675±25nm。
发光激发，滤光片接收的发射波段为675±25nm。
[0280] 制备方法3包括以下步骤：
[0281] 1、将150mg的PEI(分子量为750K)溶解于15mL的NaCl溶液(0.5M)中，将pH调为8.0，记为空白PEI溶液；向上述空白PEI溶液中加入11.9mg的RITC，在30℃条件下避光震荡过夜
反应，得到标记有RITC的PEI溶液(记为RITC‑PEI)；以不同的比例混合RITC‑PEI溶液和空白
PEI溶液，配制总体积为1.5mL的混合溶液；
反应，得到标记有RITC的PEI溶液(记为RITC‑PEI)；以不同的比例混合RITC‑PEI溶液和空白
PEI溶液，配制总体积为1.5mL的混合溶液；
[0282] 2、将2×107个直径为5.5μm的多孔二氧化硅微球加入至上述混合溶液中，超声混合均匀后避光旋转反应20min，通过静电作用将RITC‑PEI和PEI结合至微球内部；反应后离
心去上清，用水清洗三次，所得微球分散于0.4mL水溶液中，即得到内部空间装载有荧光染
料的微球；
心去上清，用水清洗三次，所得微球分散于0.4mL水溶液中，即得到内部空间装载有荧光染
料的微球；
[0283] 3、将上述所得的0.4mL微球分散液在超声条件下逐滴加入到1.1mL含有Fe3O4磁性纳米颗粒(粒径为8nm，表面带有羧基)的水溶液中，避光旋转反应30min。反应后磁分离去上
清，用水清洗三次；然后将所得微球再加入至1.5mL步骤1提及的空白PEI溶液中，避光旋转
反应20min，反应后磁分离去上清，用水清洗三次，即得到外表面装配有Fe3O4磁性纳米颗粒
且在最外层修饰有PEI的荧光微球；
清，用水清洗三次；然后将所得微球再加入至1.5mL步骤1提及的空白PEI溶液中，避光旋转
反应20min，反应后磁分离去上清，用水清洗三次，即得到外表面装配有Fe3O4磁性纳米颗粒
且在最外层修饰有PEI的荧光微球；
[0284] 4、将上述步骤3得到的微球磁分离去上清，微球用无水乙醇清洗两次，加入到含有3mL乙醇、0.3mL水和40μL TEOS的混合体系中，避光旋转反应30min；然后，加入22μL的浓氨
水，在30℃条件下继续避光旋转反应22h，反应后去上清，依次用无水乙醇和水清洗三次，即
得到表面包覆有氧化硅的RITC荧光染料掺杂的磁性编码微球。
水，在30℃条件下继续避光旋转反应22h，反应后去上清，依次用无水乙醇和水清洗三次，即
得到表面包覆有氧化硅的RITC荧光染料掺杂的磁性编码微球。
[0285] 由制备方法3制备得到的磁性荧光编码微球，RITC染料的荧光编码信息可被流式细胞仪的488nm激发光激发，滤光片接收的发射波段为565±10nm；也可被荧光显微镜的
488nm激发光激发，滤光片接收的发射波段为585±15nm。
488nm激发光激发，滤光片接收的发射波段为585±15nm。
[0286] 如图5所示，采用直径为5.5μm的多孔二氧化硅为微球载体，利用RITC作为掺杂染料，制备得到了6重在流式细胞仪上可区分的荧光染料掺杂编码微球。
[0287] 制备方法4包括以下步骤：
[0288] 1、将150mg的PEI(分子量为750K)溶解于15mL的NaCl溶液(0.5M)中，将pH调为8.0，记为空白PEI溶液；向上述空白PEI溶液中加入11.9mg的RITC，在30℃条件下避光震荡过夜
反应，得到标记有RITC的PEI溶液(记为RITC‑PEI)；以不同的比例混合RITC‑PEI溶液和空白
PEI溶液，配制总体积为1.5mL的混合溶液；
反应，得到标记有RITC的PEI溶液(记为RITC‑PEI)；以不同的比例混合RITC‑PEI溶液和空白
PEI溶液，配制总体积为1.5mL的混合溶液；
[0289] 2、将2×107个直径为5.5μm的修饰环氧基团的多孔聚苯乙烯微球加入至上述混合溶液中，超声混合均匀后避光旋转过夜反应，通过共价键作用将RITC‑PEI和PEI结合至微球
内部；反应后离心去上清，用水清洗三次，所得微球分散于0.4mL水溶液中，即得到内部空间
装载有荧光染料的微球；
内部；反应后离心去上清，用水清洗三次，所得微球分散于0.4mL水溶液中，即得到内部空间
装载有荧光染料的微球；
[0290] 3、将上述步骤2得到的微球离心去上清，微球用无水乙醇清洗两次，加入到含有3mL乙醇、0.3mL水和40μL TEOS的混合体系中，避光旋转反应30min；然后，加入22μL的浓氨
水，在30℃条件下继续避光旋转反应22h，反应后去上清，依次用无水乙醇和水清洗三次，即
得到表面包覆有氧化硅的RITC荧光染料掺杂的编码微球。
水，在30℃条件下继续避光旋转反应22h，反应后去上清，依次用无水乙醇和水清洗三次，即
得到表面包覆有氧化硅的RITC荧光染料掺杂的编码微球。
[0291] 由制备方法4制备得到的荧光编码微球，RITC染料的荧光编码信息可被流式细胞仪的488nm激发光激发，滤光片接收的发射波段为565±10nm；也可被荧光显微镜的488nm激
发光激发，滤光片接收的发射波段为585±15nm。
发光激发，滤光片接收的发射波段为585±15nm。
[0292] 制备方法5包括以下步骤：
[0293] 1、将200mg的聚丙烯酸(PAA，分子量为5K)溶解于15mL的NaCl溶液(0.5M)中，将pH调为6.0，记为空白PAA溶液；向上述空白PAA溶液中加入3.9mg的5‑氨基荧光素(5‑AF)和
40mg的碳二亚胺(EDC)，在30℃条件下避光震荡过夜反应，得到标记有5‑AF的PAA溶液(记为
5‑AF‑PAA)；以不同的比例混合5‑AF‑PAA溶液和空白PAA溶液，配制总体积为1.5mL的混合溶
液；
40mg的碳二亚胺(EDC)，在30℃条件下避光震荡过夜反应，得到标记有5‑AF的PAA溶液(记为
5‑AF‑PAA)；以不同的比例混合5‑AF‑PAA溶液和空白PAA溶液，配制总体积为1.5mL的混合溶
液；
[0294] 2、将2×107个直径为5.5μm的氨基化多孔聚苯乙烯微球加入至上述混合溶液中，超声混合均匀后避光旋转反应20min，通过静电作用将5‑AF‑PAA和PAA吸附至微球内部；反
应后离心去上清，用水清洗三次，所得微球分散于0.4mL水溶液中，即得到内部空间装载有
荧光染料的微球；
应后离心去上清，用水清洗三次，所得微球分散于0.4mL水溶液中，即得到内部空间装载有
荧光染料的微球；
[0295] 3、将150mg的PEI(分子量为750K)溶解于15mL的NaCl溶液(0.5M)中，将pH调为8.0，记为空白PEI溶液；将上述步骤2所得的微球离心去上清，加入至1.5mL空白PEI溶液中，避光
旋转反应20min，反应后离心去上清，用水清洗三次，即得到最外层修饰有PEI的荧光微球；
旋转反应20min，反应后离心去上清，用水清洗三次，即得到最外层修饰有PEI的荧光微球；
[0296] 4、将上述步骤3得到的微球离心去上清，微球用无水乙醇清洗两次，加入到含有3mL乙醇、0.3mL水和40μL TEOS的混合体系中，避光旋转反应30min；然后，加入22μL的浓氨
水，在30℃条件下继续避光旋转反应22h，反应后去上清，依次用无水乙醇和水清洗三次，即
得到表面包覆有氧化硅的5‑AF荧光染料掺杂的编码微球。
水，在30℃条件下继续避光旋转反应22h，反应后去上清，依次用无水乙醇和水清洗三次，即
得到表面包覆有氧化硅的5‑AF荧光染料掺杂的编码微球。
[0297] 由制备方法5制备得到的荧光编码微球，5‑AF染料的荧光编码信息可被流式细胞仪的488nm激发光激发，滤光片接收的发射波段为515±10nm；也可被荧光显微镜的488nm激
发光激发，滤光片接收的发射波段为515±15nm。
发光激发，滤光片接收的发射波段为515±15nm。
[0298] 制备方法6包括以下步骤：
[0299] 1、将150mg的PEI(分子量为750K)溶解于15mL的NaCl溶液(0.5M)中，将pH调为8.0，记为空白PEI溶液；向上述空白PEI溶液中分别加入4.4mg的FITC和7.0mg的Cy5‑NHS，在30℃
条件下避光震荡过夜反应，得到分别标记有FITC的PEI溶液(记为FITC‑PEI)和标记有Cy5的
PEI溶液(记为Cy5‑PEI)；以不同的比例混合FITC‑PEI溶液、Cy5‑PEI溶液和空白PEI溶液，配
制总体积为1.5mL的混合溶液；
条件下避光震荡过夜反应，得到分别标记有FITC的PEI溶液(记为FITC‑PEI)和标记有Cy5的
PEI溶液(记为Cy5‑PEI)；以不同的比例混合FITC‑PEI溶液、Cy5‑PEI溶液和空白PEI溶液，配
制总体积为1.5mL的混合溶液；
[0300] 2、将6.4×108个直径为1.7μm的羧基化多孔聚苯乙烯微球加入至上述混合溶液中，超声混合均匀后避光旋转反应20min，通过静电作用将FITC‑PEI、Cy5‑PEI和PEI吸附至
微球内部；反应后离心去上清，用水清洗三次，所得微球分散于0.4mL水溶液中，即得到内部
空间装载有荧光染料的微球；
微球内部；反应后离心去上清，用水清洗三次，所得微球分散于0.4mL水溶液中，即得到内部
空间装载有荧光染料的微球；
[0301] 3、将上述步骤2得到的微球离心去上清，微球用无水乙醇清洗两次，加入到含有3mL乙醇、0.3mL水和40μL TEOS的混合体系中，避光旋转反应30min；然后，加入22μL的浓氨
水，在30℃条件下继续避光旋转反应22h，反应后去上清，依次用无水乙醇和水清洗三次，即
得到表面包覆有氧化硅的FITC和Cy5双色荧光染料掺杂的编码微球。
水，在30℃条件下继续避光旋转反应22h，反应后去上清，依次用无水乙醇和水清洗三次，即
得到表面包覆有氧化硅的FITC和Cy5双色荧光染料掺杂的编码微球。
[0302] 由制备方法6制备得到的荧光编码微球，FITC染料的荧光编码信息可被流式细胞仪的488nm激发光激发，滤光片接收的发射波段为515±10nm；Cy5染料的荧光编码信息可被
流式细胞仪的640nm激发光激发，滤光片接收的发射波段为675±12.5nm。或者FITC染料的
荧光编码信息也可被荧光显微镜的488nm激发光激发，滤光片接收的发射波段为515±
15nm；Cy5染料的荧光编码信息也可被荧光显微镜的633nm激发光激发，滤光片接收的发射
波段为675±25nm。
流式细胞仪的640nm激发光激发，滤光片接收的发射波段为675±12.5nm。或者FITC染料的
荧光编码信息也可被荧光显微镜的488nm激发光激发，滤光片接收的发射波段为515±
15nm；Cy5染料的荧光编码信息也可被荧光显微镜的633nm激发光激发，滤光片接收的发射
波段为675±25nm。
[0303] 制备方法7包括以下步骤：
[0304] 1、将150mg的PEI(分子量为750K)溶解于15mL的NaCl溶液(0.5M)中，将pH调为8.0，记为空白PEI溶液；向上述空白PEI溶液中分别加入4.4mg的FITC和11.9mg的RITC，在30℃条
件下避光震荡过夜反应，得到分别标记有FITC的PEI溶液(记为FITC‑PEI)和标记有RITC的
PEI溶液(记为RITC‑PEI)；以不同的比例混合FITC‑PEI溶液、RITC‑PEI溶液和空白PEI溶液，
配制总体积为1.5mL的混合溶液；
件下避光震荡过夜反应，得到分别标记有FITC的PEI溶液(记为FITC‑PEI)和标记有RITC的
PEI溶液(记为RITC‑PEI)；以不同的比例混合FITC‑PEI溶液、RITC‑PEI溶液和空白PEI溶液，
配制总体积为1.5mL的混合溶液；
[0305] 2、将8×107个直径为3.3μm的多孔二氧化硅微球加入至上述混合溶液中，超声混合均匀后避光旋转反应20min，通过静电作用将FITC‑PEI、RITC‑PEI和PEI吸附至微球内部；
反应后离心去上清，用水清洗三次，所得微球分散于0.4mL水溶液中，即得到内部空间装载
有荧光染料的微球；
反应后离心去上清，用水清洗三次，所得微球分散于0.4mL水溶液中，即得到内部空间装载
有荧光染料的微球；
[0306] 3、将上述所得的0.4mL微球分散液在超声条件下逐滴加入到1.1mL含有Fe3O4磁性纳米颗粒(粒径为8nm，表面带有羧基)的水溶液中，避光旋转反应30min。反应后磁分离去上
清，用水清洗三次；然后将所得微球再加入至1.5mL步骤1提及的空白PEI溶液中，避光旋转
反应20min，反应后磁分离去上清，用水清洗三次，即得到外表面装配有Fe3O4磁性纳米颗粒
且在最外层修饰有PEI的荧光微球；
清，用水清洗三次；然后将所得微球再加入至1.5mL步骤1提及的空白PEI溶液中，避光旋转
反应20min，反应后磁分离去上清，用水清洗三次，即得到外表面装配有Fe3O4磁性纳米颗粒
且在最外层修饰有PEI的荧光微球；
[0307] 4、将上述步骤3得到的微球磁分离去上清，微球用无水乙醇清洗两次，加入到含有3mL乙醇、0.3mL水和40μL TEOS的混合体系中，避光旋转反应30min；然后，加入22μL的浓氨
水，在30℃条件下继续避光旋转反应22h，反应后去上清，依次用无水乙醇和水清洗三次，即
得到表面包覆有氧化硅的FITC和RITC双色荧光染料掺杂的磁性编码微球。
水，在30℃条件下继续避光旋转反应22h，反应后去上清，依次用无水乙醇和水清洗三次，即
得到表面包覆有氧化硅的FITC和RITC双色荧光染料掺杂的磁性编码微球。
[0308] 由制备方法7制备得到的磁性荧光编码微球，FITC染料的荧光编码信息可被流式细胞仪的488nm激发光激发，滤光片接收的发射波段为515±10nm；RITC染料的荧光编码信
息可被流式细胞仪的488nm激发光激发，滤光片接收的发射波段为565±10nm。或者FITC染
料的荧光编码信息也可被荧光显微镜的488nm激发光激发，滤光片接收的发射波段为515±
15nm；RITC染料的荧光编码信息也可被荧光显微镜的488nm激发光激发，滤光片接收的发射
波段为585±15nm。
息可被流式细胞仪的488nm激发光激发，滤光片接收的发射波段为565±10nm。或者FITC染
料的荧光编码信息也可被荧光显微镜的488nm激发光激发，滤光片接收的发射波段为515±
15nm；RITC染料的荧光编码信息也可被荧光显微镜的488nm激发光激发，滤光片接收的发射
波段为585±15nm。
[0309] 如图6所示，采用直径为3.3μm的多孔二氧化硅为微球载体，利用FITC和RITC作为掺杂染料，制备得到了32重在流式细胞仪上可区分的荧光染料掺杂编码微球。如图7所示，
制备方法7所得的荧光染料掺杂编码微球可在2分钟内被磁场快速的磁分离，体现了良好的
磁响应性能。
制备方法7所得的荧光染料掺杂编码微球可在2分钟内被磁场快速的磁分离，体现了良好的
磁响应性能。
[0310] 制备方法8包括以下步骤：
[0311] 1、将150mg的PEI(分子量为750K)溶解于15mL的NaCl溶液(0.5M)中，将pH调为8.0，记为空白PEI溶液；向上述空白PEI溶液中分别加入4.4mg的FITC和11.9mg的RITC，在30℃条
件下避光震荡过夜反应，得到分别标记有FITC的PEI溶液(记为FITC‑PEI)和标记有RITC的
PEI溶液(记为RITC‑PEI)；以不同的比例混合FITC‑PEI溶液、RITC‑PEI溶液和空白PEI溶液，
配制总体积为1.5mL的混合溶液；
件下避光震荡过夜反应，得到分别标记有FITC的PEI溶液(记为FITC‑PEI)和标记有RITC的
PEI溶液(记为RITC‑PEI)；以不同的比例混合FITC‑PEI溶液、RITC‑PEI溶液和空白PEI溶液，
配制总体积为1.5mL的混合溶液；
[0312] 2、将2×107个直径为5.5μm的多孔二氧化硅微球加入至上述混合溶液中，超声混合均匀后避光旋转反应20min，通过静电作用将FITC‑PEI、RITC‑PEI和PEI吸附至微球内部；
反应后离心去上清，用水清洗三次，所得微球分散于0.4mL水溶液中，即得到内部空间装载
有荧光染料的微球；
反应后离心去上清，用水清洗三次，所得微球分散于0.4mL水溶液中，即得到内部空间装载
有荧光染料的微球；
[0313] 3、将上述所得的0.4mL微球分散液在超声条件下逐滴加入到1.1mL含有Fe3O4磁性纳米颗粒(粒径为8nm，表面带有羧基)的水溶液中，避光旋转反应30min。反应后磁分离去上
清，用水清洗三次；然后将所得微球再加入至1.5mL步骤1提及的空白PEI溶液中，避光旋转
反应20min，反应后磁分离去上清，用水清洗三次，即得到外表面装配有Fe3O4磁性纳米颗粒
且在最外层修饰有PEI的荧光微球；
清，用水清洗三次；然后将所得微球再加入至1.5mL步骤1提及的空白PEI溶液中，避光旋转
反应20min，反应后磁分离去上清，用水清洗三次，即得到外表面装配有Fe3O4磁性纳米颗粒
且在最外层修饰有PEI的荧光微球；
[0314] 4、将上述步骤3得到的微球磁分离去上清，微球用无水乙醇清洗两次，加入到含有3mL乙醇、0.3mL水和40μL TEOS的混合体系中，避光旋转反应30min；然后，加入22μL的浓氨
水，在30℃条件下继续避光旋转反应22h，反应后去上清，依次用无水乙醇和水清洗三次，即
得到表面包覆有氧化硅的FITC和RITC双色荧光染料掺杂的磁性编码微球。
水，在30℃条件下继续避光旋转反应22h，反应后去上清，依次用无水乙醇和水清洗三次，即
得到表面包覆有氧化硅的FITC和RITC双色荧光染料掺杂的磁性编码微球。
[0315] 由制备方法8制备得到的磁性荧光编码微球，FITC染料的荧光编码信息可被流式细胞仪的488nm激发光激发，滤光片接收的发射波段为515±10nm；RITC染料的荧光编码信
息可被流式细胞仪的488nm激发光激发，滤光片接收的发射波段为565±10nm。或者FITC染
料的荧光编码信息也可被荧光显微镜的488nm激发光激发，滤光片接收的发射波段为515±
15nm；RITC染料的荧光编码信息也可被荧光显微镜的488nm激发光激发，滤光片接收的发射
波段为585±15nm。
息可被流式细胞仪的488nm激发光激发，滤光片接收的发射波段为565±10nm。或者FITC染
料的荧光编码信息也可被荧光显微镜的488nm激发光激发，滤光片接收的发射波段为515±
15nm；RITC染料的荧光编码信息也可被荧光显微镜的488nm激发光激发，滤光片接收的发射
波段为585±15nm。
[0316] 如图8所示，采用直径为5.5μm的多孔二氧化硅为微球载体，利用FITC和RITC作为掺杂染料，制备得到了51重在流式细胞仪上可区分的荧光染料掺杂编码微球。如图9所示，
制备方法8制备的荧光染料掺杂编码微球也可以利用荧光显微镜进行解码分析，根据荧光
强度可以得到51重编码微球的二维阵列排布。
制备方法8制备的荧光染料掺杂编码微球也可以利用荧光显微镜进行解码分析，根据荧光
强度可以得到51重编码微球的二维阵列排布。
[0317] 对于本实施例中根据制备方法1～8所制得的表面包覆有氧化硅的编码微球，可以采用实施例一中制备方法的步骤6中的具体方式(关于表面功能化修饰的制备流程)，在微
球表面修饰功能分子，以获得表面修饰有羧基的编码微球。
球表面修饰功能分子，以获得表面修饰有羧基的编码微球。
[0318] 以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术
人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的
技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的
技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。