一株草酸青霉菌及其应用转让专利
申请号 : CN202010933191.2
文献号 : CN112111409B
文献日 : 2021-12-07
发明人 : 季乃云 , 刘雅萍
申请人 : 中国科学院烟台海岸带研究所
摘要 :
本发明涉及微生物技术领域，具体地说是一种深海冷泉沉积物获得的真菌，及获得的天然偶氮甾体衍生物及其制备方法和在抑藻和抑菌方面的应用。具体结构式如（I）所示，其制备方法为将深海冷泉沉积物来源的真菌草酸青霉（Penicillium oxalicum）13‑37接种于真菌培养基中发酵培养，发酵产物经分离纯化，即为式（I）所示的偶氮甾体衍生物。本发明获得的偶氮甾体衍生物具有抗微藻和抗菌的活性。
权利要求 :
1.一株草酸青霉菌，其特征在于：草酸青霉(Penicillium oxalicum)13‑37于2020年6月9日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.19913，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种权利要求1所述的草酸青霉菌的应用，其特征在于：所述菌株在制备抑藻剂或抑菌剂中的应用。
3.按权利要求2所述的草酸青霉菌的应用，其特征在于：所述抑藻剂或抑菌剂为该菌株的发酵产物、菌悬液、浓缩物，分离液、发酵产物纯化后化合物中的一种或几种。
4.按权利要求3所述的草酸青霉菌的应用，其特征在于：所述发酵产物为将草酸青霉(Penicillium oxalicum)13‑37接种于真菌培养基中发酵所得。
5.一种偶氮甾体衍生物，其特征在于：偶氮甾体衍生物的结构如式(I)所示
6.一种权利要求5所述的偶氮甾体衍生物的制备方法，其特征在于：将深海冷泉沉积物来源的草酸青霉(Penicillium oxalicum)13‑37接种于真菌培养基中发酵培养，发酵产物经纯化后，即为式(I)所示的偶氮甾体衍生物；所述的草酸青霉(Penicillium oxalicum)
13‑37于2020年6月9日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.19913；
7.按权利要求6所述的偶氮甾体衍生物的制备方法，其特征在于具体制备步骤：
1)将草酸青霉(Penicillium oxalicum)13‑37接种于真菌培养基中发酵10‑90天，而后经有机溶剂提取液进行提取并浓缩，即为粗提物；
2)取步骤1)中的粗提物进行硅胶柱层析，用有机溶剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液经薄层层析检测；
3)收集步骤2)中洗脱组分再依次经反相硅胶柱层析和凝胶柱层析分离纯化，即得如式(I)所示的偶氮甾体衍生物。
8.按权利要求7所述的偶氮甾体衍生物的制备方法，其特征在于：步骤1)中真菌培养基为大米固体培养基、菊芋葡萄糖液体培养基或马铃薯葡萄糖液体培养基；
有机溶剂提取液为乙酸乙酯、石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇中一种或几种；
步骤2)中洗脱液为体积比50‑0:1的石油醚‑乙酸乙酯、石油醚‑乙醇、石油醚‑丙醇、石油醚‑异丙醇、二氯甲烷‑乙酸乙酯、二氯甲烷‑甲醇、二氯甲烷‑乙醇、二氯甲烷‑丙醇、二氯甲烷‑异丙醇中的一组或几组；
步骤3)所述反相硅胶柱层析洗脱液为甲醇水溶液或乙醇水溶液，其中，水溶液中甲醇或乙醇体积分数占20％‑100％；凝胶柱层析洗脱液为体积比2‑0:1的二氯甲烷‑甲醇或二氯甲烷‑乙醇。
9.一种权利要求5所述的偶氮甾体衍生物的应用，其特征在于：所述的偶氮甾体衍生物在制备抑藻剂或抑菌剂中的应用。
10.按权利要求9所述的偶氮甾体衍生物的应用，其特征在于：所述抑藻剂为抑制由赤潮引起危害的赤潮异弯藻、海洋卡盾藻或东海原甲藻中的一种或几种；所述抑菌剂为抑制柠檬假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、哈氏弧菌、副溶血弧菌中的一种或几种。
说明书 :
一株草酸青霉菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体地说是一种深海冷泉沉积物获得的真菌，及获得的天然偶氮甾体衍生物及其制备方法和在抑藻和抑菌方面的应用。
背景技术
[0002] 近年来，我国部分沿海地区赤潮发生的频率越来越高，发生面积也越来越大。赤潮发生时，水体中浮游藻类大量繁殖，贝类毒素大量分泌，不仅会毒杀鱼、虾、贝等水生生物，
人类误食含有毒素的水产品后也会产生不同程度的中毒现象。海洋致病菌广泛存在于海洋
水体中，例如弧菌对虾贝养殖以及人类健康具有危害。弧菌种类多且分布广泛，会导致虾贝
的大面积死亡，人感染弧菌也会引起多种疾病，如何有效的抑制致病菌的增殖一度成为热
点话题。
人类误食含有毒素的水产品后也会产生不同程度的中毒现象。海洋致病菌广泛存在于海洋
水体中，例如弧菌对虾贝养殖以及人类健康具有危害。弧菌种类多且分布广泛，会导致虾贝
的大面积死亡，人感染弧菌也会引起多种疾病，如何有效的抑制致病菌的增殖一度成为热
点话题。
[0003] 已知的赤潮和海洋致病菌治理的物理方法、化学方法、生物方法都成效不大且对环境破坏较大，目前，科学家们发现的一些深海来源真菌的次级代谢产物对一些引起赤潮
藻类和致病菌有较强的的抑制作用且具有环境友好等特点，这也为赤潮和海洋致病菌的治
理提供了新的研究思路。
藻类和致病菌有较强的的抑制作用且具有环境友好等特点，这也为赤潮和海洋致病菌的治
理提供了新的研究思路。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种深海冷泉沉积物获得的真菌，及获得的天然偶氮甾体衍生物及其制备方法和在抑藻和抑菌方面的应用。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0006] 一株草酸青霉菌，草酸青霉（Penicillium oxalicum）13‑37于2020年6月9日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.19913，
保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0007] 一种草酸青霉菌的应用，所述菌株在作为抑藻剂或抑菌剂中的应用。
[0008] 所述抑藻剂或抑菌剂为该菌株的发酵产物、菌悬液、浓缩物，分离液、发酵产物纯化后化合物中的一种或几种。
[0009] 所述发酵产物为将草酸青霉（Penicillium oxalicum）13‑37接种于真菌培养基中发酵所得。
[0010] 一种偶氮甾体衍生物，偶氮甾体衍生物的结构如式（I）所示
[0011]
[0012] （I）。
[0013] 一种偶氮甾体衍生物的制备方法，将深海冷泉沉积物来源的草酸青霉（Penicillium oxalicum）13‑37接种于真菌培养基中发酵培养，发酵产物经纯化后，即为式
（I）所示的偶氮甾体衍生物；所述的草酸青霉（Penicillium oxalicum）13‑37于2020年6月9
日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC
No.19913；
（I）所示的偶氮甾体衍生物；所述的草酸青霉（Penicillium oxalicum）13‑37于2020年6月9
日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC
No.19913；
[0014]
[0015] （I）。
[0016] 具体制备步骤：
[0017] 1）将草酸青霉（Penicillium oxalicum）13‑37接种于真菌培养基中发酵10‑90天，而后经有机溶剂提取液进行提取并浓缩，即为粗提物；
[0018] 2）取步骤1）中的粗提物进行硅胶柱层析，用有机溶剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液经薄层层析检测；
[0019] 3）收集步骤2）中洗脱组分再依次经反相硅胶柱层析和凝胶柱层析分离纯化，即得如式（I）所示的偶氮甾体衍生物。
[0020] 步骤1）中真菌培养基为大米固体培养基、菊芋葡萄糖液体培养基或马铃薯葡萄糖液体培养基；
[0021] 有机溶剂提取液为乙酸乙酯、石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇中一种或几种；其中几种物质以任意比例混合。
[0022] 步骤２）中洗脱液为体积比50‑0:1的石油醚‑乙酸乙酯、石油醚‑乙醇、石油醚‑丙醇、石油醚‑异丙醇、二氯甲烷‑乙酸乙酯、二氯甲烷‑甲醇、二氯甲烷‑乙醇、二氯甲烷‑丙醇、
二氯甲烷‑异丙醇中的一组或几组；
二氯甲烷‑异丙醇中的一组或几组；
[0023] 步骤３）所述反相硅胶柱层析洗脱液为甲醇水溶液或乙醇水溶液，其中，水溶液中甲醇或乙醇体积分数占20%‑100%（当甲醇或乙醇占100%时，洗脱液即为甲醇或乙醇）；凝胶
柱层析洗脱液为体积比2‑0:1的二氯甲烷‑甲醇或二氯甲烷‑乙醇。
柱层析洗脱液为体积比2‑0:1的二氯甲烷‑甲醇或二氯甲烷‑乙醇。
[0024] 一种偶氮甾体衍生物的应用，所述的偶氮甾体衍生物在抑藻剂或抑菌剂中的应用。
[0025] 所述抑藻剂为抑制由赤潮引起危害的赤潮异弯藻、海洋卡盾藻或东海原甲藻中的一种或几种；所述抑菌剂为抑制柠檬假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、哈氏弧菌、副溶
血弧菌中的一种或几种。
血弧菌中的一种或几种。
[0026] 本发明具有以下优点：本发明的偶氮甾体衍生物是通过分离于深海冷泉沉积物的真菌草酸青霉（Penicillium oxalicum）13‑37发酵经提取、分离纯化得到，其经抗微藻活性
实验和抗细菌实验得出化合物对能引起赤潮的赤潮异弯藻、海洋卡盾藻和东海原甲藻的半
数抑制浓度分别为3.7微克/毫升、1.2微克/毫升和0.68微克/毫升，对柠檬假单胞菌、大肠
杆菌、金黄色葡萄球菌、哈氏弧菌、副溶血弧菌的抑菌圈大小分别为6.5、8.3、7.0、11.3和
11.7毫米。
实验和抗细菌实验得出化合物对能引起赤潮的赤潮异弯藻、海洋卡盾藻和东海原甲藻的半
数抑制浓度分别为3.7微克/毫升、1.2微克/毫升和0.68微克/毫升，对柠檬假单胞菌、大肠
杆菌、金黄色葡萄球菌、哈氏弧菌、副溶血弧菌的抑菌圈大小分别为6.5、8.3、7.0、11.3和
11.7毫米。
[0027] 具体实施方式：
[0028] 以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
[0029] 实施例1
[0030] 草酸青霉（Penicillium oxalicum）13‑37的获取：
[0031] 1、菌株的分离：
[0032] 将深海冷泉沉积物样品用无菌海水进行梯度稀释，分离稀释度采用10‑4‑10‑6，再各取0.2、0.4、0.6、0.8毫升分别涂布于PDA培养基、PSA培养基、YM培养基和查氏培养基。于
28摄氏度培养5‑30天，进行真菌菌落观察。根据平板上菌落形态特征等不同，进行平板划线
纯化培养。
28摄氏度培养5‑30天，进行真菌菌落观察。根据平板上菌落形态特征等不同，进行平板划线
纯化培养。
[0033] 2、菌株的鉴定 :
[0034] 2.1、形态学及生理生化特征鉴定：
[0035] 菌株生长较快，呈墨绿色绒状，具有较为浓密孢子块，初步鉴定为青霉。
[0036] 2.2、ITS rDNA序列同源性分析：
[0037] 提取并克隆该菌种核糖体rDNA基因转录间隔序列进行基因测序，得到基因序列如下：
[0038] CCAACCTCCCACCCGTGTTTATCGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTCACGGCCGCCGGGGGGCATCCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACACAAACGAACTCTTGTCTGAAGATTGCAGTCTGAGTACTTGAC
TAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTA
ATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGC
CTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCTCTCGCCCCCCGCTTCCGGGGGGCGGGCC
CGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGC
GCCCGCCGGCGAACACCATCAATCTTAACCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAAC，经检索对
比，将菌株13‑37确定为草酸青霉（Penicillium oxalicum）。
TAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTA
ATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGC
CTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCTCTCGCCCCCCGCTTCCGGGGGGCGGGCC
CGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGC
GCCCGCCGGCGAACACCATCAATCTTAACCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAAC，经检索对
比，将菌株13‑37确定为草酸青霉（Penicillium oxalicum）。
[0039] 实施例2
[0040] 深海冷泉沉积物来源的真菌中分离得到的偶氮甾体衍生物的结构如式（I）所示。
[0041]
[0042] 该化合物具有以下理化和波谱特性：
[0043] 黄色晶体；比旋光度[α]27D 141.9 (c 0.02, MeOH)；核磁共振氢谱（溶剂为氘代氯仿）δH 1.98 m, 1.90 m, 2.60 m, 2.40 m, 7.08 s ,2.61 d (16.1), 2.53 d (16.1),
2.85 t (9.4), 1.92 m , 1.81 m , 1.75 m, 1.62 dt (12.5,8.1), 2.56 m, 2.46 m,
1.86 m, 1.74 m,1.39 br d (12.7), 1.00 s, 1.16 s, 2.39 m,1.07 d (7.0), 5.25 dd
(15.5,4.6), 5.28 dd (15.5,5.0), 1.87 m , 1.47 octet (6.8), 0.82 d (6.8), 0.84
d (6.8), 0.92 d (6.8), 11.07 s, 7.66 d (8.5), 7.45 dd (8.5,7.1), 6.84 dd
(7.8,7.1), 7.98 d(7.8)；
2.85 t (9.4), 1.92 m , 1.81 m , 1.75 m, 1.62 dt (12.5,8.1), 2.56 m, 2.46 m,
1.86 m, 1.74 m,1.39 br d (12.7), 1.00 s, 1.16 s, 2.39 m,1.07 d (7.0), 5.25 dd
(15.5,4.6), 5.28 dd (15.5,5.0), 1.87 m , 1.47 octet (6.8), 0.82 d (6.8), 0.84
d (6.8), 0.92 d (6.8), 11.07 s, 7.66 d (8.5), 7.45 dd (8.5,7.1), 6.84 dd
(7.8,7.1), 7.98 d(7.8)；
[0044] 核磁共振碳谱（溶剂为氘代氯仿）δC 37.6 CH2, 20.9 CH2, 144.4 C, 131.7 CH, 141.6 C, 199.2 C, 41.3 CH2, 62.8 C, 49.5 CH, 35.6 C, 25.6 CH2, 39.2 CH2, 53.8
C, 215.9 C, 38.2 CH2, 23.2 CH2, 50.8 CH，17.3 CH3, 24.5 CH3, 37.5 CH, 23.6 CH3,
132.8 CH, 135.0 CH, 43.4 CH, 33.2 CH, 19.8 CH3, 20.2 CH3, 17.8 CH3, 147.3 C,
+
114.1 CH, 135.8 CH, 119.1 CH, 131.7 CH, 109.4 C, 172.4 C；高分辨质谱[M+Na]m/z
581.3357，计算值581.3355。
C, 215.9 C, 38.2 CH2, 23.2 CH2, 50.8 CH，17.3 CH3, 24.5 CH3, 37.5 CH, 23.6 CH3,
132.8 CH, 135.0 CH, 43.4 CH, 33.2 CH, 19.8 CH3, 20.2 CH3, 17.8 CH3, 147.3 C,
+
114.1 CH, 135.8 CH, 119.1 CH, 131.7 CH, 109.4 C, 172.4 C；高分辨质谱[M+Na]m/z
581.3357，计算值581.3355。
[0045] 实施例3
[0046] 如式（I）所示的偶氮甾体衍生物的制备方法：
[0047] 取平板上生长良好的草酸青霉（Penicillium oxalicum）13‑37菌种，切成小块并接种于大米固体培养基中，每1升三角瓶中加入50克大米固体培养基，100毫升半海水（50毫
升蒸馏水，50毫升海水），共200瓶，室温静止发酵30天，后用体积比为1：:1的二氯甲烷‑甲醇
提取三次，减压浓缩，浓缩后得草酸青霉代谢产物粗提物共计536克。
升蒸馏水，50毫升海水），共200瓶，室温静止发酵30天，后用体积比为1：:1的二氯甲烷‑甲醇
提取三次，减压浓缩，浓缩后得草酸青霉代谢产物粗提物共计536克。
[0048] 所述大米固体培养基组成为每升含500克大米，葡萄糖20克，蛋白胨6克，酵母膏5克，味精3克，NaBr 1克。
[0049] 草酸青霉（Penicillium oxalicum）13‑37菌种于2020年6月9日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：中国科学院微生物研究所，保藏编号
为CGMCC No.19913,分类命名为Penicillium oxalicum，株号为13‑37。。
为CGMCC No.19913,分类命名为Penicillium oxalicum，株号为13‑37。。
[0050] 将草酸青霉代谢产物粗提物经100‑200目的硅胶柱层析，依次用体积比50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1到0:1的石油醚‑乙酸乙酯和20:1、10:1、5:1、2:1到0:1的二氯甲烷‑甲
醇进行梯度洗脱，收集各段洗脱液，再用薄层层析（TLC）检测收集的各组分(体积比50‑1:1
的二氯甲烷‑甲醇展开，茴香醛‑硫酸显色)，根据比移值（Rf值）来判断、合并相同或类似部
分，获得8个组分（1‑8）。
醇进行梯度洗脱，收集各段洗脱液，再用薄层层析（TLC）检测收集的各组分(体积比50‑1:1
的二氯甲烷‑甲醇展开，茴香醛‑硫酸显色)，根据比移值（Rf值）来判断、合并相同或类似部
分，获得8个组分（1‑8）。
[0051] 将Rf值为0.4‑0.5（体积比1:2的石油醚‑乙酸乙酯展开，茴香醛‑硫酸显色）的组分5，即以体积比1:1的石油醚‑乙酸乙酯梯度洗脱下的组分再依次经反相C18硅胶柱和
Sephadex LH‑20凝胶柱分离。反相C18硅胶柱层析洗脱液为体积分数98%的甲醇的水溶液
（即，甲醇水溶液，其中甲醇体积占98%），TLC检测（体积比1:2的石油醚‑乙酸乙酯展开，茴香
醛‑硫酸显色），收集茴香醛‑硫酸呈橘红色的组分；再经Sephadex LH‑20凝胶柱层析，洗脱
液为甲醇，TLC检测（体积比体积比1:2的石油醚‑乙酸乙酯展开，茴香醛‑硫酸显色），收集Rf
值为0.4‑0.5的组分即为式（I）所示化合物（9.4毫克）。经薄层层析检测（体积比1:2的石油
醚‑乙酸乙酯展开，茴香醛‑硫酸显色），呈单个、显橘红色斑点，确定为纯化合物。经波谱分
析，其结构鉴定为一种偶氮甾体衍生物，结构式如（I）所示。
Sephadex LH‑20凝胶柱分离。反相C18硅胶柱层析洗脱液为体积分数98%的甲醇的水溶液
（即，甲醇水溶液，其中甲醇体积占98%），TLC检测（体积比1:2的石油醚‑乙酸乙酯展开，茴香
醛‑硫酸显色），收集茴香醛‑硫酸呈橘红色的组分；再经Sephadex LH‑20凝胶柱层析，洗脱
液为甲醇，TLC检测（体积比体积比1:2的石油醚‑乙酸乙酯展开，茴香醛‑硫酸显色），收集Rf
值为0.4‑0.5的组分即为式（I）所示化合物（9.4毫克）。经薄层层析检测（体积比1:2的石油
醚‑乙酸乙酯展开，茴香醛‑硫酸显色），呈单个、显橘红色斑点，确定为纯化合物。经波谱分
析，其结构鉴定为一种偶氮甾体衍生物，结构式如（I）所示。
[0052]
[0053] 实施例4
[0054] 与实施例2不同之处在于取平板上生长良好的草酸青霉（Penicillium oxalicum）13‑37菌种，切成小块并接种于菊芋葡萄糖液体培养基中，每1升三角瓶中放300毫升培养
基，共200瓶，室温静止发酵45天，过滤并收集其菌丝体和发酵液。所述菊芋葡萄糖液体培养
基组成为每升含菊芋块茎汁500毫升，陈海水500毫升，葡萄糖20克，蛋白胨5克，酵母膏3克。
再后用乙酸乙酯提取三次，减压浓缩，浓缩后得草酸青霉代谢产物粗提物216克。
基，共200瓶，室温静止发酵45天，过滤并收集其菌丝体和发酵液。所述菊芋葡萄糖液体培养
基组成为每升含菊芋块茎汁500毫升，陈海水500毫升，葡萄糖20克，蛋白胨5克，酵母膏3克。
再后用乙酸乙酯提取三次，减压浓缩，浓缩后得草酸青霉代谢产物粗提物216克。
[0055] 将草酸青霉代谢产物粗提物经200‑300目的硅胶柱层析，依次用体积比50:1、30:1、20:1、15:1、10:1、5:1、2:1、1:1到0:1的石油醚‑乙醇进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，再
用薄层层析检测收集的各组分(体积比50‑0:1的石油醚‑乙醇展开，茴香醛‑硫酸显色)， 根
据Rf值来判断、合并相同或类似部分，获得8个组分（1‑8）。
用薄层层析检测收集的各组分(体积比50‑0:1的石油醚‑乙醇展开，茴香醛‑硫酸显色)， 根
据Rf值来判断、合并相同或类似部分，获得8个组分（1‑8）。
[0056] 将Rf值为0.5‑0.6（体积比30:1的石油醚‑乙醇，茴香醛‑硫酸显色）的组分3，即以体积比20:1的石油醚‑乙醇梯度洗脱下的组分再依次经反相C18硅胶柱和Sephadex LH‑20凝
胶柱分离。反相C18硅胶柱层析洗脱液为体积分数90%的乙醇的水溶液（即，乙醇水溶液，其中
乙醇体积占90%），TLC检测（体积比30:1的石油醚‑乙醇，茴香醛‑硫酸显色），收集茴香醛‑硫
酸显橘红色的组分；收集组分经Sephadex LH‑20凝胶柱层析时洗脱液为乙醇，TLC检测（体
积比30:1的石油醚‑乙醇，茴香醛‑硫酸显色），收集Rf值为0.5‑0.6的组分，得式（I）所示偶
氮甾体衍生物。
胶柱分离。反相C18硅胶柱层析洗脱液为体积分数90%的乙醇的水溶液（即，乙醇水溶液，其中
乙醇体积占90%），TLC检测（体积比30:1的石油醚‑乙醇，茴香醛‑硫酸显色），收集茴香醛‑硫
酸显橘红色的组分；收集组分经Sephadex LH‑20凝胶柱层析时洗脱液为乙醇，TLC检测（体
积比30:1的石油醚‑乙醇，茴香醛‑硫酸显色），收集Rf值为0.5‑0.6的组分，得式（I）所示偶
氮甾体衍生物。
[0057] 实施例5
[0058] 抗微藻活性实验：
[0059] 具体为: 以上述实施例获得单体化合物用二甲基亚砜（DMSO）配制成4毫克/毫升的化合物溶液或草酸青霉代谢产物粗提物溶液作为样品，活化供试微藻，取对数生长期的
4
微藻，采用已灭菌的f/2培养基，稀释到约5×10 个/毫升的藻细胞浓度。再取96孔板，每孔
加195微升藻液为测试培养板。实验组加5微升浓度为4毫克/毫升的化合物溶液或粗提物溶
液，空白对照组加5微升溶剂，阳性对照组加5微升浓度为4毫克/毫升的K2Cr2O7溶液，实验
组、阳性对照组和空白对照组各设三个平行。培养温度为20 °C，光照强度为2000 Lux，光暗
比14:10（小时）条件下，培养24小时。利用血球计数板，在显微镜下对各实验组中微藻进行
计数。其中供试微藻为赤潮异弯藻、海洋卡盾藻和东海原甲藻。
4
微藻，采用已灭菌的f/2培养基，稀释到约5×10 个/毫升的藻细胞浓度。再取96孔板，每孔
加195微升藻液为测试培养板。实验组加5微升浓度为4毫克/毫升的化合物溶液或粗提物溶
液，空白对照组加5微升溶剂，阳性对照组加5微升浓度为4毫克/毫升的K2Cr2O7溶液，实验
组、阳性对照组和空白对照组各设三个平行。培养温度为20 °C，光照强度为2000 Lux，光暗
比14:10（小时）条件下，培养24小时。利用血球计数板，在显微镜下对各实验组中微藻进行
计数。其中供试微藻为赤潮异弯藻、海洋卡盾藻和东海原甲藻。
[0060] 实验结果：上述获得的偶氮甾体衍生物在该浓度下对赤潮异弯藻、海洋卡盾藻和东海原甲藻的抑制率分别为100%、100%和100%，具有抑制赤潮异弯藻、海洋卡盾藻和东海原
甲藻的作用。同时，在该浓度下，草酸青霉代谢产物粗提物对赤潮异弯藻、海洋卡盾藻和东
海原甲藻的抑制率分别为100%、93%和100%，因此，菌株的代谢产物具有抑制赤潮异弯藻、海
洋卡盾藻和东海原甲藻的作用。
甲藻的作用。同时，在该浓度下，草酸青霉代谢产物粗提物对赤潮异弯藻、海洋卡盾藻和东
海原甲藻的抑制率分别为100%、93%和100%，因此，菌株的代谢产物具有抑制赤潮异弯藻、海
洋卡盾藻和东海原甲藻的作用。
[0061] 进一步计算化合物半数抑制浓度（IC50值）。将配置好的终浓度为4毫克/毫升的化合物溶液进行稀释，最终得到10组浓度依次降低的组分400、200、100、50、25、12.5、6.25、
3.125、1.5625、0.78125、0.390625、0、1953125微克/毫升溶液，每个梯度至少设置3组平行，
方法同上述方法，用显微镜观察并计算各浓度梯度下化合物的微藻抑制率，取抑制率在0‑
100之间至少6个浓度梯度，计算半数抑制浓度。
3.125、1.5625、0.78125、0.390625、0、1953125微克/毫升溶液，每个梯度至少设置3组平行，
方法同上述方法，用显微镜观察并计算各浓度梯度下化合物的微藻抑制率，取抑制率在0‑
100之间至少6个浓度梯度，计算半数抑制浓度。
[0062] 实验结果：上述获得的偶氮甾体衍生物对赤潮异弯藻、海洋卡盾藻和东海原甲藻的IC50值分别为3.7微克/毫升、1.2微克/毫升和0.68微克/毫升，具有抑制赤潮异弯藻、海洋
卡盾藻和东海原甲藻的作用。
卡盾藻和东海原甲藻的作用。
[0063] 实施例6
[0064] 抗细菌活性实验
[0065] 活化供试菌株，接种至LB培养基或2216E细菌培养基，37 ℃培养24 小时。后用4
0.85%的NaCl溶液洗涤培养基并将菌悬液吸出，用比浊法将菌液稀释至1.5×10 CFU/毫
升。其中供试细菌为柠檬假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、哈氏弧菌、副溶血弧菌。再
6
将各菌悬液进一步经水稀释至1.0×10 CFU/毫升，并将其接种于平板中。将上述实施例获
得单体化合物或草酸青霉代谢产物的粗提物作为样品溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，分别配
成浓度为4毫克/毫升的单体化合物溶液和20毫克/毫升的粗提物溶液。再取5微升样品加到
直径为5毫米的无菌滤纸片上，并用加有相同体积溶剂的滤纸片做阴性对照，用氯霉素作阳
性对照，每组各设置3个平行。最后将加有样品和对照的平板于37 ℃培养箱，静置培养24小
时，采用十字交叉法测定抑菌圈的直径。
0.85%的NaCl溶液洗涤培养基并将菌悬液吸出，用比浊法将菌液稀释至1.5×10 CFU/毫
升。其中供试细菌为柠檬假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、哈氏弧菌、副溶血弧菌。再
6
将各菌悬液进一步经水稀释至1.0×10 CFU/毫升，并将其接种于平板中。将上述实施例获
得单体化合物或草酸青霉代谢产物的粗提物作为样品溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，分别配
成浓度为4毫克/毫升的单体化合物溶液和20毫克/毫升的粗提物溶液。再取5微升样品加到
直径为5毫米的无菌滤纸片上，并用加有相同体积溶剂的滤纸片做阴性对照，用氯霉素作阳
性对照，每组各设置3个平行。最后将加有样品和对照的平板于37 ℃培养箱，静置培养24小
时，采用十字交叉法测定抑菌圈的直径。
[0066] 实验结果：上述获得的偶氮甾体衍生物(20微克/滤纸片)对柠檬假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、哈氏弧菌、副溶血弧菌的抑菌圈大小分别为6.5、8.3、7.0、11.3和11.7
毫米，可见该化合物具有抑制柠檬假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、哈氏弧菌和副溶
血弧菌的作用。
毫米，可见该化合物具有抑制柠檬假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、哈氏弧菌和副溶
血弧菌的作用。
[0067] 同时，草酸青霉代谢产物的粗提物(100微克/滤纸片)对副溶血弧菌和灿烂弧菌的抑菌圈大小分别为6.6毫米和6.3毫米，可见该具有抑制副溶血弧菌和灿烂弧菌的作用。