一种光敏剂前药化合物及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种光敏剂前药化合物及其制备方法和应用，提供的兼具双靶向和GSH耗尽特性的光敏剂前药化合物，这些化合物的结构主要包括以下三个部分：(1)ALA或其衍生物，该部分可通过细胞内血红素生物合成途径转化为光敏剂原卟啉(PpIX)；(2)生物素，用于靶向肿瘤细胞中的生物素受体；(3)二硫键，在ALA或其衍生物的5‑氨基基团上引入，它能够在细胞内GSH作用下发生自毁释放ALA或其衍生物(如ALA‑OMe)，此外，发明人还发现二硫键与GSH之间的反应也同时消耗细胞内GSH，导致肿瘤细胞对ROS更加敏感。同时，这些化合物在酸性、中性和碱性条件下均具有较高的稳定性。

权利要求

1.一种光敏剂前药化合物，其特征在于，具有如下任一所示的分子结构：

2.一种化合物1的制备方法，其特征在于，包括：将生物素与2‑羟乙基二硫化物进行酯化反应，得到化合物1‑A；

将化合物1‑A经DSC活化得到化合物1‑B；

将化合物1‑B和化合物1‑C经偶合反应得到化合物1；

合成路线如下：

3.一种化合物2的制备方法，其特征在于，包括：将生物素和四甘醇进行酯化反应，得到化合物2‑A；

将化合物2‑A和丁二酸进行酯化反应，得到化合物2‑B；

将化合物2‑B和2‑羟乙基二硫化物进行酯化反应，得到化合物2‑C；

将化合物2‑C经DSC活化，得到化合物2‑D；

将化合物2‑D与化合物2‑E进行偶合反应，得到化合物2；

合成路线如下：

4.权利要求1所述的光敏剂前药化合物在制备用于光动力诊疗的药物中的应用。

5.权利要求1所述的光敏剂前药化合物在制备耗竭谷胱甘肽的制剂中的应用。

说明书

一种光敏剂前药化合物及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种光敏剂前药化合物及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 癌症是人类死亡的主要威胁，因此迫切地需要开发有效的癌症治疗方法。目前，光动力疗法(PDT)广泛应用于治疗人类癌症，且具有副作用低的优点。其中，光敏剂在PDT中起
着重要的作用。光敏剂在光和氧气同时存在下，可产生活性氧(Ros)，对肿瘤细胞或组织造
成氧化损伤。到目前为止，研究者们已经设计和合成了多种光敏剂用于PDT治疗，然而，只有
少数光敏剂被批准用于临床。其中，5‑氨基乙酰丙酸(ALA)受到了广泛的关注。不同于其它
光敏剂，ALA本身没有光敏性，但可以通过细胞内血红素生物合成途径转化为光敏剂卟啉
(PpIX)。与其他光敏剂相比，ALA具有快速清除、低皮肤光敏性和低全身毒性等优点。在生理
条件下，ALA是一种两性离子，亲水性强，不能有效地穿透细胞膜等生物屏障，因此提高ALA
的亲脂性是提高其细胞穿透性的最有效途径，而ALA的酯化是提高亲脂性的一种常见方法，
其中最具代表性的是ALA‑OMe(Metvix)和ALA‑OHex(Cysview)。目前，Metvix已广泛用于治
疗光化性角化病和基底细胞癌，而Cysview被批准用于膀胱癌的光检测。然而，ALA及其酯类
衍生物在生理条件下仍然存在不稳定性的缺点。这主要是由于5‑氨基基团的高亲核性，ALA
及其酯类衍生物在生理条件下均易形成希夫氏碱二聚体。

[0003] 此外，几乎所有光敏剂都缺乏肿瘤特异性，包括ALA及其衍生物。研究者们已经提出了各种方法来解决这一问题，主要可归纳为两个方面：(1)利用肿瘤特异性配体靶向输送
光敏剂；(2)利用肿瘤环境激活光敏剂。近几十年来，已设计出多种连接有肿瘤特异性配体
(如维生素、单糖和核苷)的ALA酯类衍生物以提高肿瘤的选择性。然而，这些肿瘤靶向的ALA
酯类衍生物在生理条件下仍然不稳定。与此同时，研究者们又开发了肿瘤微环境可激活的
ALA衍生物。不同于ALA酯类衍生物，这些应激响应的ALA衍生物的合成主要是通过一个易被
肿瘤相关刺激因子(如组织蛋白酶e、β‑葡萄糖醛酸酶和肿瘤高表达氨基肽酶)激活的基团
来修饰ALA中的5‑氨基。与ALA及其酯类衍生物相比，这些N‑修饰的衍生物在生理条件下非
常稳定。ALA的有效释放对于N‑修饰的ALA前药实现其药理活性是必不可少的。近来，发展出
了双靶向策略以进一步提高光敏剂的肿瘤特异性。这类光敏剂通常含有一个肿瘤靶向配
体，用于增强肿瘤细胞或组织的选择性摄取，以及一个肿瘤微环境响应的基团来激活光敏
剂。据报道，双靶向光敏剂通常表现出优异的肿瘤选择性和较高的靶本比。然而，目前还没
有关于双靶向ALA衍生物的报道，主要原因可能在于，化合物结构发生微小变化，其作用可
能会发生改变，合成具有双靶向ALA衍生物难度较大，因此，到目前为止，关于双靶向ALA衍
生物的报道较少。

发明内容

[0004] 因此，本发明要解决的技术问题在于一种光敏剂前药化合物及其制备方法和应用。

[0005] 为此，本发明提供了如下的技术方案：

[0006] 本发明提供了一种光敏剂前药化合物，

[0007] 其中，R1选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、氧杂烷基、氧杂环烷基、苯烷基、芳基、杂芳基、芳胺基或芳氧基；

[0008] R2为 时，R3为(CH2)n，n为≥2的整数，或为其中x为>0的整数；

[0009] R2为 时，R3为 y为>0的整数。

[0010] 可选的，x为1‑6的整数。可选的，y为1‑6的整数。可选的，x＝3。可选的，y＝6。

[0011] 可选的，具有如下任一所示的分子结构：

[0012]

[0013] 其中，R1选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、氧杂烷基、氧杂环烷基、苯烷基、芳基、杂芳基、芳胺基或芳氧基。

[0014] 可选的，R1选自氢、C1‑C10的取代或未取代的烷基、C1‑C10的取代或未取代的烯基、C1‑C10的取代或未取代的炔基、C3‑C10的取代或未取代的环烷基、C4‑C10的取代或未取代的环
烯基、C5‑C10的取代或未取代的环炔基、C1‑C10的取代或未取代的烷氧基、C1‑C10的取代或未
取代的烯氧基、C1‑C10的取代或未取代的炔氧基、C2‑C10的取代或未取代的氧杂烷基、C3‑C10
的取代或未取代的氧杂环烷基、C7‑C10的取代或未取代的苯烷基、C4‑C10的取代或未取代的
芳基、C3‑C10的取代或未取代的杂芳基、C4‑C10的取代或未取代的芳胺基、C4‑C10的取代或未
取代的芳氧基。

[0015] 可选的，R1选自氢、甲基或下述任一基团：

[0016]

[0017] 本发明提供了一种化合物1的制备方法，包括：

[0018] 将生物素与2‑羟乙基二硫化物进行酯化反应，得到化合物1‑A；

[0019] 将化合物1‑A经DSC活化得到化合物1‑B；

[0020] 将化合物1‑B和化合物1‑C经偶合反应得到化合物1；

[0021] 合成路线如下：

[0022]

[0023] 可选的，在化合物1‑A制备步骤中，将EDCI(1.2eq)、生物素(1.0eq)、2‑羟乙基二硫化物(3.0eq)和DMAP(0.2eq)溶于超干THF中，氮气下，室温反应过夜。

[0024] 可选的，在化合物1‑B制备步骤中，将化合物1‑A(1.0eq)和DSC(2.0eq)溶于干燥乙腈中，加入DIPEA(3.0eq)，室温反应过夜。

[0025] 可选的，在化合物1制备步骤中，将化合物1‑B(1eq)和化合物1‑C(1.05eq)溶于干燥THF，缓慢加入DIPEA(2.0eq)，室温反应过夜。反应液加入CH2Cl2，并用饱和碳酸氢钠以及
氯化铵溶液洗一遍，有机相Na2SO4干燥后旋干，残渣用硅胶柱色谱分离后得产物。

[0026] 本发明提供了一种化合物2的制备方法，包括：

[0027] 将生物素和四甘醇进行酯化反应，得到化合物2‑A；

[0028] 将化合物和丁二酸进行酯化反应，得到化合物2‑B；

[0029] 将化合物2‑B和2‑羟乙基二硫化物进行酯化反应，得到化合物2‑C；

[0030] 将化合物2‑C经DSC活化，得到化合物2‑D；

[0031] 将化合物2‑D与化合物2‑E进行偶合反应，得到化合物2；

[0032] 合成路线如下：

[0033]

[0034] 可选的，在化合物2‑A制备步骤中，将EDCI(1.2eq))、生物素(1.0eq)、四甘醇(3.0eq)和DMAP(0.2eq)溶于超干THF中，氮气下，室温反应过夜。

[0035] 可选的，在化合物2‑B制备步骤中，将化合物2‑A(1.0eq),丁二酸(3.0eq),EDCI(1.5eq)和DMAP(0.2eq)溶于无水THF，反应过夜。

[0036] 可选的，在化合物2‑C制备步骤中，将EDCI(1.2eq)、化合物2‑B(1.0eq)、2‑羟乙基二硫化物(3.0eq)和DMAP(0.2eq)溶于超干THF中，氮气下，室温反应过夜。

[0037] 可选的，在化合物2‑D的制备步骤中，将化合物2‑C(1.0eq)和DSC(2.0eq)溶于干燥乙腈中，加入DIPEA(3.0eq)，室温反应过夜。

[0038] 可选的，在化合物2的制备步骤中，将化合物2‑D(1eq)和化合物2‑E(1.05eq)溶于干燥THF，缓慢加入DIPEA(2.0eq)，室温反应过夜，然后向反应液加入CH2Cl2，并用饱和碳酸
氢钠以及氯化铵溶液洗一遍。有机相Na2SO4干燥后旋干，残渣用硅胶柱色谱分离后得产物。

[0039] 本发明提供了一种化合物3的制备方法，包括：

[0040] 将2‑羟乙基二硫化物和Boc‑甘氨酸进行酯化反应，得到化合物3‑A；

[0041] 将化合物3‑A经DSC活化，得到化合物3‑A‑1；

[0042] 将化合物3‑A‑1与化合物3‑A‑2进行偶合反应，得到化合物3‑B；

[0043] 化合物3‑B经过脱保护得到脱保护产物3‑B‑1；

[0044] 将脱保护产物3‑B‑1和Botin‑PEG6‑NHS经偶合反应，得到化合物3；

[0045] 合成路线如下：

[0046]

[0047] 可选的，在化合物3‑A的制备步骤中，将EDCI(1.2eq)、Boc‑甘氨酸(1.0eq)、2‑羟乙基二硫化物(3.0eq)和DMAP(0.2eq)溶于超干THF中。氮气下，室温反应过夜。

[0048] 可选的，在化合物3‑A‑1的制备步骤中，将化合物3‑A(1.0eq)和DSC(2.0eq)溶于干燥乙腈中，加入DIPEA(3.0eq)，室温反应过夜。

[0049] 可选的，化合物3‑B的制备步骤中，将化合物3‑A‑1(1eq)和化合物3‑A‑2(1.05eq)溶于干燥THF，缓慢加入DIPEA(2.0eq)，室温反应过夜，然后向反应液加入CH2Cl2，并用饱和
碳酸氢钠以及氯化铵溶液洗一遍。有机相Na2SO4干燥后旋干，残渣用硅胶柱色谱分离后得
产物。

[0050] 可选的，在化合物3‑B‑1的制备步骤中，将化合物3‑B(1.0eq)溶于三氟乙酸和二氯甲烷混合溶剂中(1:1，v/v)，反应0.5h。

[0051] 可选的，在化合物3的制备步骤中，将化合物3‑B‑1(1eq)、Botin‑PEG6‑NHS(1.0eq)和DIPEA(2.0eq)溶于无水THF，反应过夜。

[0052] 本发明提供了所述的光敏剂前药化合物、所述制备方法制备的化合物1、所述制备方法制备的化合物2或所述制备方法制备的化合物3在制备用于光动力诊疗的药物中的应
用。

[0053] 本发明提供了所述的光敏剂前药化合物、所述的制备方法制备的化合物1、所述的制备方法制备的化合物2或所述的制备方法制备的化合物3在制备耗竭谷胱甘肽的制剂中
的用途。

[0054] 本发明技术方案，具有如下优点：

[0055] 1.本发明提供的兼具双靶向和GSH耗尽特性的光敏剂前药化合物，这些化合物的结构主要包括以下三个部分：(1)ALA或其衍生物(如ALA‑OMe)，该部分可通过细胞内血红素
生物合成途径转化为光敏剂原卟啉(PpIX)；(2)生物素，用于靶向肿瘤细胞中的生物素受
体；(3)ALA或其衍生物的5‑氨基基团上引入二硫键，二硫键是一种GSH的响应基团，它能够
在细胞内GSH作用下发生自毁释放ALA或其衍生物(如ALA‑OMe)。此外，发明人还发现二硫键
与GSH之间的反应也同时消耗细胞内GSH，导致肿瘤细胞对ROS更加敏感。这些化合物在酸
性、中性和碱性条件下均具有较高的稳定性。体外实验表明，与母体化合物ALA或其衍生物
如(ALA‑OMe)相比，化合物1和化合物2亲脂性的改善使其在生物素高表达的HeLa细胞中能
够更有效地产生PpIX，同时，PpIX生成的量与肿瘤细胞中生物素和GSH水平的过表达呈正相
关。更重要的是，该化合物的GSH耗竭能力显著提高了化合物的光毒性。此外，与母体化合物
ALA或其衍生物如(ALA‑OMe)相比，本发明通过引入不同链长的乙二醇来调节亲脂性，获得
的具有适宜亲脂性的化合物2的体内PpIX生产效率要高得多。总之，双靶向和GSH耗竭的联
合策略显著提高了基于ALA的PDT的抗肿瘤效果。

[0056] 2、本发明提供的化合物1、化合物2和化合物3的制备方法，步骤简单，反应效率高。

[0057] 3、本发明提供的光敏剂前药化合物(如化合物1、化合物2和化合物3)具有制备用于光动力诊疗的药物中的应用，光敏剂前药化合物具有肿瘤靶向性和GSH响应能力，具有
GSH耗尽功能，在双靶向和GSH耗尽的协同作用，进一步提高光毒性，且在中性、碱性和酸性
下具有良好的稳定性。

[0058] 4、本发明提供的光敏剂前药化合物(如化合物1、化合物2和化合物3)具有制备耗竭谷胱甘肽的制剂中的应用，光敏剂前药化合物具有耗尽肿瘤细胞内GSH水平的作用，因
此，可以将光敏剂前药化合物用于制备耗竭谷胱甘肽的制剂。

附图说明

[0059] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的
附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前
提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0060] 图1是本发明实施例3中化合物1的作用机理图；图中(a)为由GSH激活的化合物1的机理；图中(b)为化合物1的双重靶向和GSH耗竭过程以增强PDT的示意图；

[0061] 图2是本发明实验例1中化合物1、2和3在37℃不同缓冲液(pH＝4.0、7.4和9.0)中的稳定性分布；图中(a)为化合物1，(b)为化合物2，(c)为化合物3；

[0062] 图3是本发明实验例2中化合物1、2和3在37℃在含GSH的PBS(pH＝7.4)缓冲液中化合物1‑3裂解的动力学；

[0063] 图4是本发明实验例2中GSH和化合物1的反应液的质谱；

[0064] 图5是本发明实验例2中GSH和化合物2的反应液的质谱；

[0065] 图6是本发明实验例2中GSH和化合物3的反应液的质谱；

[0066] 图7是本发明实验例2中GSH和化合物1‑3反应液的HPLC图谱；图中(a)为化合物1，(b)为化合物2，(c)为化合物3；

[0067] 图8是本发明实验例3中HeLa细胞中的PpIX荧光动力学；

[0068] 图9是本发明实验例4中在生物素(500μM)或DEM(1.0mM)预处理的HeLa细胞中化合物1(100μM)和2(300μM)诱导的相对PpIX荧光；图中(a)为生物素预处理和对照组，(b)为DEM
预处理和对照组；图中*表示相对无预处理组，p<0.05,图中**表示相对无预处理组，p<
0.01；横坐标中的1和2分别代表化合物1和化合物2；

[0069] 图10是本发明实验例5中HeLa细胞与化合物1(100μM)或2(300μM)共孵育的荧光图像；图中(a)为化合物1的荧光图像，图的左侧“1”代表化合物1处理，“1+biotin”代表经过生
物素处理和化合物1处理，“1+DEM”代表经过DEM处理和化合物1处理；(b)为化合物2，图的左
侧“2”代表仅化合物2处理，“2+biotin”代表经过生物素处理和化合物2处理，“2+DEM”代表
经过DEM处理和化合物2处理；

[0070] 图11是本发明实验例6中化合物1、2、ALA、ALA‑OMe分别对HeLa细胞的光毒性；图中细胞活性是指处理后的细胞个数占处理前细胞总数的比例；

[0071] 图12是本发明实验例7中经化合物1或化合物2(300μM)处理4h后的HeLa细胞中的相对GSH含量；横坐标的1和2分别代表化合物1和化合物2；

[0072] 图13是本发明实验例8中经化合物2和ALA‑OMe(20μM/kg)处理4h后的小鼠肿瘤切片的PpIX荧光成像；

[0073] 图14是本发明实验例6中化合物1‑3对Hela细胞的暗毒性；图中细胞活性是指处理后的细胞个数占处理前细胞总数的比例。

具体实施方式

[0074] 提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其
他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的
保护范围之内。

[0075] 实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得
的常规试剂产品。

[0076] 下述实施例中的室温的温度范围为10‑30℃。

[0077] Botin‑PEG6‑NHS购自涵莱生化(杭州)；5‑ALA‑OMe盐酸盐以及AlA购自毕得医药(上海)；GSH以及生物素购自安耐吉(上海)；GSH和GSSG检测试剂盒购自碧云天(上海)；含
10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基、HeLa细胞、Hoechst33342、Botin‑PEG6‑NHS均可通过市
场购买获得。

[0078] 实施例1

[0079] 本实施例提供了一种光敏剂前药化合物1，具有下述式1所示的结构：

[0080]

[0081] 化合物1的合成路线如下所示：

[0082]

[0083] 化合物1的制备方法包括如下步骤：

[0084] (1)化合物1‑A的合成

[0085] 将原料生物素(1.0mmol)、2‑羟乙基二硫化物(3.0mmol)、1‑乙基‑3(3‑二甲基丙胺)碳二亚胺(EDCI)(1.2mmol)和4‑二甲氨基吡啶(DMAP)(0.2mmol)溶于超干四氢呋喃
(THF)(20mL)中，在氮气保护下，于室温(25℃)反应过夜，随后向反应液中加入二氯甲烷
(50mL)，用饱和碳酸氢钠和氯化铵各洗一次，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，柱层析分离，得到
+
白色固体的化合物1‑A(产率为73％)，ESI‑Ms:m/z[M+Na]理论值403.09；实测值403.18.

[0086] (2)化合物1的合成

[0087] 将化合物1‑A(1mmol)和N,N'‑二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)(2mmol)溶于干燥乙腈中，加入N,N‑二异丙基乙胺(DIPEA)(3.0mmol)，室温(25℃)反应过夜，向反应液中加入二氯
甲烷，用饱和碳酸氢钠和氯化铵各洗一次，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得中间产物化合物1‑
B。取中间产物化合物1‑B(1.0mmol)和5‑ALA‑OMe盐酸盐(1.05mmol)溶于干燥四氢呋喃
(THF)，缓慢加入DIPEA(2.0mmol)，室温反应过夜。然后向反应液中加入二氯甲烷，用饱和碳
酸氢钠和氯化铵各洗一次，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，柱层析分离，得到白色固体的化合
物1(产率为57％)。

[0088] 化合物1的确认：

[0089] 1HNMR(400MHz,CDCl3),δ(ppm):6.05(s,1H),5.84(s,1H),5.64(s,1H),4.51(m,1H),4.33(m,5H),4.13(d,J＝4.13Hz,2H),3.68(s,3H),3.17(m,1H),2.93(m,5H),2.76(m,
13
3H),2.66(m,2H),2.37(t,J＝2.37Hz,2H),1.73(m,4H),1.48(m,2H). C NMR(100MHz,
CDCl3),δ(ppm):204.23,173.49,172.93,163.75,156.08,62.89,62.15,61.98,60.13,
55.49,51.95,50.52,40.57,37.70,37.32,34.35,33.83,28.34,28.21,27.58,24.75.

[0090] ESI‑Ms:m/z[M+Na+]理论值：574.14；实测值：574.28.

[0091] 实施例2

[0092] 本实施例提供了一种光敏剂前药化合物2，具有下述式2所示的结构：

[0093]

[0094] 化合物2的合成路线如下所示：

[0095]

[0096] 化合物2的制备方法包括如下步骤：

[0097] (1)化合物2‑A的合成

[0098] 将原料生物素(1mmol)、四甘醇(3.0mmol)、EDCI(1.2mmol)和4‑二甲氨基吡啶(DMAP)(0.2mmol)溶于超干THF(20mL)中，在氮气保护下，于室温反应过夜，随后向反应液中
加入二氯甲烷(40mL)，用饱和碳酸氢钠和氯化铵各洗一次，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，柱
+
层析分离，得到无色油状物的化合物2‑A(产率67％)，ESI‑Ms:m/z[M+Na]理论值：443.19；
实测值：443.20.

[0099] (2)化合物物2‑B的合成

[0100] 将化合物2‑A(1.0mmol),丁二酸(3.0mmol),EDCI(1.5mmol)和DMAP(0.2mmol)溶于无水THF，反应过夜。向所得反应液中加入二氯甲烷，水洗一次，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，
得化合物2‑B。

[0101] (3)化合物物2‑C的合成

[0102] 将化合物2‑B(1.0mmol)、2‑羟乙基二硫化物(3.0mmol)、EDCI(1.2mmol)和4‑二甲氨基吡啶(DMAP)(0.2mmol)溶于超干THF(20mL)中，在氮气保护下，于室温(25℃)反应过夜，
随后向反应液中加入二氯甲烷(40mL)，用饱和碳酸氢钠和氯化铵各洗一次，无水硫酸钠干
+
燥，旋干溶剂，柱层析分离，得到无色油状物的化合物2‑C(产率为62％)，ESI‑Ms:m/z[M+H ]
+
理论值657.21；实测值，657.23；m/z[M+Na]理论值679.21；实测值：679.29.

[0103] (4)化合物2的合成

[0104] 将化合物2‑C(1.0mmol)和DSC(2.0mmol)溶于干燥乙腈中，加入DIPEA(3.0mmol)，室温反应过夜。向所得反应液中加入二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠和氯化铵各洗一次，无水硫
酸钠干燥，旋干溶剂得中间产物化合物2‑D。取中间产物化合物2‑D(1.0mmol)和5‑ALA‑OMe
酸盐(1.05mmol)溶于干燥THF，缓慢加入DIPEA(2.0mmol)室温反应过夜，然后向所得反应液
中加入二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠和氯化铵各洗一次，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，柱层析
分离，得到无色油状物的化合物2(产率55％)。

[0105] 化合物2的确认：

[0106] 1H NMR(400MHz,CDCl3),δ(ppm):6.03(s,1H),5.80(s,1H),5.61(d,J＝5.6Hz,1H),4.50(m,1H),4.37(m,5H),4.26(m,4H),4.12(d,J＝4.11Hz,2H),3.71‑3.65(m,15H),3.18
(m,1H),2.95‑2.89(m,5H),2.77(m,3H),2.66‑2.63(m,6H),2.37(t,J＝2.37Hz,2H),1.74
13
(m,4H),1.47(m,2H). C NMR(100MHz,CDCl3),δ(ppm):204.28,173.62,172.89,172.21,
172.06,163.83,156.08,70.49‑70.44,69.07,68.97,63.83,63.37,62.82,62.55,61.90,
60.11,55.53,51.88,50.44,40.48,37.67,36.99,34.26,33.74,28.93,28.32,28.17,
27.52,24.67.

[0107] ESI‑Ms:m/z[M+H+]理论值：828.26；实测值：828.25；m/z[M+Na+]理论值：850.26；实测值：850.27.

[0108] 实施例3

[0109] 本实施例提供了一种光敏剂前药化合物3，具有下述式3所示的结构：

[0110] 化合物3的合成路线如下所示：

[0111]

[0112] 化合物3的制备方法包括如下步骤：

[0113] (1)化合物3‑A的制备

[0114] 2‑羟乙基二硫化物(3.0mmol)和Boc‑甘氨酸(1.0mmol)、EDCI(1.2mmol)和4‑二甲氨基吡啶(DMAP)(0.2mmol)溶于超干THF(20mL)中，在氮气保护下，于室温反应过夜，随后向
反应液中加入二氯甲烷(20mL)，用饱和碳酸氢钠和氯化铵各洗一次，无水硫酸钠干燥，旋干
+
溶剂，柱层析分离，得到无色油状物的化合物3‑A(产率65％)，ESI‑Ms:m/z[M+Na ]理论值：
334.02；实测值：334.22.

[0115] (2)化合物3‑B的合成

[0116] 将化合物3‑A(1.0mmol)和DSC(2.0mmol)溶于干燥乙腈中，加入DIPEA(3.0mmol)，室温反应过夜。向所得反应液中加入二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠和氯化铵各洗一次，无水硫
酸钠干燥，旋干溶剂，得中间产物化合物3‑A‑1。取中间产物化合物3‑A‑1(1.0mmol)和5‑
ALA‑OMe盐酸盐(1.05mmol)溶于干燥THF，缓慢加入DIPEA(2.0mmol)，室温反应过夜。然后向
所得反应液中加入二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠和氯化铵各洗一次，无水硫酸钠干燥，旋干溶
+
剂，柱层析分离，得到无色油状物的化合物3‑B(产率53％)。ESI‑Ms:m/z[M+Na ]理论值：
505.14；实测值：505.59.

[0117] (3)化合物3的合成

[0118] 将化合物3‑B(1.0mmol)溶于三氟乙酸(TFA)和二氯甲烷混合溶剂中(1:1,v/v)，反应0.5h，旋干溶剂得脱保护产物3‑B‑1；

[0119] 取脱保护产物3‑B‑1(1.0mmol)、Botin‑PEG6‑NHS(1.0mmol)和DIPEA(2.0mmol)溶于无水THF，反应过夜，旋干溶剂，柱层析分离得无色油状物化合物3(产率73％)。

[0120] 化合物3的确认：

[0121] 1H NMR(400MHz,CDCl3),δ(ppm):7.38(t,J＝7.38Hz,1H),7.01(t,J＝7.38Hz,1H),6.42(s,1H),5.91(t,J＝5.91Hz,1H),5.72(s,1H),4.51(m,1H),4.40(t,J＝4.40Hz,2H),
4.32(m,3H),4.12(d,J＝4.11Hz,2H),4.06(J＝4.05Hz,2H),3.77(t,J＝3.76Hz,2H),3.68
(s,3H),3.65‑3.63(m,20H),3.57(t,J＝3.56Hz,2H),3.43(m,2H),3.15(m,1H),2.93(m,
4H),2.89(d,J＝2.89Hz,1H),2.77(m,3H),2.67(t,J＝2.65 2H),2.56(t,J＝2.54Hz,2H),
13
2.23(t,J＝2.23Hz,2H),1.73(m,4H),1.46(m,2H). C NMR(100MHz,CDCl3),δ(ppm):
204.31,173.43,172.89,172.04,172.05,163.97,155.10,70.50‑69.95,67.06,63.04,
62.80,61.79,60.18,55.61,51.91,50.50,45.81,41.21,40.52,37.69,36.93,36.53,
35.84,34.31,28.24,28.09,27.56,25.59.

[0122] ESI‑Ms:m/z[M+2Na+]理论值：494.68；实测值：494.93；m/z[M+Na+]理论值：966.36；实测值：966.40.

[0123] 基于ALA‑OMe，本发明设计了ALA衍生物—实施例1的化合物1、实施例2的化合物2和本实施例的化合物3。在临床上，ALA‑OMe的应用受到其低肿瘤选择性和不稳定性的影响。
在这里，本发明选择生物素作为靶配体，是因为生物素对生物素受体(Biotin receptor，
BR)具有很高的亲和力，而生物素受体(Biotin receptor，BR)被认为是肿瘤治疗的有效靶
点。为了实现GSH响应，本发明用含二硫键的自消除基团对ALA‑OMe中的氨基进行了修饰。另
外，申请人还发现GSH与二硫键之间的反应消耗细胞内的GSH，当使用高浓度的二硫化物时，
该反应也会耗尽细胞内的GSH。与其他光敏剂相比，相对较高剂量的ALA的光敏剂通常用于
PDT。而大多数临床光敏剂，如光蛋白和血卟啉，由于其皮肤光敏性，很难使用高剂量。因此，
本发明预测含有二硫键的ALA衍生物也可作为GSH消耗剂以增强PDT的作用。此外，药物的亲
脂性是实现体内有效给药的关键因素，因此，本发明还引入了不同链长的乙二醇来调节这
些化合物的亲脂性。如本发明的化合物1、化合物2和化合物3的结构，通过对5‑氨基的修饰，
有望在生理条件下保持稳定。化合物1的机理如图1所示，图中(a)为由GSH激活的化合物1的
机理，图中(b)为化合物1的双重靶向和GSH耗竭过程以增强PDT的示意图。首先，化合物1可
以通过BR介导的内吞作用选择性地积累在BR阳性肿瘤细胞中。然后，这些化合物中的二硫
键被癌细胞中过表达GSH切割，并通过分子内环化释放ALA‑OMe。因此本发明预测，双重选择
过程将提高化合物的肿瘤特异性。此外，GSH和化合物的反应同时消耗细胞内的GSH，导致肿
瘤细胞对ROS更敏感。

[0124] 实验例1 分配系数和稳定性

[0125] 为了研究实施例1‑3制备的化合物1、化合物2、化合物3的亲脂性，测定了其在正辛醇/水中的分配系数。具体方法为：将化合物1‑3分别溶于DMF中，各自得到含该化合物浓度
为1.0M的溶液。将各自的1.0M DMF溶液(10μL)与正辛醇(1mL)和水(1mL)混合，得到混合物。
将混合物超声处理0.5h，离心分离有机和水相。用HPLC测定各相中化合物的含量。用公式
log P＝log([正辛醇]/[水])进行计算，公式中，正辛醇代表正辛醇相中的化合物的含量，
水代表水相中化合物的含量。经计算，化合物1、化合物2和化合物3的log10P值分别为0.68、
0.24和‑1.03。这些化合物的亲脂性在很大程度上取决于聚乙二醇的链长。具有最长乙二醇
的化合物3是最亲水的，而由于不具有乙二醇基团，化合物1比化合物2和3亲脂性强得多。

[0126] 稳定性分析方法：将化合物1、化合物2或化合物3各自的DMF溶液(100μL、100mM)与不同pH值(pH＝4.0、7.4和9.0)的PBS缓冲液(2mL、25mM)混合，得到的混合物在37℃孵育。在
0、1、2、4、8和24h的时间点，用高效液相色谱法测定溶液中化合物的含量。结果如图2所示，
在pH值为4.0、7.4和9.0时，三种化合物均无明显降解，说明本发明通过对5‑氨基基团的修
饰，使得化合物1、化合物2和化合物3在酸性、中性和碱性条件下表现出较高的稳定性。

[0127] 实验例2 细胞外GSH激活和GSH消耗

[0128] 细胞外GSH激活

[0129] 有效释放ALA是基于N‑修饰的ALA衍生物完成其药理活性的关键。本发明的化合物1‑3被设计成在GSH存在下释放ALA‑OMe，如图1中(a)所示，二硫键断裂后，通过分子内环化
过程生成ALA‑OMe。本实验首先在37℃的PBS(pH＝7.4)中研究了化合物1‑3对GSH的敏感性，
具体方法为：将GSH溶解在PBS中，得到10mM的GSH溶液，并将溶液的pH值调节到7.4，然后在
GSH溶液(1mL)中加入化合物1、化合物2或化合物3(5μL，100mM，用DMF溶液溶解)。混合物在
37℃下孵育。在每个时间点，用HPLC测定溶液中化合物的含量，结果如图3所示，结合图2可
知化合物1‑3在不含GSH的PBS(pH＝7.4)中非常稳定，而在图3中化合物1‑3在GSH存在下明
显被降解，表明化合物1‑3可以有效地被GSH切割。为了验证ALA‑OMe的产生，本实验用ESI‑
+
MS分析了GSH和化合物1‑3的反应混合物，并通过ESI‑MS检测到了与ALA‑OMe([M+H ]＝
146.15,m/z)相关的峰，结果如图4‑6所示，结果表明化合物1‑3可以在GSH存在下释放ALA‑
OMe。

[0130] 细胞外GSH消耗

[0131] 通过HPLC分析来研究GSH与化合物1‑3之间的反应是否能消耗GSH生成谷胱甘肽二硫(GSSG)，具体方法为：将GSH(终浓度5mM)分别与化合物1、化合物2或化合物3(终浓度1mM)
混合在PBS(pH＝7.4)中于37℃下孵育。在2min和60min的时间点，用HPLC对混合物进行分
析，结果如图7所示，可以明显地观察到GSSH的峰，结果表明GSH与化合物1、化合物2或化合
物3的反应可以同时释放ALA‑OMe并耗竭GSH。

[0132] 实验例3 PpIX的产生分析

[0133] 本实验通过BR阳性人宫颈癌细胞系(HeLa)对化合物1‑3、ALA和ALA‑OMe诱导PpIX的产生进行了研究，具体方法如下：

[0134] 细胞培养

[0135] 在含有5％CO2的湿润环境中，37°下，用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中培养HeLa细胞。

[0136] PpIX的产生分析

[0137] 将HeLa细胞(2×104个细胞/孔)铺到96孔板(3603，康宁)中，培养过夜。第二天，吸出培养基，用PBS洗涤。在细胞中加入不同浓度(10‑1000μM)的相应化合物(AlA，ALA‑OMe，化
合物1‑3)孵育4小时。然后，倒出培养基，用冷PBS洗涤细胞。用微板阅读器(λex＝405nm，λem
＝635nm)测定每孔中的PpIX荧光强度。

[0138] 结果如图8所示，化合物1‑3的PpIX生产效率随其亲脂性的增加而提高。其中化合物1和化合物2在低浓度下比其母体化合物(ALA‑OMe)具有更高的PpIX生产效率。在300μM的
浓度下，化合物1的PpIX荧光强度最高，而在此浓度下，ALA‑OMe仅观察到轻微的PpIX荧光。
化合物2诱导细胞内PpIX形成的最佳浓度为500μM，产生的荧光约为ALA‑OMe的1.5倍。然而，
与ALA‑OMe相比，化合物3不能有效地诱导PpIX产生。鉴于这三种化合物都可以被GSH有效地
切割(图3)，因此化合物3的低PpIX生产效率可能是由于其高亲水性。随着ALA衍生物亲脂性
的增加，其细胞穿透能力增强。因此，本实验可以合理地认为，化合物3的亲水性限制了其细
胞的穿透，导致细胞摄取率低。此外，化合物1和ALA在浓度从10‑300μM的范围里的表现出类
似的PpIX生产效率。而化合物1和2在高浓度下诱导PpIX产生能力的下降可归因于它们的细
胞毒性(图14)。化合物3由于其在PpIX形成中的效率较低没有进行下一步的研究。

[0139] 实验例4 双重肿瘤靶向性

[0140] 4.1本实验通过竞争性结合实验对化合物1和化合物2的BR靶向性能进行了评价。本实验采用500μM生物素，因为较高浓度的生物素能够产生明显的细胞毒性(图14)，具体方
法为：

[0141] 首先用游离生物素(终浓度500μM)与Hela细胞(总数20000个)在无FBS的DMEM培养基中预孵育1h以占据细胞表面的BR。然后将所得Hela细胞与化合物1(终浓度100μM)或化合
物2(终浓度300μM)在无FBS的DMEM培养基中共培养，4小时后，取出培养基，用冷PBS洗涤细
胞。同时设置对照组，即细胞未经生物素预处理，其他条件相同。然后用微板阅读器(λex＝
405nm，λem＝635nm)测定每孔中的PpIX荧光强度。

[0142] 结果如图9中(a)所示，生物素的加入明显降低了化合物1和化合物2的细胞内PpIX荧光，分别为42％和31％，结果表明，化合物1和化合物2的摄取途径是通过Br介导的内吞作
用。

[0143] 4.2本实验研究了细胞内GSH水平对化合物1和化合物2诱导的PpIX产生的影响。用马来酸二乙酯(DEM，终浓度1.0mM)处理HeLa细胞1h以耗竭细胞内GSH，具体为：在无FBS的
DMEM培养基中用DEM(终浓度1.0mM)预处理细胞(总数20000个)1h，然后去除培养基，用PBS
洗涤细胞。随后，将所得细胞与化合物1(终浓度100μM)或2(终浓度300μM)在无FBS的DMEM培
养基中孵育。4小时后，取出培养基，用冷PBS洗涤细胞。同时设置对照组，即细胞未经DEM预
处理，其他条件相同。然后用微板阅读器(λex＝405nm，λem＝635nm)测定每孔中的PpIX荧光
强度。

[0144] 结果如图9中(b)所示，在DEM处理的细胞中，PpIX荧光明显被抑制，化合物1和化合物2的荧光分别降低了57％和63％，证明化合物1和化合物2诱导的PpIX形成是由GSH激活
的。

[0145] 实验例5 荧光成像

[0146] 本实验通过活细胞内荧光成像直接观察细胞内的PpIX荧光。具体方法为：

[0147] 将HeLa细胞(3×105个细胞)置于1cm玻璃底培养皿中，孵育过夜。

[0148] 将所述HeLa细胞(3×105个细胞)与化合物1(终浓度100μM)或化合物2(终浓度300μM)在无FBS的DMEM培养基中孵育4h后，取出培养基，用PBS洗涤细胞，然后加入
Hoechst33342(终浓度2μg)孵育10min。细胞用PBS洗涤后，通过Olympus Xcellence进行观
察。

[0149] 在抑制试验中，将所述HeLa细胞(3×105个细胞)在加入化合物1和化合物2之前，5
先用生物素(终浓度500μM)预孵育1h。然后将细胞(3×10个细胞)与化合物1(终浓度100μ
M)或化合物2(终浓度300μM)在无FBS的DMEM培养基中共培养，4小时后，取出培养基，用PBS
洗涤细胞，然后加入Hoechst33342(终浓度2μg)孵育10min。细胞用PBS洗涤后，通过Olympus 
Xcellence进行观察。

[0150] 用DEM(终浓度1.0mM)对HeLa细胞(3×105个细胞)进行预处理1h，使细胞内GSH耗尽，然后将所得细胞与化合物1(终浓度100μM)或化合物2(终浓度300μM)在无FBS的DMEM培
养基中共培养，4小时后，取出培养基，用PBS洗涤细胞，然后加入Hoechst33342(2μg)孵育
10min。细胞用PBS洗涤后，通过Olympus Xcellence进行观察。

[0151] 结果如图10所示，在化合物1或2处理的HeLa细胞内检测到明亮的红色PpIX荧光，见图10中(a)和(b)顶部的图像。当用生物素(500μM)预处理HeLa细胞时，荧光明显减少，见
图10中(a)和(b)中部的图像，证实化合物1和化合物2的摄取途径是由BR介导的内吞作用。
与生物素相似，DEM(1.0mM)也降低了化合物1和化合物2的细胞内PpIX荧光，见图10中(a)底
部的图像，见图10中(b)底部的图像，表明化合物1和2诱导的PpIX产生是由细胞内GSH激活
的。这些结果表明，化合物1和2可以通过双重选择过程靶向肿瘤细胞。

[0152] 实验例6 暗毒性和光毒性

[0153] 本实验对化合物1和化合物2的光毒性进行了研究，并与ALA和ALA‑OMe的暗毒性和光毒性进行了比较。

[0154] 暗毒性和光毒性实验

[0155] 具体方法为：将HeLa细胞(2×104个细胞/孔)接种于96孔板中，培养过夜。用PBS洗涤细胞一次，然后在每孔中加入含有不同浓度(终浓度10‑1000μM)的(化合物1、化合物2、
ALA或ALA‑Ome)。孵育4h后，分别在光照和黑暗条件下培养：

[0156] 光照培养：用LED灯照射平板(λ＝405nm，光通量15mW/cm2，光剂量9J/cm2)，光照10min；

[0157] 黑暗培养：在黑暗条件下孵育10min。

[0158] 然后用含10％FBS的DMEM分别代替光照和黑暗条件下培养的原培养基，继续孵育24h，然后分别用DMSO代替每孔中的培养基，振摇10min。用微板阅读器记录490nm处的吸光
度。

[0159] 结果见下表1和图11、图14所示，在光照下，化合物1和化合物2对HeLa细胞产生明显的光毒性(图11)。表1给出了半抑制浓度(IC50)值，化合物1的IC50值为89.26±38.95μM，
比ALA和ALA‑OMe分别强2.5倍(P<0.05)和6.5倍(P<0.01)。化合物2和ALA的IC50值相似，但
与其母体化合物(ALA‑OMe)相比具有更强的光毒性。化合物1和化合物2的光毒性与其诱导
PpIX产生的效率是一致的。一般来说，ALA及其衍生物的光毒性在很大程度上取决于它们的
PpIX生产效率。尽管化合物1与AlA在10～300μM范围内PpIX的生成效率相似，但化合物1却
具有更强的光毒性。此外，化合物2的IC50值与ALA的IC50值相当，尽管在IC50浓度(～220μ
M)下，ALA的PpIX生成效率要高得多。本实验认为化合物1和化合物2的光毒性增强可能来自
于它们的GSH耗竭能力。

[0160] 表1.AlA、AlA‑OMe、化合物1和2在有光和无光条件下对HeLa细胞的IC50值。

[0161]

[0162] 实验例7 细胞内GSH耗竭实验

[0163] 为了证实化合物1和化合物2对细胞内GSH耗竭的影响，本实验研究了在化合物1和6
化合物2(终浓度300μM)存在下细胞的GSH水平。具体方法为：将HeLa细胞(1×10个细胞)接
种于6cm细胞培养皿中，培养过夜。用PBS洗涤细胞，加入化合物1或化合物2(终浓度300μM)
孵育4h。孵育后，用PBS洗涤并收集细胞。然后用冻融法裂解细胞，离心收集上清液。用GSH和
GSSG检测试剂盒测定上清液的GSH水平。同时设置对照组，对照组不加入化合物1和化合物
2，用工作液替换。

[0164] 结果如图12所示，在经化合物1和2处理后细胞的GSH水平分别为33.3±7.3％和46.8±6.6％，表明GSH和二硫键的反应不仅激活药物，而且消耗细胞内GSH。

[0165] 实验例8 体外成像

[0166] 为了研究化合物1和2在活体动物中的肿瘤选择性，本实验对化合物1和化合物2诱导HeLa荷瘤小鼠中的PpIX产生能力进行了研究。

[0167] 具体方法为：为了建立荷瘤模型，将含有HeLa细胞(1×107个细胞)的PBS溶液(150μL)皮下注射到裸鼠的右上肢。当肿瘤直径达到0.8cm左右时，将小鼠分为两组(每组3只)进
行试验。第1组小鼠经尾静脉注射ALA‑OMe(20μmol/kg，150μL)。第2组小鼠经尾静脉注射化
合物2(20μmol/kg，150μL)。4h后处死小鼠，收集肿瘤组织。收集的肿瘤被冷冻并切片成16μm
的切片。最后，用Olympus Xcellence观察肿瘤切片的PpIX荧光。

[0168] 结果如图13所示，本实验用荧光显微镜监测肿瘤切片的PpIX荧光。经化合物2处理的小鼠肿瘤切片的荧光强度远高于其母体化合物(AlA‑OMe)处理的小鼠，表明化合物2对BR
阳性肿瘤组织的特异性更高。但是，化合物1由于其高亲脂性而未能在体内应用。本实验认
为化合物1可能适合局部治疗。

[0169] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或
变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或
变动仍处于本发明创造的保护范围之中。