落叶松原生质体分离纯化及瞬时表达方法

摘要

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及落叶松原生质体分离纯化及瞬时表达系统构建的方法。本发明要解决的技术问题是至今为止尚未见到适用于落叶松的原生质体制备的方法。本发明的技术方案是落叶松原生质体分离纯化的方法，包括如下步骤：a、酶解；b、收集；在此基础上，本发明还提供了落叶松瞬时表达系统构建的方法。本申请建立了一套适用于落叶松的原生质体制备方法，可实现高效率的落叶松原生质体瞬时转化。

权利要求

1.落叶松原生质体分离纯化的方法，其特征在于：包括如下步骤：

a、酶解：取落叶松胚性愈伤组织材料转移至酶解液中，24～26℃的黑暗环境下30～50转/分钟酶解，酶解时间4～6h；所述的酶解液含浓度为0.4～0.6M的甘露醇；所述的酶为纤维素酶和离析酶，纤维素酶的质量浓度为1.5～3％，离析酶的质量浓度为0.4～0.8％，愈伤组织与酶解液比例为0.1～1g/10mL；

b、收集：加入洗涤缓冲液终止酶解反应，0.7μm尼龙膜过滤，分两次过滤，收集滤液；将滤液离心，弃上清液，加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液用量为原酶液的0.5～1倍，重悬沉淀，离心，弃上清液；再重复一次，沉淀即为原生质体；所述的离心力60×g，离心时间2min。

2.如权利要求1所述的落叶松原生质体分离纯化的方法，其特征在于：步骤a中所述的酶解时间为6h。

3.如权利要求1或2所述的落叶松原生质体分离纯化的方法，其特征在于：步骤a中所述酶解液中甘露醇的浓度为0.4M。

4.如权利要求1～3任一项所述的落叶松原生质体分离纯化的方法，其特征在于：步骤a中所述纤维素酶和离析酶的质量浓度分别为2.25～3％和0.6～0.8％。

5.如权利要求1～3任一项所述的落叶松原生质体分离纯化的方法，其特征在于：步骤a中所述纤维素酶和离析酶的质量浓度分别为3％和0.8％。

6.如权利要求1～3任一项所述的落叶松原生质体分离纯化的方法，其特征在于：步骤a中愈伤组织与酶解液比例为0.4～1g/10mL。

7.落叶松瞬时表达系统构建的方法，包括权利要求1～6任一项所述的步骤a和b，其特征在于：还包括步骤c、转化：将收集的原生质体，加入终止液重悬，置于冰浴中重力沉淀5

30min，弃去上清液；用甘露醇缓冲液重悬原生质体细胞，使其最终浓度为2×10个/mL，将含有目标基因的质粒与原生质体细胞混合；质粒与原生质体的用量关系为20～30μg质粒加5

入到100～200μL浓度为2×10个/mL的原生质体细胞中；加入PEG4000溶液，在黑暗中静置反应30分钟；加入终止液来终止反应；离心，收集沉淀，终止液重悬，在25℃下避光孵育24～

48小时；所述的离心力为60×g，离心时间是2min；其中，加入PEG4000溶液后，PEG4000溶液的质量终浓度为15～25％。

8.如权利要求7所述的落叶松瞬时表达系统构建的方法，其特征在于：步骤c中所述的PEG4000溶液的质量终浓度为20％。

说明书

落叶松原生质体分离纯化及瞬时表达方法

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及落叶松原生质体分离纯化及瞬时表达系统构建的方法。

背景技术

[0002] 落叶松(Larix gmelinii(Rupr.)Kuzen.)是一种落木乔木，具有早期速生、抗逆性强、抗病优良、生态效益好的特点，在我国北方地区是一种十分重要的造林树种，被广泛应用于搭建防护林及退耕还林工程。由于林木生长是一个周期极长的过程，因此前期人们围绕落叶松的研究主要还是集中在遗传变异研究、种源选择、木质性状、种子园建立、光合特征研究等方面上，再加上落叶松无性繁殖技术极为困难等等，很大程度上制约了它的遗传性状改良进程。

[0003] 随着生物技术尤其是现代分子生物学技术的发展，如转基因技术及基因组编辑技术的出现，给落叶松遗传性状改良带来了新的机遇和挑战。转基因技术即是将预先设计好的拥有完整表达单元的外源DNA通过生物技术手段导入受体细胞内并整合于受体基因组上，使外源基因得以在受体内稳定表达并且还具备代代遗传能力的技术。但是落叶松稳定遗传转化体系较难构建，农杆菌介导的植物稳定遗传转化法于落叶松中应用操作复杂、转化效率低，即便转化成功，树木生长还是周期极长的过程，至今为止对转基因落叶松的外源基因功能验证及田间释放的工作鲜有报道。这极大的限制了落叶松基因功能鉴定的基础研究以及相关应用推广的实施。因此，迫切的需要开发一套适合落叶松的快速外源DNA转化、检测的瞬时表达系统用于其基因功能鉴定和基因工程应用。

[0004] 基因瞬时表达是指在短时间内将外源基因导入受体细胞后，在外源基因和受体细胞的染色体DNA不发生整合的情况下，使外源基因获得短暂却高水平的表达的技术。基因瞬时转化系统实验周期短、操作便捷，弥补了传统遗传转化方式中实验周期长、操作繁琐、转化效率低的缺点。

[0005] 原生质体作为一种人为形成的已经去除掉细胞壁的细胞，能够用来摄取外源DNA，是经过转化后进行基因瞬时表达检测的良好受体材料。虽然原生质体瞬时转化技术经过数十年发展已经十分成熟，成功于多种植物如拟南芥、黄瓜、葡萄、胡萝卜及樱桃中实现，但至今为止尚未见到适用于落叶松的原生质体转化基因瞬时表达方法。

发明内容

[0006] 本发明要解决的技术问题是至今为止尚未见到适用于落叶松的原生质体制备的方法。

[0007] 本发明的技术方案是落叶松原生质体分离纯化的方法，包括如下步骤：

[0008] a、酶解：取落叶松胚性愈伤组织材料转移至酶解液中，24～26℃的黑暗环境下30～50转/分钟酶解，酶解时间1～6h；所述的酶解液中含浓度为0.2～0.8M的甘露醇；所述的酶为纤维素酶和离析酶，纤维素酶的质量浓度为1.5～3％，离析酶的质量浓度为0.4～0.8％，愈伤组织与酶解液比例为0.1～1g/10mL；

[0009] b、收集：加入洗涤缓冲液终止酶解反应，0.7μm尼龙膜过滤，分两次过滤，收集滤液；将滤液离心，弃上清液，加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液用量为原酶液的0.5～1倍，重悬沉淀，离心，弃上清液；再重复一次，沉淀即为原生质体；所述的离心力≤90×g，离心时间2min。

[0010] 其中，步骤a中所述的酶解时间为4～6h。

[0011] 优选的，步骤a中所述的酶解时间为6h。

[0012] 其中，步骤a中所述酶解液中甘露醇的浓度为0.4～0.6M。

[0013] 优选的，步骤a中所述酶解液中甘露醇的浓度为0.4M。

[0014] 其中，步骤a中所述纤维素酶和离析酶的质量浓度分别为2.25～3％和0.6～0.8％。

[0015] 优选的，步骤a中所述纤维素酶和离析酶的质量浓度分别为3％和0.8％。

[0016] 优选的，步骤a中愈伤组织与酶解液比例为0.4～1g/10mL。

[0017] 其中，步骤b中所述的离心力为60～90×g。

[0018] 优选的，步骤b中所述的离心力为60×g。

[0019] 本发明还提供了落叶松瞬时表达系统构建的方法，包括如下步骤：

[0020] a、酶解：取落叶松胚性愈伤组织材料转移至酶解液中，25℃的黑暗环境下30～50转/分钟酶解，酶解时间1～6h；所述的酶解液中甘露醇的浓度为0.2～0.8M；所述的酶为纤维素酶和离析酶，纤维素酶的质量浓度为1.5～3％，离析酶的质量浓度为0.4～0.8％，愈伤组织与酶解液比例为0.1～1g/10mL；

[0021] b、收集：加入洗涤缓冲液终止酶解反应，0.7μm尼龙膜过滤，分两次过滤，收集滤液；将滤液离心，弃上清液，加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液用量为原酶液的0.5～1倍，重悬沉淀，离心，弃上清液；再重复一次，沉淀即为原生质体；所述的离心力≤90×g，离心时间2min；

[0022] c、转化：将收集的原生质体，加入终止液重悬，置于冰浴中重力沉淀30min，弃去上5
清液；甘露醇缓冲液重悬原生质体细胞，使其最终浓度为2×10个/mL，将含有目标基因的质粒与原生质体细胞混合；加入PEG4000溶液，在黑暗中静置反应30分钟；加入终止液来终止反应；离心，收集沉淀，终止液重悬，在25℃下避光孵育24～48小时；所述的离心力为≤90×g，离心2min；其中，加入PEG4000溶液后，PEG4000的质量终浓度为10～25％。

[0023] 其中，步骤a中所述的酶解时间为4～6h。

[0024] 优选的，步骤a中所述的酶解时间为6h。

[0025] 其中，步骤a中所述酶解液中甘露醇的浓度为0.4～0.6M。

[0026] 优选的，步骤a中所述酶解液中甘露醇的浓度为0.4M。

[0027] 其中，步骤a中所述纤维素酶和离析酶的质量浓度分别为2.25～3％和0.6～0.8％。

[0028] 优选的，步骤a中所述纤维素酶和离析酶的质量浓度分别为3％和0.8％。

[0029] 优选的，步骤a中愈伤组织与酶解液比例为0.4～1g/10mL。

[0030] 其中，步骤b和c中所述的离心力为60～90×g。

[0031] 优选的，步骤b和c中所述的离心力为60×g。

[0032] 其中，步骤c中所述的PEG4000溶液最终质量浓度为15～25％。

[0033] 优选的，步骤c中所述的PEG4000溶液最终质量浓度为20％。

[0034] 在加入质粒、PEG4000溶液与原生质体细胞混合的过程中，应注意动作要轻，以免造成原生质体细胞的受损。上下翻转，保证PEG4000溶液与原生质体细胞及质粒混合均匀。

[0035] 本发明为建立及探索最佳的落叶松原生质体瞬时转化体系，设置了以下多个不同的实验条件，包括：落叶松材料于酶解液中酶解的时间、酶解液中甘露醇的浓度、不同的纤维素酶果胶酶浓度配比、不同的PEG4000介导浓度以及不同的离心速度，来分别探讨不同条件对落叶松的原生质体产量及原生质体活性或原生质体转化效率的影响，以建立一套适用于落叶松的原生质体制备方法，实现高效率的落叶松原生质体瞬时转化。

[0036] 本发明的有益效果：本申请探讨了不同制备方法对落叶松的原生质体产量及原生质体活性或原生质体转化效率的影响，建立了一套适用于落叶松的原生质体制备方法，可实现高效率(40％)的落叶松原生质体瞬时转化。本申请的基因瞬时转化系统实验周期短、操作便捷，弥补了传统遗传转化方式中实验周期长、操作繁琐、转化效率低的缺点。本申请公开的技术方案，填补了落叶松原生质体瞬时转化技术上空白，将会极大的促进落叶松内源基因功能的研究进展及落叶松遗传性状定向改良的进展。

附图说明

[0037] 图1酶解时间的不同对落叶松原生质体产量及原生质体活性的影响。(a)原生质体密度随酶解时间变化示意图；(b)原生质体活性随酶解时间变化示意图。

[0038] 图2酶解液中甘露醇浓度的不同对落叶松原生质体产量及原生质体活性的影响。(a)原生质体密度随甘露醇浓度变化示意图；(b)原生质体活性随甘露醇浓度变化示意图。

[0039] 图3酶解液中酶浓度配比的不同对落叶松原生质体产量及原生质体活性的影响。(a)原生质体密度随酶浓度配比变化示意图；(b)原生质体活性随酶浓度配比变化示意图。

[0040] 图4PEG4000终浓度的不同对落叶松原生质体瞬时转化效率的影响。

[0041] 图5 90×g的离心力收集制备原生质体细胞时落叶松细胞的状态。(a)酶解液中的原生质体细胞经滤膜过滤后；(b)90×g离心收集滤膜过滤后的原生质体细胞经10mL W5重悬后；(c)再次90×g离心收集原生质体细胞经5mL W5重悬后；(d)90×g离心收集原生质体细胞后残留于上清液中的细胞。

[0042] 图6静置沉降不离心收集制备原生质体细胞时落叶松细胞的状态。(a)酶解液中的原生质体细胞经滤膜过滤后；(b)静置沉降收集滤膜过滤后的原生质体细胞经10mL W5重悬后；(c)再次静置沉降收集原生质体细胞经5mL W5重悬后；(d)静置沉降收集原生质体细胞后残留于上清液中的细胞。

[0043] 图7 60×g的离心力收集制备原生质体细胞时落叶松细胞的状态。(a)酶解液中的原生质体细胞经滤膜过滤后；(b)60×g离心收集滤膜过滤后的原生质体细胞经10mL W5重悬后；(c)再次60×g离心收集原生质体细胞经5mL W5重悬后；(d)60×g离心收集原生质体细胞后残留于上清液中的细胞。

[0044] 图8落叶松原生质体细胞于光学显微镜下观察时的状态。(a)落叶松愈伤组织经酶解6h后分离出的原生质体细胞状态；(b)落叶松原生质体瞬时转化完成后的细胞状态。

[0045] 图9落叶松原生质体瞬时转化完成48h后荧光显微镜下观察统计细胞活性及转化效率。(a)明场，物镜10×；(b)加入二乙酸荧光素后落叶松原生质体细胞发出的绿色荧光；(c)明场，物镜20×；(d)落叶松原生质体瞬时转化后细胞发出的绿色荧光。

具体实施方式

[0046] 下述实施例中，落叶松胚性愈伤组织的诱导的方法如下:

[0047] 落叶松胚性愈伤组织的诱导分为种子消毒、种子接种、愈伤诱导三步，诱导出的胚性愈伤组织可为研究落叶松原生质体瞬时转化体系提供丰富的材料。

[0048] a)诱导愈伤实验前提前一天流水过夜冲洗落叶松种子(日本落叶松(Larix kaempferi(Lamb.)Carr)中国林科院林业研究所提供)；

[0049] b)在超净工作台内将已流水过夜冲洗的种子分装到50mL离心管中，用75％的酒精震荡消毒1min；

[0050] c)加入30mL 30％H2O2溶液，并滴入2～3滴吐温，震荡消毒15min；

[0051] d)弃去液体，再次加入30mL 30％H2O2溶液，震荡消毒15min；

[0052] e)弃去液体，无菌水冲洗6～8次洗净H2O2溶液；

[0053] f)将落叶松种子夹于滤纸上晾干后用已经消毒的解剖刀将种子纵切，并把胚乳一起接于落叶松愈伤培养基上；

[0054] g)每个培养基中接种15～18个纵切后的落叶松种子，25±1℃暗培养14天后备用。

[0055] 所用的落叶松愈伤诱导培养基为MS基础培养基，添加1mg/L6‑BA+0.1mg/L NAA，调pH 5.8。

[0056] 下述实施例中，落叶松原生质体细胞计数及活性检测方法如下:

[0057] 落叶松原生质体细胞的数量计数采用血球计数板于显微镜下观察统计。血球计数板是进行细胞数或微生物计数常用的工具。25×16型血球计数板计数公式为：

[0058] 细胞或微生物密度(个/mL)＝5个中方格细胞总数÷5×25×104×稀释倍数。

[0059] 取5μL未经稀释的落叶松原生质体细胞悬浮液滴入25×16型血球计数板中央计数格，完全浸满后盖上盖玻片于倒置显微镜下计数。由于落叶松原生质体细胞较大且数量不多，因此统计计数时将25个中方格内包含的全部原生质体细胞都计算在内，计数操作重复六次取平均值。最终落叶松原生质体细胞计数公式为：

[0060] 原生质体密度(个/mL)＝25个中方格内落叶松原生质体细胞总数平均数×104。

[0061] 落叶松原生质体细胞的活性检测采用二乙酸荧光素(北京索莱宝科技有限公司购买)(Fluorescein diacetate,FDA)法进行观察鉴定。FDA是一种活细胞染剂，可以自由穿过细胞膜在活细胞体内积累，在激发光激发下可以发出黄绿色荧光，而死细胞则无法发出荧光。FDA进行落叶松原生质体细胞活性检测具体操作为：向100μL落叶松原生质体细胞悬浮液中添加2.4μL浓度为5mg/mL的FDA‑丙酮溶液，于室温中避光静置5‑10min，后置于荧光倒置显微镜下观察，有活性的原生质体将发出荧光。观测多个视野统计原生质体活性取平均值。落叶松原生质体细胞活力检测计算公式为：

[0062] 落叶松原生质体细胞活性/瞬时转化效率＝(视野内发绿色荧光的原生质体细胞总数÷视野内原生质体细胞总数)×100％。

[0063] 下述实施例中使用的洗涤缓冲液为W5缓冲液(W5 Buffer)，具体配方如下：2mM MES(pH 5.7)、154mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl。参考文献：Yoo,S.,Cho,Y.&Sheen,J.Arabidopsis mesophyll protoplasts:a versatile cell system for transient gene expression analysis.Nat Protoc 2,1565–1572(2007)。

[0064] 下述实施例中使用的甘露醇缓冲液(MMG Buffer)，具体配方如下：0.4M甘露醇、15mM MgCl2和4mM MES，pH5.7。

[0065] 实施例1酶解时间对原生质体产量及原生质体活性的影响

[0066] 为了探索落叶松原生质体制备过程中，因材料于酶解液中因为酶解时间长短的不同从而可能对落叶松原生质体的产量以及原生质体的活性造成的不同影响，依次设置了酶解时间为1h、2h、4h、6h的四个时间梯度而保持其他实验条件不变。

[0067] 具体操作为：取落叶松愈伤组织材料1g加入10mL酶解溶液中，分别于1h、2h、4h、6h从酶解液中取出150μL，用来进行落叶松原生质体细胞计数及活性检测。共进行三次平行实验统计三次。取落叶松愈伤组织1g加入10mL酶解液中，在25℃的黑暗环境下30转/分钟进行酶解。分别在1h、2h、4h、6h时，从酶解溶液中取出150μL，分装成两管，编号1‑A、1‑B、2‑A、2‑B、4‑A、4‑B、6‑A、6‑B。编号A组用来在血球计数板下计算原生质体密度。编号B组用FDA检测TM原生质体活性。所用到纤维素酶为Cellulase R10(CELLUASE ONOZUKA  R‑10，为日本Yakult Pharmaceutical Industry Co.,Ltd公司产品)，离析酶为Macerozyme R10TM
(MACEROZYE  R‑10，为日本Yakult Pharmaceutical Industry Co.,Ltd公司产品)。所使用酶解溶液的浓度为1.5％的纤维素酶Cellulase R10和0.4％的离析酶Macerozyme R10。

[0068] 根据实验结果如图1所示，可以发现：落叶松原生质体细胞的密度随酶解时间增加而明显增加，而原生质体细胞的活性在1～6h均保持在80～90％之间。当酶解时间为6h时，落叶松原生质体细胞仍保持了较高的活性，未受到酶解时间影响。因此确定，落叶松原生质体细胞分离制备的最佳酶解时间为6h。

[0069] 实施例2酶解液甘露醇浓度对原生质体产量及原生质体活性的影响

[0070] 酶解液中的甘露醇负责调节原生质体细胞内外的渗透压，考虑到原生质体细胞易受到渗透压影响产生破裂而导致产量及活性出现变化，因此本研究针对酶解液中的甘露醇浓度依次设置了0.2M、0.4M、0.6M、0.8M共四个浓度梯度而保持其他实验条件保不变，以研究酶解液中甘露醇浓度对原生质体产量及原生质体活性的影响。

[0071] 具体操作为取落叶松愈伤组织0.2g分别加入到5mL甘露醇(Sigma‑Aldrich公司购买)浓度分别为0.2M、0.4M、0.6M、0.8M的酶解溶液中酶解6h后，所使用酶解溶液的浓度为1.5％的纤维素酶Cellulase R10和0.4％的离析酶Macerozyme R10。从酶解液中取出150μL，用来进行落叶松原生质体细胞计数及活性检测。共进行三次平行实验统计三次。取落叶松愈伤组织0.2g分别加入5mL甘露醇浓度分别为0.2M 0.4M 0.6M 0.8M的酶解溶液中，编号
0.2 0.40.6 0.8，在25℃的黑暗环境下40转/分钟进行酶解。在6h后向酶液中加入
5mLW5Buffer终止反应，酶液滤膜过滤后分别从各组中取出150ul，分装成两管，编号0.2‑A、
0.2‑B、0.4‑A、0.4‑B、0.6‑A、0.6‑B、0.8‑A、0.8‑B。编号A组用来在血球计数板下计算原生质体密度。编号B组用FDA检测原生质体活性。

[0072] 根据实验结果如图2所示，可以发现：落叶松原生质体细胞密度在酶解液中甘露醇浓度为0.4M时达到最高，同时原生质体细胞也在甘露醇浓度为0.4M时，较其他浓度保持了相对最高的细胞活性。因此确定，在进行落叶松原生质体细胞分离制备时，酶解液中最佳甘露醇浓度为0.4M。

[0073] 实施例3不同酶浓度配比对原生质体产量及原生质体活性的影响

[0074] 纤维素酶与离析酶是从落叶松愈伤组织中分离原生质体细胞最为关键的两个酶，其含量及配比不同可能会对原生质体产量及活性产生影响。因此为探究酶解液中不同的纤维素酶或离析酶质量浓度配比对原生质体产量及原生质体活性的影响，设置了三个酶浓度配比梯度进行实验。

[0075] 具体操作为：取落叶松愈伤组织0.2g分别加入5mL Cellulase R10和Macerozyme R10的混合溶液中，两种酶的质量浓度组合分别为1.5％+0.4％、2.25％+0.6％、3％+0.8％，编号1.5、2.25、3，在25℃的黑暗环境下50转/分钟进行酶解。在6h后向酶液中加入5mLW5Buffer终止反应，酶液滤膜过滤后分别从各组中取出150μL，分装成两管，编号1.5‑A、
1.5‑B、2.25‑A、2.25‑B、3‑A、3‑B。编号A组用来在血球计数板下计算原生质体密度。编号B组用FDA检测原生质体活性。共进行三次平行实验统计三次。

[0076] 根据实验结果如图3所示，可以看出：落叶松原生质体细胞密度随酶解液中酶液配比含量增加而小幅提高，活性基本一致。研究发现使用1.5％、0.4％的酶液配比制备得到的原生质体细胞数量已能达到实验要求，因此出于经济考虑，后续实验酶解液中所用的Cellulase R‑10与Macerozyme R‑10浓度配比分别为1.5％、0.4％。

[0077] 实施例4不同PEG4000介导浓度对原生质体转化效率的影响

[0078] PEG4000介导外源DNA进入原生质体细胞时，其终浓度合适与否可以显著影响转化效率。为探究不同的PEG4000介导浓度对落叶松原生质体瞬时转化效率的影响，设置了PEG4000(Sigma‑Aldrich公司购买)介导质量终浓度分别为5％、10％、15％、20％、25％的五个不同梯度转化实验而保持其他实验条件不变。原生质体瞬时转化完成48h后，通过荧光显微镜镜检观察GFP荧光表达情况，以确定不同的PEG4000介导浓度对落叶松原生质体转化效率的影响。共进行三次平行实验统计三次。取落叶松愈伤组织1g加入10mL Cellulase R10、Macerozyme R10浓度分别为1.5％、0.4％，甘露醇浓度为0.4M的酶解溶液中，在25℃的黑暗环境下30转/分钟进行酶解。在6h后向酶液中加入10mLW5Buffer终止反应，酶液滤膜过滤后60×g离心收集原生质体。加入230μL终浓度分别为5％、10％、15％、20％、25％的PEG4000介导转化，编号5A、10A、15A、20A、25A。48h后荧光显微镜下统计原生质体转化效率。

[0079] 根据实验结果如图4所示，可以发现：当PEG 4000介导终浓度在5％、10％时，原生质体瞬时转化效率为0或极低；当PEG 4000介导终浓度为15％时，原生质体瞬时转化效率为18％；当PEG 4000介导终浓度在25％时，转化效率接近30％；而当PEG 4000介导终浓度为
20％时，原生质体转化效率最高，达到40％。因此确定，PEG 4000介导落叶松原生质体瞬时转化的最佳浓度为20％。

[0080] 实施例5不同离心速度对原生质体产量及原生质体活性的影响

[0081] 原生质体细胞在制备过程中比较脆弱，易受外力及离心力干扰破裂从而影响到最终收集到的原生质体细胞数量及质量，因此制备过程中离心转速是否合适也是能否高效分离得到落叶松原生质体细胞的重要因素。基于此，设置了离心力为90×g、60×g及静置沉降不离心三个不同梯度的实验而保持其他实验条件不变，来确定制备落叶松原生质体细胞时最合适的离心转速。具体操作如下：酶解液中的原生质体滤膜过滤，90×g、60×g及静置沉降不离心收集酶液中原生质体，10mL W5重悬，再次90×g、60×g及静置沉降不离心收集原生质体，5mL W5Buffer重悬，90×g、60×g及静置沉降不离心收集酶液中原生质体后的上清液。

[0082] 实验结果发现，当使用90×g的离心力收集制备原生质体细胞时，虽然残留在上清液里而浪费掉的原生质体细胞比较少，但沉淀中收集到的原生质体细胞整体质量较差，如图5所示，考虑是由于离心力过高导致细胞最终发生变形、破裂。

[0083] 当全程不离心而采用静置沉降收集原生质体细胞时，镜检发现收集到的原生质体细胞整体质量要好于90×g离心时收集得到的原生质体细胞，但同时也发现上清液中残留而浪费掉的细胞较多，进而影响到了最终收集得到的落叶松原生质体细胞数量，如图6所示。

[0084] 当使用60×g的离心力收集制备落叶松原生质体细胞时，镜检发现上清液中残留的原生质体细胞数量与90×g离心时，残留的原生质体细胞数量几无差别，同时沉淀中收集到的原生质体细胞质量要明显好于90×g离心时收集得到的落叶松原生质体细胞，且不亚于静置沉降时收集到的原生质体细胞质量，如图7所示，因此确定，收集制备落叶松原生质体细胞时，采用60×g的离心转速。

[0085] 实施例6落叶松原生质体瞬时转化体系

[0086] 经过以上一系列落叶松原生质体瞬时转化条件探索后，本研究建立了一套适用于落叶松的原生质体瞬时转化体系，具体方法如下：

[0087] a)取经由落叶松种子黑暗诱导15天后形成的落叶松胚性愈伤组织材料转移至酶解液(1g/10mL)中，25℃的黑暗环境下30转/分钟酶解6h；

[0088] b)酶解完成后向酶解液中加入10mL的W5Buffer轻轻混合终止反应，尼龙膜(0.7μm)过滤；

[0089] c)再加入10mL W5Buffer，尼龙膜再次过滤后将液体转移至50mL离心管中；

[0090] d)60×g离心2min，弃去上清液；

[0091] e)10mL W5Buffer轻轻重悬沉淀中的原生质体细胞；

[0092] d)再次60×g离心2min后，弃去上清液，并将原生质体细胞用5mL W5Buffer再次重悬，吸取100μL准备用于血球计数板计数；

[0093] e)将分离出的原生质体细胞置于冰浴中重力沉淀30min，弃去上清液；

[0094] f)根据计数结果，用一定量的甘露醇缓冲液(MMG Buffer)重悬原生质体细胞，使5
其最终浓度为2×10个/mL。

[0095] g)将20μg带有绿色荧光报告基因的质粒DNA(总体积30μL，体积若不足30μL用MMG Buffer补足)和200μL原生质体细胞轻轻混合；所用的质粒为pGEL055，为玉米泛素启动子驱动GFP表达(ZmUbi‑GFP)，详细信息见参考文献：Ren Q,Zhong  Z,Wang Y,et al.Bidirectional Promoter‑Based CRISPR‑Cas9Systems for Plant Genome 
Editing.Front Plant Sci.2019；10:1173.doi:10.3389/fpls.2019.01173；

[0096] h)加入230μL 40％的PEG4000溶液(终浓度为20％)与原生质体细胞轻轻混合，在黑暗中静置反应30分钟后加入600μL W5Buffer来终止反应；

[0097] i)再次60×g离心2min，弃去上清液后将原生质体轻轻地重悬于W5溶液中；

[0098] j)将原生质体细胞在25℃下避光孵育24～8小时；

[0099] k)荧光显微镜下借助二乙酸荧光素检测细胞活性、并统计计算落叶松原生质体瞬时转化效率。

[0100] 经由此方法可以分离收集到细胞状态优良的落叶松原生质体细胞用于原生质体转化基因瞬时表达实验。于光学显微镜下观察到的落叶松愈伤组织材料在酶解液中酶解6h后分离出的原生质体细胞状态以及刚完成落叶松原生质体瞬时转化后的细胞状态如图8所示。

[0101] 黑暗培养48h后，通过荧光倒置显微镜观察落叶松原生质体细胞，如图9所示，发现有近90％的细胞仍保持有细胞活性，且原生质体瞬时转化效率最高可以达到40％。以上实验结果证明本研究首次实现了于落叶松细胞中进行的原生质体瞬时转化。

[0102] 本发明为建立及探索最佳的落叶松原生质体瞬时转化体系，首先对原生质体的获得过程进行了优化，设置了以下多个不同的实验条件，包括：落叶松材料于酶解液中酶解的时间、酶解液中甘露醇的浓度、不同的纤维素酶果胶酶浓度配比以及不同的离心速度，来分别探讨不同条件对落叶松的原生质体产量及原生质体活性的影响。经过试验确定：选用质量浓度分别为1.5％、0.4％的Cellulase R‑10与Macerozyme R‑10，且酶解液中甘露醇浓度为0.4M时，酶解6h，收集细胞过程中离心力控制在60×g，可在最经济的条件下获得产量及质量最好的原生质体。在此基础上，进一步探讨了不同的PEG4000介导浓度对落叶松原生质体转化效率的影响。通过实验确定了最佳的PEG4000质量终浓度为20％。最终，本发明通过一系列的优化实验，建立了一套适用于落叶松的原生质体制备方法，并实现了高效率的落叶松原生质体瞬时转化。