水痘-带状疱疹病毒gE蛋白突变体及其表达方法

摘要

本发明涉及水痘‑带状疱疹病毒gE蛋白突变体及其表达方法。具体地，本发明公开了一种具有免疫原性的蛋白及其编码基因。本发明还公开了所述具有免疫原性的蛋白的制备方法。

权利要求

1.一种野生型水痘‑带状疱疹病毒gE蛋白的突变体，其特征在于，所述突变体相较野生型水痘‑带状疱疹病毒gE蛋白中的成熟抗原序列，在成熟抗原序列的第141位由亮氨酸突变为甲硫氨酸；所述突变体的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。

2.一种gE基因，其特征在于，其编码权利要求1所述的水痘‑带状疱疹病毒gE蛋白的突变体，所述gE基因能够在CHO细胞中表达水痘‑带状疱疹病毒gE蛋白的突变体。

3.如权利要求2所述的gE基因，其特征在于，所述gE基因的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。

4.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体中含有权利要求2或3所述的gE基因的核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体为携带杀稻瘟菌素抗性基因的质粒表达载体和/或携带博莱霉素抗性基因的质粒表达载体。

6.一种基因工程化的细胞，其特征在于，所述的细胞含有权利要求4或5所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求2或3所述的gE基因。

7.如权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述的细胞是CHO细胞。

8.一种具有免疫原性的蛋白，其特征在于，所述的蛋白为VZV病毒的gE蛋白，所述gE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述的gE蛋白是由CHO细胞表达的。

9.如权利要求8所述的具有免疫原性的蛋白，其特征在于，所述的具有免疫原性的蛋白通过以下方法制备获得:

(1)培养如权利要求6或7所述的基因工程化的细胞，从而在细胞内表达所述的VZV病毒的gE蛋白；

(2)分离所述的VZV病毒的gE蛋白。

10.一种制备权利要求8所述的具有免疫原性的蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括:

(1)培养如权利要求6所述的基因工程化的细胞，从而在细胞内表达所述的VZV病毒的gE蛋白；

(2)分离所述的VZV病毒的gE蛋白。

11.一种在CHO细胞中表达VZV病毒的gE蛋白的方法，包括下述步骤：(1)将权利要求2或

3所述的gE基因克隆入表达载体中；

(2)将步骤(1)所得的表达载体转化至CHO细胞中；

(3)通过迷你细胞群的筛选和单克隆筛选，获得稳定表达gE蛋白的细胞株；

(4)使用步骤(3)所得的细胞株进行表达，获得VZV病毒的gE蛋白。

说明书

水痘‑带状疱疹病毒gE蛋白突变体及其表达方法

技术领域

[0001] 本发明涉及水痘‑带状疱疹病毒gE蛋白突变体及其表达方法。具体地，本发明公开了一种具有免疫原性的蛋白及其编码基因。本发明还公开了所述具有免疫原性的蛋白的制
备方法。

背景技术

[0002] 水痘带状疱疹病毒（varicella zoster virus，VZV）是八种人类疱疹病毒之一，即3型人疱疹病毒。水痘‑带状疱疹病毒全球流行，具有很强的传染性，迄今只发现一种血清
型，在自然界VZV仅感染人类。既可引发水痘，也可引发带状疱疹（herpes zoster，HZ），水痘
通常见于儿童期，带状疱疹则多见于成人。在原发感染水痘后，病毒可潜伏在宿主的神经节
中，随着年龄增长免疫功能减退、或出现免疫功能受损及免疫抑制，VZV可以被重新激活并
引发带状疱疹。带状疱疹临床表现为单侧性水泡样皮疹，明显的特征是仅局限于单一皮肤
节段，通常伴神经根性疼痛。患者可有明显疼痛和不适，症状可持续数周或数月，在重症患
者中甚至可持续数年，导致生活质量下降，极少数情况下带状疱疹也可无皮疹出现。约25%
带状疱疹患者会发生并发症，并且随着年龄的增长而增加。最常见的严重并发症是带状疱
疹后神经痛（post‑herpetic neuralgia, PHN ），即疱疹急性期后仍持续存在的疼痛，在带
状疱疹患者中发生率为10%‑30%，疼痛可持续数月甚至数年，严重影响患者生活质量。影响
带状疱疹发病的危险因素有年龄、免疫功能缺陷、性别以及其他潜在因素。

[0003] 大多数原发的VZV感染发生在童年，然后VZV潜伏在神经节中，成年后VZV可以再被激活。研究表明，约99%的40岁及以上的美国人有感染过VZV的血清学证据；90%的20‑29岁的
欧洲人抗VZV血清反应为阳性；在南美洲、澳大利亚和亚洲的一些国家，原发性VZV感染可能
会发生得晚一些，但90%的40岁以上人群会出现VZV血清阳性反应。因此在全球范围内，绝大
多数成年人都有发生带状疱疹及其相关并发症的危险。全球带状疱疹的发病率为（3 5）/
~
1000人年，亚太地区为(3 10)/1000人年，并逐年递增2.5％ 5.0％，住院率(2 25)/10万人
~ ~ ~
年，死亡率(0.017 0.465)/10万人年，复发率1％ 6%。目前我国属于高度老年化状态，HZ带
~ ~
来的社会经济负担也在逐年加重，对个体而言，HZ给患者尤其是老年患者生活质量带来了
巨大的负面影响。国家统计局公布的数据显示2017年40岁以上人口约6.5亿，若按照HZ发病
率为2.5/1000人年保守估计我国每年新发HZ约160万例。

[0004] 由于药物治疗只能缓解症状，接种疫苗是预防HZ及其并发症的最佳策略。目前全球仅有2款HZ疫苗上市销售（HZ减毒活疫苗Zostavax和HZ亚单位疫苗Shingrix）。默沙东的
Zostavax为减毒活疫苗，所用病毒株与水痘疫苗所用的VZV Oka株相同，该疫苗配方所采用
的最低效力为19400 PFU，于2006年获得FDA批准上市，迄今已在60多个国家获准上市，皮下
接种1剂用于50岁以上人群的HZ预防，但保护率约在60%。葛兰素史克开发的Shingrix是一
种基于重组gE蛋白辅以新型佐剂AS01B的亚单位疫苗，三期临床试验数据显示该亚单位疫
苗在老年人中有着优于Zostavax的免疫原性和有效性，并于2017年获FDA批准上市，适用于
50岁及以上人群，需接种2剂，但保护率超过90%。目前Shingrix在中国已获附条件批准上
市，但国内处于临床阶段的疫苗均为减毒活疫苗，其保护效力和免疫持久性会低于
Shingrix，而Shingrix因产能等问题全球缺货，因此国内急需一种自主研发的亚单位疫苗
用于减少由带状疱疹及其并发症引起的疾病负担。

[0005] 尽管现有技术中已经开发了一些针对VZV的重组亚单位疫苗，然而还存在着VZV gE蛋白表达效率低下，表达获得的蛋白活性低，免疫效果不理想等问题。因此，本领域还有
必要开发改进的VZV疫苗产品。

发明内容

[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种新的VZV gE蛋白突变体，作为预防带状疱疹的候选抗原。本发明要解决的另一问题是提供一种高效、经济的CHO细胞表达VZV gE蛋白突
变体的方法。

[0007] 本发明的第一方面，提供了一种VZV  gE蛋白突变体，该突变体不同于NCBI（National Center for Biotechnology Information）数据库中包括的VZV gE蛋白的氨基
酸序列。

[0008] 已有相当多的针对VZV gE蛋白的研究：野生型或全长gE蛋白一般为623个氨基酸。由包含信号肽的gE蛋白主要部分、疏水锚区域(残基546‑558)和C‑端尾巴组成 (例如可参
考文献Davison AJ, Scott J: The complete DNA sequence of varicella‑zoster 
virus. J Gen Virol 1986;67: 1759–1816)。不同研究对gE蛋白的蛋白分子结构区分略有
不同，有的研究者将蛋白分子分为亲水胞外区（包含信号肽）、疏水跨膜区（残基545‑561）和
胞内尾部（例如可参考Grose C. Glycoproteins encoded by varicella‑zoster virus :
biosynthesis, phosphorylation and intracellular trafficking. Annu Rev 
Microbil. 1990,44 :59‑80）。但是，本领域技术人员可以理解，上述不同的区分方式对gE
蛋白的应用及制备不产生实质的影响。典型的药物组合物中的蛋白质将不同于全长蛋白，
而是截短型蛋白。例如，在利用现代生物分子学技术制备重组VZV gE蛋白时，一般将去除
（截短）gE蛋白，使其缺少羧基端疏水锚区域（例如专利CN107106675A，EP0405867B）；或者称
为跨膜区（疏水区）和胞内区（例如专利CN102517302A）。同时，在利用宿主细胞内的翻译机
构表达突变体蛋白前体并转移至细胞膜分泌到细胞外时，信号肽区域通常会被信号肽酶切
断（例如专利CN102548578A，CN102711812B）。故而，典型地，可有效应用于重组带状疱疹疫
苗组合物的突变体，其突变位点应处于抗原决定簇区，即存在于不包含信号肽的胞外区（为
了方便描述，在本发明中称之为成熟抗原）。需要说明的是，作为本领域的常规技术手段，锚
区域、跨膜区、胞内区及信号肽均可通过相关应用软件进行预测，如可利用 SignalP 
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对蛋白质是否有信号肽进行预测分析，利
用TMHMM Server V.2.0 （http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）预测蛋白的跨膜区和
胞内区，利用PSORT软件则可确定分泌型信号肽的准确性以及该信号肽切割位点是否可被
识别并切割。

[0009] 本发明中VZV gE蛋白突变体的突变位点为成熟抗原序列（区域）第141位上，该位点由亮氨酸突变为甲硫氨酸。需要说明的是，NCBI数据库中包括的VZV gE蛋白序列表明，成
熟抗原区域第141位是高度保守的。例如NCBI Sequence ID=Q9J3M8.1的氨基酸序列（全长
为623个氨基酸），在该氨基酸序列的基础上，根据现有技术EP0405867B公开的内容（合适的
VZV gE抗原是被截短以除去羧基端锚区域（547位氨基酸开始）的VZV糖蛋白gE (也被称作
gpl)），以及在真核细胞中表达蛋白一般获得的蛋白序列将缺少前导序列（也称为信号肽，
1‑30位氨基酸），可推得该全长蛋白中成熟抗原为31‑546位，其第141位为亮氨酸。同样地，
如果对NCBI 数据库中Sequence ID为AQT34120.1、AGY33616.1、AEW88548.1的氨基酸序列
进行类似的蛋白分析，得到的结果也是这些蛋白中成熟抗原区的第141位为亮氨酸。

[0010] 本申请之发明人惊讶地发现，在选择具体氨基酸序列作为制备重组gE蛋白过程中基因优化的模板时，如果成熟抗原区的第141位进行人工改造（由亮氨酸突变为甲硫氨酸），
以改造后的氨基酸序列为基础而设计出的基因及载体将能实现更高的抗原表达量。作为举
例，理想的应用于制备重组带状疱疹疫苗组合物中的VZV gE蛋白可如SEQ ID NO：1所示，其
中该序列第1‑30位为信号肽区，第31‑546位为成熟抗原区，且为了提高蛋白的表达量，相较
野生型VZV gE蛋白，发明人人为地将该成熟抗原区的第141位由亮氨酸突变为甲硫氨酸。

[0011] 本发明的第二方面还在于提供一种重组带状疱疹疫苗组合物，该组合物中包含一种VZV病毒的gE蛋白。在一个优选的实施方式中，上述gE蛋白具有SEQ ID NO：1或3所示的氨
基酸序列。

[0012] VZV gE蛋白的制造通常是通过在培养细胞中表达或通过化学合成来实现。通常使用并且适合用于产生蛋白质的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、昆虫以及哺乳动物细胞。表达
载体和宿主细胞是可商购获得的，表达载体包含启动子和编码所关注蛋白的基因序列的克
隆位点，使得启动子和序列可操作地连接。可存在其他元件，诸如信号肽序列(有时称为前
导序列）、标签序列(例如hexa‑His)、转录终止信号、复制起始点以及编码其他产物的序列。
用于转染宿主细胞的方法和程序也是熟知的。如前所述，合适的VZV gE抗原是被截短以除
去羧基端锚区域（547位氨基酸开始）的VZV gE蛋白（例如专利CN107106675A，EP0405867B）。
同时，在真核细胞中表达蛋白一般将使得获得的蛋白序列缺少信号肽部分（例如专利
CN102548578A，CN102711812B）。故而，在一个典型地实施例中，当采用例如CHO细胞表达gE
蛋白时，最终分泌至CHO细胞外的gE蛋白序列，将如SEQ ID NO：3所示。但是，需要说明的是，
多种技术也可用于抑制表达产物在产生期间上述信号肽的裂解。举例来说，在裂解位点形
成的一个或多个不同氨基酸，从而使得该序列不被识别或裂解。故而，在一个典型的采用抑
制信号肽裂解方式获得蛋白的实施例中，最终获得的gE蛋白将如SEQ ID NO：1所示。如前所
述，根据NCBI中的数据，成熟抗原区在各种不同gE野生型或全长蛋白中是高度保守的，故
而，本领域技术人员可以理解，本发明所提供的突变体并不限于以上两种特定序列，通过本
领域已知的软件预测方式以及已公开的现有技术内容，本领域技术人员可以获得其他多种
序列，这些序列相较SEQ ID NO：1存在相同之处，即成熟抗原区的第141存在突变（由亮氨酸
突变为甲硫氨酸），由于VZV病毒毒株来源的不同，这些序列之间的差异可能存在1个或2个
或3个或4个氨基酸残基的差异，但是这些差异将不影响gE蛋白作为抗原的应用。

[0013] 在本发明的第二方面，提供了一种编码VZV病毒的gE蛋白的基因，所述基因为能够在CHO细胞中表达的gE基因，所述基因具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

[0014] 在本发明的第三方面，提供一种表达载体，所述的表达载体中含有所述的gE基因的序列。

[0015] 在一优选的实施方式中，所述的表达载体通过将gE基因5’和3’端分别引入XbaI和NotI限制性内切酶酶切位点，分别克隆至携带杀稻瘟菌素抗性基因的质粒表达载体和携带
博莱霉素抗性基因的质粒表达载体中来获得。

[0016] 在一优选的实施方式中，所述表达载体含有前述有SEQ ID NO：2所示的gE基因。

[0017] 在本发明的第四方面，提供一种基因工程化的细胞，所述的细胞含有所述的表达载体，或其基因组中整合有前述SEQ ID NO：2所示的gE基因。

[0018] 在一个优选的实施方式中，前述细胞为CHO细胞。

[0019] 在一优选的实施方式中，所述细胞为含有本发明的gE基因或表达载体的CHO细胞，所述细胞能够高水平地表达生产gE蛋白。

[0020] 在本发明的第五方面，提供一种具有免疫原性的蛋白，所述的蛋白为VZV病毒的gE蛋白，所述的gE蛋白是由CHO细胞表达的。

[0021] 在一优选的实施方式中，所述的具有免疫原性的蛋白通过以下方法制备获得：

[0022] (1) 培养所述的基因工程化的细胞，从而在细胞内表达所述的VZV病毒的gE蛋白；

[0023] (2) 分离所述的VZV病毒的gE蛋白。

[0024] 在本发明的第六方面，提供所述的疫苗组合物的用途，用于预防或治疗带状疱疹病毒感染相关疾病或病症。

[0025] 在本发明的第七方面，提供了一种在CHO细胞中表达VZV病毒的gE蛋白的方法，包括下述步骤：

[0026] (1) 将本发明的gE基因克隆入表达载体中；

[0027] (2) 将步骤(1)所得的表达载体转染至CHO细胞中；

[0028] (3) 通过混合克隆细胞群筛选和单克隆筛选，获得稳定表达gE蛋白的细胞株；

[0029] (4) 使用步骤(3)所得的细胞株进行表达，获得VZV病毒gE蛋白。

[0030] 根据本发明的一个具体实施方案，所述步骤(1)中所述的表达载体为携带杀稻瘟菌素抗性基因的质粒表达载体和/或携带博莱霉素抗性基因的质粒表达载体。

[0031] 根据本发明的一个具体实施方案，所述步骤(2)中使用的CHO细胞为CHO‑K1细胞。

[0032] 本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

具体实施方式

[0033] 实施例1 VZV病毒gE蛋白的克隆构建、表达与纯化

[0034] 1、gE蛋白的选择与（gE基因的）合成

[0035] 通过NCBI数据库和文献检索，选择了一段保守的截短gE蛋白氨基酸序列作为进行基因优化的模板，为了提高表达效率，仅选取信号肽区域及成熟抗原。同时，本专利之发明
人惊讶地发现，在选择具体氨基酸序列作为制备重组gE蛋白过程中基因优化的模板时，如
果对成熟抗原区的第141位氨基酸进行人工改造（由亮氨酸突变为甲硫氨酸），以改造后的
氨基酸序列为基础而设计出的基因及载体组合将能实现更高的抗原表达量。该突变体蛋白
序列全长546个氨基酸（SEQ ID NO：1），具体如下，该序列中包括了信号肽和抗原主体部分，
但不包括gE蛋白中的C端羧基端锚定区域。

[0036] MGTVNKPVVGVLMGFGIITGTLRITNPVRASVLRYDDFHIDEDKLDTNSVYEPYYHSDHAESSWVNRGESSRKAYDHNSPYIWPRNDYDGFLENAHEHHGVYNQGRGIDSGERLMQPTQMSAQEDLGDDTGIHVIPTLNGDDRHKI
VNVDQRQYGDVFKGDLNPKPQGQRMIEVSVEENHPFTLRAPIQRIYGVRYTETWSFLPSLTCTGDAAPAIQHICLKH
TTCFQDVVVDVDCAENTKEDQLAEISYRFQGKKEADQPWIVVNTSTLFDELELDPPEIEPGVLKVLRTEKQYLGVYI
WNMRGSDGTSTYATFLVTWKGDEKTRNPTPAVTPQPRGAEFHMWNYHSHVFSVGDTFSLAMHLQYKIHEAPFDLLLE
WLYVPIDPTCQPMRLYSTCLYHPNAPQCLSHMNSGCTFTSPHLAQRVASTVYQNCEHADNYTAYCLGISHMEPSFGL
ILHDGGTTLKFVDTPESLSGLYVFVVYFNGHVEAVAYTVVSTVDHFVNAIEERGFPPTAGQPPATTKPKEITPVNPG
TSPLLRYAAWTGGLA

[0037] 为了利于gE蛋白在CHO细胞中高效表达，选择CHO细胞偏好的密码子对gE基因（如SEQ ID NO：2）进行优化，并委托外包公司合成，具体如下。需要说明的是，优化原则并非简
单选择CHO细胞中频率最高的密码子，而是一个较为复杂的优化方案。整体上的优化原则有
三：第一，根据密码子的简并性，用CHO细胞中各氨基酸对应的高频密码子替换原有密码子；
第二，为避免转录后的mRNA中过高的GC含量对其二级结构造成影响，进而影响翻译效率，在
优化过程中尽量将基因的GC%控制在40‑60%；第三，避开一些常用的限制性酶切位点。

[0038] ATGGGCACCGTCAATAAGCCCGTGGTGGGCGTGCTGATGGGCTTTGGCATCATTACCGGAACACTCCGGATCACCAACCCTGTCAGGGCCTCCGTGCTCCGGTATGACGACTTCCACATCGATGAGGACAAGCTGGACACAAACTC
CGTCTACGAGCCCTACTACCACAGCGACCATGCCGAGAGCTCCTGGGTGAACAGGGGCGAAAGCTCCAGGAAGGCCT
ACGACCATAACTCCCCCTATATCTGGCCTAGGAACGACTACGACGGCTTTCTGGAGAACGCCCATGAGCATCATGGA
GTCTATAACCAGGGCAGGGGCATCGACAGCGGCGAGAGGCTGATGCAACCCACCCAGATGTCCGCCCAGGAGGATCT
GGGCGATGACACCGGAATCCATGTGATCCCTACCCTGAACGGCGATGACAGGCACAAGATCGTCAATGTGGACCAGC
GGCAGTACGGAGATGTGTTCAAGGGCGACCTGAATCCCAAGCCCCAGGGCCAGAGGATGATCGAGGTGAGCGTGGAG
GAGAACCATCCCTTTACCCTCAGGGCCCCTATCCAGCGGATCTACGGCGTGAGGTACACCGAGACCTGGTCCTTCCT
GCCCTCCCTGACATGTACAGGCGACGCCGCCCCCGCTATTCAGCACATCTGCCTGAAGCACACCACCTGCTTTCAGG
ATGTGGTCGTCGACGTGGACTGCGCCGAGAACACAAAAGAAGACCAGCTGGCCGAGATCTCCTACAGGTTCCAAGGC
AAGAAGGAAGCTGACCAGCCCTGGATCGTCGTCAACACATCCACACTCTTCGACGAATTAGAACTCGATCCCCCTGA
AATCGAGCCCGGAGTGCTCAAGGTGCTGCGGACCGAGAAGCAGTACCTCGGCGTGTATATCTGGAACATGCGGGGCA
GCGACGGAACAAGCACATACGCTACCTTCCTGGTGACCTGGAAGGGCGACGAAAAGACCAGGAACCCTACCCCTGCC
GTGACACCTCAGCCTAGGGGCGCCGAATTCCACATGTGGAACTATCATTCCCACGTGTTCAGCGTCGGCGACACCTT
CAGCCTCGCCATGCACCTGCAGTACAAGATCCATGAGGCCCCCTTCGACCTGCTGCTGGAGTGGCTGTATGTCCCTA
TCGACCCTACCTGCCAACCCATGAGGCTGTATTCCACCTGTCTCTACCATCCCAACGCTCCTCAGTGCCTCAGCCAT
ATGAACTCCGGCTGTACCTTCACCTCCCCTCACCTGGCCCAACGGGTGGCCTCTACCGTGTATCAGAATTGCGAGCA
CGCCGACAACTACACAGCCTATTGCCTGGGCATCAGCCATATGGAGCCTTCCTTTGGCCTGATTCTGCACGACGGCG
GAACCACCCTGAAGTTTGTGGATACCCCCGAGTCCCTGAGCGGCCTGTACGTGTTCGTCGTGTACTTTAACGGCCAC
GTGGAAGCCGTCGCCTACACCGTCGTGAGCACCGTCGACCACTTCGTGAACGCCATCGAAGAGCGGGGCTTTCCTCC
TACAGCCGGCCAGCCTCCTGCCACAACCAAGCCCAAAGAGATCACACCCGTGAACCCTGGCACCAGCCCCCTCCTCA
GGTATGCTGCCTGGACAGGAGGACTGGCTTGATGA

[0039] 2、gE蛋白表达质粒的克隆构建

[0040] 将上述合成的gE基因5’和3’端分别引入Xba I和Not I限制性内切酶酶切位点，通过PCR扩增该片段并将其分别克隆至表达载体pWX2.0和pWX1.0中。载体pWX2.0携带杀稻瘟
菌素抗性基因，pWX1.0携带博来霉素抗性基因。这两个载体均使用巨细胞病毒（CMV）启动
子/增强子序列来进行目的基因的表达。CMV启动子是目前较为常用的启动真核基因表达的
强启动子。经克隆构建获得相应的表达质粒，并通过酶切和测序鉴定序列无误。

[0041] 需要说明的是，上述两个表达载体的构建方式为本领域的常规技术手段，作为举例，可参考的构建方式为：

[0042] 2.1表达载体pWX2.0‑B‑gE的构建

[0043] 以质粒pUC57‑gE为模板，用Xba I (NEB, Cat. #: R0145S)和Not I‑HF (NEB, Cat. #: R3189S)双酶切后得到1660 bp的DNA片段，1%琼脂糖凝胶电泳分离后，在UV灯下进
行割胶并回收该1660bp的DNA片段。

[0044] 利用限制性内切酶Xba I (NEB, Cat. #: R0145S)和Not I‑HF (NEB, Cat. #: R3189S)双酶切载体pWX2.0，回收大小为4775bp酶切产物。将上述1660bp的回收片段连接到
上述4775bp的pWX2.0载体中 ，连接产物转化至TOP10感受态细胞，并用含有杀稻瘟菌素的
平板筛选，得到若干单克隆阳性菌落，从中挑取部分菌落进行PCR扩增和测序验证。随后，挑
取一个测序验证正确的克隆 ，在LB平板上划线两次，将分离得到的单克隆转接到300ml LB
培养基中（含100 μg/mL氨苄青霉素），37 ℃，220 rpm过夜振荡培养，大量抽提质粒DNA，最
终得到的质粒命名为pWX2.0‑B‑gE。

[0045] 2.2表达载体pWX1.0‑Z‑gE的构建

[0046] 同2.1中步骤，以质粒pUC57‑gE为模板，用Xba I和Not I‑HF双酶切后得到1660bp的DNA片段，1%琼脂糖凝胶电泳分离后，在UV灯下进行割胶并回收该1660bp的DNA片段。

[0047] 使用限制性内切酶Xba I和Not I‑HF对载体pWX1.0进行双酶切，使用胶纯化试剂盒回收4172bp的载体片段。将上述1660bp的回收片段连接到上述4172bp的pWX1.0载体片段
中，连接产物转化至TOP10感受态细胞，挑选若干单克隆，进行PCR和测序验证。随后，挑取一
个测序验证后正确的克隆，在LB平板上划线两次，将分离得到的单克隆转接到300 ml LB培
养基中（含100μg/mL氨苄青霉素钠，也可选择例如博来霉素），37℃，220 rpm过夜振荡培养，
大量抽提质粒DNA，最终得到的质粒命名为pWX1.0‑Z‑gE。

[0048] 3、gE蛋白的表达和纯化

[0049] 通过上述2中的方式，大量制备表达质粒，经线性化后稳定转染至宿主细胞CHO‑K1。在本实施例中，共进行了6组转染试验。随后用分批补料培养的方式对每组转染的迷你
细胞群进行筛选，选择表达量较高的细胞群进行后续有限稀释法克隆筛选。可知，在所有的
6组迷你细胞群中，平均细胞表达量在2‑3g/L之间，而最高的三组细胞群的表达量在2.5‑
3g/L之间，最高的一组细胞群蛋白表达量可达3.04g/L。在此基础上，选择表达量最高的三
组细胞群（分别来源不同的质粒，但细胞生长情况均较好），对这三组细胞群通过有限稀释
的方法挑选单克隆。将挑选后的单克隆在分批补料培养过程中扩大培养，将上述克隆细胞
的上清收集，取样进行western blot检测根据条带确定目标蛋白，综合考虑克隆的LDC照
片、生长情况、表达量、活细胞密度、活率、终末乳酸含量以及相关产品质量参数，选择出最
优的3个克隆，即为优势细胞株。将上述获得的细胞株，经生物反应器培养表达，即可获得含
有gE蛋白的细胞培养上清，同样可对上述上清液取样进行Western blot检测根据条带确定
是否为目标蛋白。经证明，上述细胞株中gE蛋白的平均值能够达到3g/L。需要说明的是，如
果采用野生型蛋白序列（作为比较例，采用NCBI Sequence ID=Q9J3M8.1的野生型蛋白序
列，但是同样不包括gE蛋白中的C端羧基端锚区域）作为制备重组gE蛋白的设计模板，以相
同的DNA优化策略进行优化，获得的细胞株其蛋白表达量的平均值为2.5g/L左右。且本发明
所提供的突变体具有与野生型蛋白相当的免疫原性（下将详述）。故而本发明所提供的蛋白
突变体、包含优化基因序列的表达载体及细胞株将为重组VZV疫苗提供一种更优异的替代
选择，经表达产物氨基酸序列分析证明，在蛋白前体（即作为基因优化模板的氨基酸序列）
分泌到细胞外时，信号肽区域已被信号肽酶切断，此时VZV gE重组蛋白如SEQ ID NO：3所
示，其中该序列第141位存在人工突变，由亮氨酸突变为甲硫氨酸。

[0050] SVLRYDDFHIDEDKLDTNSVYEPYYHSDHAESSWVNRGESSRKAYDHNSPYIWPRNDYDGFLENAHEHHGVYNQGRGIDSGERLMQPTQMSAQEDLGDDTGIHVIPTLNGDDRHKIVNVDQRQYGDVFKGDLNPKPQGQRMIEVSV
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[0051] 需要说明的是，使用CHO细胞株稳定表达VZV gE重组蛋白的方法是本领域众所周知的方法，具体可参照《分子克隆试验指南》及其他一些文献，例如Haumont M, 等人，Virus 
Research 40  (1996)  ，199‑204  ，Purification, characterization  and 
immunogenicity of recombinant varicella‑zoster virus glycoprotein gE secreted 
by Chinese hamster ovary cells。作为举例，具体的质粒转染及细胞株构建方式如下：

[0052] 用CD CHO培养基M1复苏并培养1支CHO‑K1宿主细胞作为工作细胞库细胞。

[0053] 将通过上述2中的方式获得的质粒pWX1.0‑Z‑gE和pWX2.0‑B‑gE进行线性化处理，具体为使用限制性内切酶Sca I‑HF进行酶切（50 μl酶切体系），取2 μl酶切产物并用1%琼
脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示，两个质粒经Sca I‑HF酶切后均呈现出单一而清晰的条
带，说明线性化结果良好。上述50 μl的线性化产物再经过酚氯仿抽提纯化和乙醇沉淀后，
溶解于10 mM Tris缓冲液中。经Nano‑Drop检测，质粒pWX1.0‑Z‑gE的浓度为1285.3 ng/μl， 
5
pWX2.0‑B‑gE的浓度为1064.3 ng/μl。随后，将上述宿主细胞CHO‑K1以7×10 cells/ml的
密度接种于培养基M1中。24小时后，对宿主细胞进行计数，并用预热的培养基M1将细胞稀释
6
至1.0×10cells/ml，随后取5ml细胞悬液放入Kuhner摇床中备用。摇床参数为：温度36.5 
℃，湿度85%，二氧化碳6%，转速225rpm。准备进行转染，具体步骤如下：

[0054] 第一，质粒pWX1.0‑Z‑gE及质粒pWX2.0‑Z‑gE质粒各取12 μg，分别加入预先加有776 µl OptiProSFM的50 ml摇管中。同时，将24 μl的FreeStyle Max Reagent加入另一个
预先加有776 µL OptiProSFM的50 ml摇管中。随后，再把FreeStyle Max Reagent和
OptiProSFM的混合物加入质粒和 OptiProSFM的混合物中，轻微吸打混匀并置于室温下静
置孵育10分钟；

[0055] 第二，取上述混合液667 µl（质粒，FreeStyle Max Reagent以及OptiProSFM）滴加至稀释好的宿主细胞悬液（5 ml）中。随后将细胞放入Kuhner摇床孵育。摇床参数为：温度
36.5 ℃，湿度85%，二氧化碳6%，转速225 rpm；

[0056] 第三，孵育6小时后，加入5 ml预热的新鲜培养基M1。随后将细胞放入Kuhner摇床中培养。摇床参数为：温度36.5 ℃，湿度85%，二氧化碳6%，转速225 rpm。

[0057] 通过上述转染方式即可获得包含优化后gE基因的稳定CHO‑K1混合克隆细胞群。同时，通过迷你细胞群的培养基筛选以及通过有限稀释法挑选单克隆细胞也是公知的实验手
段。经过这些手段方法，即可获得表达量较高的单克隆细胞，即优势CHO细胞株。

[0058] 实施例2 重组带状疱疹疫苗的免疫原性评价

[0059] 获得实施例1中所述的gE蛋白，经常规的处理方式，例如疏水层析、阴离子交换层析、羟基磷灰石层析、超滤和纳滤后，即可获得纯度为95%以上蛋白作为抗原蛋白使用。

[0060] 为了研究本发明所提供的基因及载体所制备得的抗原的免疫原性，将上述抗原与佐剂吸配制成重组带状疱疹疫苗组合物，并以C57BL/6小鼠为动物模型开展了免疫原性研
究。具体方法为：以gE蛋白为抗原，以磷酸铝以及 CpG ODN为佐剂吸配制成重组带状疱疹疫
苗组合物。选择6‑8周龄C57BL/6小鼠随机分组，每组10只小鼠，肌肉注射上述疫苗组合物，
并设置疫苗组和佐剂组，0、3周免疫，第5周采血取脾脏。采用ELISA法检测血清中的抗VZV 
gE蛋白的抗体滴度（即total IgG），采用ELISPOT法检测脾细胞中的细胞免疫水平，主要为
IFN‑γ的表达。结果显示通过本发明提供的技术方案所获得的gE蛋白所制备得到的疫苗组
合免疫原性非常好，可作为潜在的重组带状疱疹候选疫苗（具体结果如表1所示）。

[0061] 免疫原性的评价方法为本领域的行规技术手段，作为举例，更具体的操作方式如下：

[0062] 1、重组带状疱疹疫苗的动物实验

[0063] 选择6 8周龄C57BL/6小鼠随机分组，每组10只。肌肉注射不同剂量的疫苗（具体配~
比见表1），注射体积为0.05ml；0、3周免疫，第5周取血取脾脏，分离血清进行ELISA检测抗
体，分离脾淋巴细胞进行ELISPOT分析。具体检测方法作为举例可为如下方式：

[0064] 2、抗体滴度检测

[0065] (1) 抗原gE原液用PBS稀释至1μg/ml，ELISA板每孔加入100μl稀释好的原液。4℃过夜。洗板机清洗。

[0066] (2) 用PBS配置5%脱脂奶，ELISA板每孔加入100μl脱脂奶。37℃保温2 小时。洗板机清洗。

[0067] (3) PBS配置2%脱脂奶，将待测血清梯度稀释，ELISA板每孔加入稀释血清100 μl，37℃保温1 小时。洗板机清洗。

[0068] (4) 用PBS配置的2%脱脂奶将羊抗鼠IgG二抗按1:10000比例稀释，ELISA板每孔加入100μl脱脂奶稀释的二抗。37℃保温1 小时。洗板机清洗。

[0069] (5) 按显色缓冲液9 ml，TMB 1ml，3% H2O2 10μl的比例配制显色液。ELISA板每孔加入100μl显色液。37℃保温10分钟。ELISA板每孔加入50μl终止液。

[0070] (6 ) 450nm/620nm读数。

[0071] 3、细胞免疫检测

[0072] 每组小鼠取脾，分离淋巴细胞。通过ELISPOT测定小鼠脾淋巴细胞表达IFN‑γ的水平。

[0073] (1) 包被ELISPOT板（无菌操作，取脾脏前一天进行）

[0074] 35%的酒精润湿ELISPOT板，按15µl/孔的量加入96孔ELISPOT板中，保留时间不超过1分钟。加入200µl/孔无菌水洗板5次。取150µl的 IFN‑γ包被抗体，加入10ml PBS中，混
匀，0.2μm滤膜过滤。取包被抗体稀释液，100µl/孔加入96孔ELISPOT板中，4℃过夜。

[0075] (2) ELISPOT板封闭（无菌操作）

[0076] 弃掉包被抗体，加入200µl/孔无菌PBS洗板5次。按200µl/孔的量将1640完全培养基（含10% FBS）加入到96孔ELISPOT板中，室温封闭30分钟以上。弃去液体，在灭菌的纱布上
尽量扣干水分，以免下步加入培养基时产生气泡。

[0077] (3)淋巴细胞准备（无菌操作）

[0078] 处死小鼠，浸泡于75%乙醇中。在超净台中取出小鼠脾脏。在35mm培养皿中放入一块无菌化处理的200目铜网，加入1ml淋巴细胞分离液，用1ml注射器的推杆研磨。把悬有脾
细胞的分离液经200目铜网过滤后，转移到15ml离心管中，加入淋巴细胞分离液至4ml，液面
上覆盖0.5ml的RPMI1640基础培养基。室温、800g、升降速3、离心30分钟。吸出淋巴细胞层，
再加入10ml RPMI1640基础培养基，洗涤，室温、250g、离心10分钟。弃去上清液，加入2ml 
RPMI1640完全培养基重悬细胞，计数。

[0079] (4) 加样（无菌操作）

[0080] 加细胞：根据细胞计数结果用完全培养基稀释细胞至6×106/ml，同时mAb CD28‑A稀释1000倍加入到细胞悬液中。100µl/孔加入ELISPOT板内。阳性对照：加入ConA刺激物1µ
l，刺激浓度为5µg/ml。待测样品：加入用无血清培养基进行稀释的刺激物gE蛋白肽库，终浓
度2µg/ml；阴性对照：不加ConA刺激物，也不加刺激物短肽。37℃ 5%CO2培养24小时，期间不
可移动培养板以免造成细胞位置的变动进而ELISPOT斑点的变模糊。

[0081] (5)斑点检测

[0082] 弃掉细胞悬液，加入200µl/孔无菌PBS洗板5次。取50μl生物素标记检测抗体加入到10ml稀释液（PBS+0.1%BSA）中，混匀，0.2μm滤膜过滤。每孔加入100μl，37°C 孵育2小时。
弃掉生物素标记检测抗体稀释液，加入200µl/孔无菌PBS洗板5次。用稀释液（PBS+0.1%BSA）
稀释抗体，取50μl加稀释液10ml，混匀，0.2μm滤膜过滤。每孔加入100μl，37°C 孵育1小时。
从此步骤开始避光操作。弃掉抗体稀释液，加入200µl/孔无菌PBS洗板5次。按50µl/孔的量
加入Fluorescence enhancer‑II到96孔ELISPOT板中，37°C 孵育15分钟。弃掉板内液体，将
板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠。取下保护层，放在电热恒温培养箱中，37°C避光将膜
烘干。将ELISPOT 板置于CTL‑ImmunoSpot® S5 VersC CnClyzer酶联斑点图像自动分析仪
内，调节好合适的参数，进行斑点计数。

[0083] 具体结果如下表1所示：

[0084]

[0085] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可
以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范
围。