AOX特异性抗体组合及其制备方法和用途

摘要

本发明涉及植物细胞技术领域，具体公开了AOX特异性抗体组合及其制备方法和用途，所述AOX特异性抗体组合包含AOX1a、AOX1b/c、AOX1d和AOX2四个抗体。本发明获得的AOX特异性抗体组合灵敏度很高，四个AOX特异性抗体能够分别检测植物中蛋白序列高度相似的AOX蛋白。

权利要求

1.AOX特异性抗体组合的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，目的基因序列的合成，所述目的基因分别为SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.4，所述目的基因SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.4对应的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5‑SEQ ID NO.8所示；

S2，将S1合成的目的基因SEQ ID NO.1通过EcoRI和XhoI双酶切连接构建到大肠杆菌表达载体pGEX4T.3载体上，然后通过在大肠杆菌中诱导蛋白表达，获得AOX与GST的融合蛋白，标记为GST‑AOX1a；

S3，将S2获得的GST‑AOX1a蛋白进行提纯；

S4，将S3中提纯的蛋白注射到兔子体内，进行4次免疫后，分离血清，获得AOX特异性抗体AOX1a；

S5，分别合成目的基因SEQ ID NO.2‑SEQ ID NO.4，然后参照S2‑S4的方法制备相应的AOX特异性抗体AOX1b/c，AOX1d，AOX2。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2中，蛋白诱导条件为：23℃，10h，0.1mM IPTG。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，4次免疫方法如下：

初次免疫，每只兔子注射200μg蛋白；蛋白与等体积弗氏完全佐剂混合，在5mL离心管中涡旋震荡2‑3h乳化，乳化蛋白进行背部皮下多点注射，每两周加强免疫一次，剂量为100μg，加强免疫选用弗氏不完全佐剂，最后一次免疫后，7到10天之内心脏抽血，并分离血清，获得AOX特异性抗体。

说明书

AOX特异性抗体组合及其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及植物细胞技术领域，具体涉及AOX特异性抗体组合及其制备方法和用途。

背景技术

[0002] 光合作用是地球能量的主要来源，对光合作用的研究有助于提高农作物产量，也可能对能源短缺问题提供新的解决思路。植物光合作用涉及电子传递链，而AOX蛋白是交替氧化酶电子传递途径的末端氧化酶，参与抗氰呼吸，在植物抵抗逆境胁迫过程中发挥着非常重要的作用，因此成为研究的热点。

[0003] 植物的线粒体中有五个AOX蛋白：AOX1a，AOX1b，AOX1c，AOX1d和AOX2。它们具有同源性，蛋白相似度很高。目前的研究集中在AOX1a，其他四个报道很少，AOX1a是主要的，相对来说表达量较大，另外四个则很难检测，一般用的抗体都来自于UNIVERSITY OF NEBRASKA,LINCOHN，这是一个单克隆抗体，专一性很好，但这个抗体灵敏度很低，连AOX1a都难以检测。

[0004] 在检测AOX表达的蛋白质免疫印迹实验(Western Blot)中，首先要先提取细胞的膜蛋白，再用1:50的稀释倍数的AOX抗体，才可以用Western Blot来显示AOX1a，由于其他四个AOX的丰度要远远小于AOX1a，要检测它们在植物中的水平就非常困难，并且这个抗体不能区分具体是哪种亚型的AOX，检测到的是AOX家族的全体。

发明内容

[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供了AOX特异性抗体组合及其制备方法和用途，实现了高效检测植物中所有的交替氧化酶，为涉及该蛋白领域的研究提供了有效的检测工具。

[0006] 本发明第一个目的是提供了AOX特异性抗体组合，所述AOX特异性抗体包含AOX1a、AOX1b/c、AOX1d和AOX2四个抗体；

[0007] 所述抗体AOX1a对应抗原的基因序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

[0008] 所述抗体AOX1b/c对应抗原的基因序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

[0009] 所述抗体AOX1d对应抗原的基因序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；

[0010] 所述抗体AOX2对应抗原的基因序列如SEQ ID NO.4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

[0011] 本发明还提供了上述AOX特异性抗体组合的制备方法，包括如下步骤：

[0012] S1，目的基因序列的合成，所述目的基因分别为SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.4：

[0013] S2，将S1合成的目的基因SEQ ID NO.1通过EcoRI和XhoI双酶切连接构建到大肠杆菌表达载体pGEX4T.3载体上，然后通过在大肠杆菌中诱导蛋白表达，获得AOX与GST的融合蛋白，标记为GST‑AOX1a；

[0014] S3，将S2获得的GST‑AOX1a蛋白进行提纯：

[0015] S4，将S3中提纯的蛋白注射到兔子体内，进行4次免疫后，分离血清，获得AOX特异性抗体AOX1a；

[0016] S5，分别合成目的基因SEQ ID NO.2‑SEQ ID NO.4，然后参照S2‑S4的方法制备相应的AOX特异性抗体AOX1b/c，AOX1d，AOX2。

[0017] 本发明的第三个目的是提供所述AOX特异性抗体组合在检测植物交替氧化酶中的用途。

[0018] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

[0019] 1、本发明制备获得了高灵敏度的AOX特异性抗体组合，提高了检测效率，能够检测丰度低的AOX；

[0020] 2、本发明设计并制备了对应植物中所有交替氧化酶的高灵敏度的特异性抗体，为检测植物中所有的交替氧化酶提供了一种有效的方法，也为涉及该蛋白领域的研究提供了有效的检测工具。

附图说明

[0021] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0022] 图1为本发明实施例1提纯的蛋白胶图；

[0023] 图1中(1)‑(4)分别为蛋白GST‑AOX1a、GST‑AOX1b/c、GST‑AOX1d、GST‑AOX2；

[0024] 图2为本发明实施例1中免疫后的血清中抗体的检测结果图；

[0025] 图2中(1)‑(4)分别为抗体AOX1a、AOX1b/c、AOX1d、AOX2的检测结果图。

具体实施方式

[0026] 下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0027] 实施例1

[0028] 本实施例提供了AOX特异性抗体组合的制备方法，包括如下步骤：

[0029] S1，目的基因序列的合成：

[0030]如SEQ ID NO.1所示；

[0031] 所述抗体AOX1a对应抗原的氨基酸序列如SEQ ID  NO.5所示：ASTITLGE KTPMKEEDAN QKKTENESTG GDAAGGNNKG DKGIA；

[0032]如SEQ ID NO.2所示；

[0033] 所述抗体AOX1b/c对应抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示：SKMTF EKKKTSEEEE GSGDGVKVND QGNKGEQLIV；

[0034]如SEQ ID NO.3所示；

[0035] 所述抗体AOX1d对应抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示：LSSDTSSPV SGNNQPENPI RTADGKVIST YWGIP；

[0036]如SEQ ID 
NO.4所示；

[0037] 所述抗体AOX2对应抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示：GMSSASAM EKKDENLTVK KGQNGGGSVA VPSYWGIETA；

[0038] 目的基因序列SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.4中，单下划线碱基部分为保护碱基，双下划线碱基部分为EcoRI和XhoI酶切位点，其余碱基部分为各个AOX蛋白的特异性可溶区段序列，由于AOX1b和AOX1c蛋白序列相似度非常高，因此制备的AOX1b/c抗体可以同时免疫AOX1b和AOX1c两种蛋白；

[0039] S2，将S1合成的目的基因SEQ ID NO.1通过EcoRI和XhoI双酶切连接构建到大肠杆菌表达载体pGEX4T.3载体上，然后通过在大肠杆菌中诱导蛋白表达，获得AOX与GST的融合蛋白，标记为GST‑AOX1a；

[0040] 所述蛋白诱导条件为：23℃，10h，0.1mM IPTG；

[0041] S3，通过GE公司的GlutahioneSepharose 4BS提纯GST‑AOX1a蛋白(结果如图1所示),纯化蛋白浓度至少为200μg/mL；

[0042] S4，将S3中提纯的蛋白分别注射到2只兔子体内，免疫兔子之前，进行心脏采血作为对照，共进行4次免疫，具体为：

[0043] 初次免疫，每只兔子注射200μg蛋白；蛋白与等体积弗氏完全佐剂混合，在5mL离心管中涡旋震荡2‑3h乳化，乳化蛋白进行背部皮下多点注射，每两周加强免疫一次，剂量为100μg，加强免疫选用弗氏不完全佐剂，最后一次免疫后，7到10天之内心脏抽血，并分离血清，获得AOX特异性抗体AOX1a。

[0044] S5，利用S1中合成的SEQ ID NO.2‑SEQ ID NO.4目的基因序列，参照S2‑S4的方法制备相应的AOX特异性抗体AOX1b/c，AOX1d，AOX2。

[0045] 利用上述实施例1获得的AOX特异性抗体AOX1a，AOX1b/c，AOX1d，AOX2分别检测与之相应的AOX蛋白，检测结果如图2所示；

[0046] 三种材料供检验抗体分别为：WT(野生型拟南芥，含野生水平的AOX表达量，极少)，immutans(PTOX突变体，含野生水平的AOX表达量，极少)和AOX的转基因植物(immutans背景)；

[0047] 图2检测结果表明：制备的AOX多克隆抗体AOX1a，AOX1b/c，AOX1d和AOX2可以与之相对应的AOX蛋白产生免疫反应，而且条带亮度明显，而且信号很强，因此，本发明获得的AOX特异性抗体组合可以很好的用于AOX蛋白的检测。

[0048] 综上所述，本发明获得的AOX特异性抗体组合灵敏度高，可以很好的用于AOX蛋白的检测。

[0049] 尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

[0050] 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。