一组普适性SNP标记的分型及应用

摘要

本发明公开一组普适性SNP标记的分型及应用。本发明的分型包括以下步骤：提取待测西红柿的基因组DNA；基于多个SNP位点组成的位点集信息，通过程序性降低扩增温度进行SNP位点的检测；基于检测结果对待测西红柿进行基因分型以及分型结果的分析。本发明的SNP标记具有良好的多态性，且稳定性和可重复性好，将SNP标记通过竞争性等位基因特异性PCR检测，能够实现更高通量的检测过程。此外，本发明提供核心SNP标记集。利用该套标记集可以高效、准确地鉴定西红柿品种的真实性，保证西红柿种质资源收集的可靠性，同时显著降低检测成本。

权利要求

1.一种基于SNP标记对西红柿品种进行区分的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测西红柿的基因组DNA的步骤；

(2)基于多个SNP位点组成的位点集信息，利用SEQ ID NO:1‑63所示的引物通过程序性降低扩增温度进行待测西红柿基因组SNP位点的检测步骤，其中所述位点集包括以下位点：SNP01‑3、SNP02‑1、SNP02‑3、SNP03‑1、SNP03‑3、SNP04‑1、SNP04‑2、SNP05‑3、SNP06‑3、SNP06‑6、SNP07‑4、SNP07‑5、SNP07‑8、SNP07‑9、SNP08‑1、SNP09‑1、SNP10‑1、SNP11‑3、SNP12‑4、SNP12‑6和SNP12‑8，这些位点的信息如下所示：其中，基因位置或位点是指相对于版本号为SL3.0的西红柿品种Heinz1706而言的位置；

(3)进行待测西红柿的基因分型和分型结果分析的步骤；

其中，每个SNP位点分别对应一个由第一正向引物、第二正向引物和反向引物三条引物组成的引物组，且所述程序性降低扩增温度进行检测包括：变性步骤，94℃变性15min；94℃变性20s；

第一循环步骤，首先61℃、退火60s，之后每个循环降低0.6℃、退火60s，共10个循环；第二循环步骤，94℃变性20s，55℃复性延伸60s，共26‑32个循环。

2.根据权利要求1所述的基于SNP标记对西红柿品种进行区分的方法，其特征在于，所述位点集进一步包括：

SNP01‑1、SNP01‑2、SNP02‑2、SNP02‑4、SNP03‑2、SNP03‑4、SNP03‑5、SNP03‑6、SNP04‑3、SNP04‑4、SNP04‑5、SNP05‑1、SNP05‑2、SNP05‑4、SNP05‑5、SNP05‑6、SNP05‑7、SNP06‑1、SNP06‑2、SNP06‑4、SNP06‑5、SNP07‑1、SNP07‑2、SNP07‑3、SNP07‑6、SNP07‑7、SNP07‑10、SNP07‑11、SNP07‑12、SNP07‑13、SNP11‑1、SNP11‑2、SNP12‑1、SNP12‑2、SNP12‑3、SNP12‑5、SNP12‑7和SNP12‑9，这些位点的信息如下所示：其中，基因位置或位点是指相对于版本号为SL3.0的西红柿品种Heinz1706而言的位置。

3.根据权利要求2所述的基于SNP标记对西红柿品种进行区分的方法，其特征在于，进一步包括利用SEQ ID NO:64‑177所示的引物进行基因组DNA中位点集的检测。

4.根据权利要求1所述的基于SNP标记对西红柿品种进行区分的方法，其特征在于，步骤(2)包括构建含缓冲液和溶解于所述缓冲液的多个引物组的反应体系的步骤，所述反应体系中各引物组的第一正向引物、第二正向引物和反向引物的浓度分别为50‑200μmol/L。

5.组合物或试剂盒用于基于SNP标记区分西红柿品种的用途，其特征在于，所述组合物或试剂盒包含用于检测由多个SNP位点组成的位点集的信息的引物，其中，所述SNP位点的信息如下所示：

其中，基因位置或位点是指相对于版本号为SL3.0的西红柿品种Heinz1706而言的位置，且所述引物包含SEQ ID NO:1‑63所示的引物。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述引物进一步包含SEQ ID NO:64‑177所示的引物，其被用于检测如下所示的SNP位点：其中，基因位置或位点是指相对于版本号为SL3.0的西红柿品种Heinz1706而言的位置。

说明书

一组普适性SNP标记的分型及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及种质资源和分子育种技术领域，具体地涉及一种普适性SNP标记的组合物、分型方法及其应用。

背景技术

[0002] 西红柿属于茄科(Solanineae)番茄属(Lycopersicon)，富含番茄素和多种维生素，生长周期短且具有较高的经济价值，不仅是我国种植面积最大的重要蔬菜作物之一，同
时也是肉质果实研究的模式植物。随着育种技术的快速发展，西红柿品种数量与日俱增，而
生活水平的进步促使品种多样化的需求不断提高。生产上，假冒品种、品种不纯、品种混淆
等现象普遍存在，极大损害了育种家和种子公司的利益，也给种子需求者在选择种子时带
来了困惑。品种鉴定是农业发展过程中的重要环节，如何对庞大的西红柿种质资源进行科
学地鉴定和分析，避免相同西红柿种质的重复收集，保护植物新品种知识产权，促进西红柿
品种市场健康发展，是西红柿生产中急需解决的问题之一。

[0003] 传统的西红柿品种鉴定方法主要依靠形态学标记法，对茎、叶、花、株高、果实等性状的相对差异进行肉眼识别，或是借助某些易测试的性状，如典型的抗病虫性、生理特性，
这种方法费时费力，部分性状易受环境影响，并且形态学特征往往在植株的特定生长阶段
才开始显现或者有些品种的区分并不体现于形态上。随着分子生物学技术的发展，利用分
子标记技术进行品种的鉴定已成为一种趋势，排除了环境因素的影响，结果更加可靠。国际
新品种权植物保护联盟(UPOV)已在BMT分子测试指南中将SSR(simple sequence repeat)
标记和SNP(single‑nucleotide polymer‑phism)标记作为植物品种鉴定推荐的分子标记
方法(Button P,2007)。SNP标记具有变异丰富、准确度高、易实现自动化等优点，可以打破
SSR标记数量有限、操作耗时的局限性，被公认为极具应用前景的分子标记(Rasheed Awais 
et al.,2017)。与此同时，番茄基因组测序的完成为番茄SNP标记的开发提供了良好的基础
(Lin et al.,2014)。

[0004] 目前，SNP标记技术广泛用于水稻、玉米、大豆等作物的品种鉴定，且在品种管理和保护中均产生了积极的效果。西红柿品种鉴定主要采用InDel标记法(高建昌等,2013)，利
用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行基因分型和分析，该方法通量较低、步骤繁琐、数据整合困难。
此外，传统方法品种真实性鉴定中出现的效率低和易受环境因素影响等问题仍需进一步改
善。

发明内容

[0005] 为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一组普适性SNP标记的分型方法及应用。本发明的组合物和基因分型方法能够鉴定市面上广泛存在的西红柿商业品
种，不仅可以实现高通量检测，而且高效、准确地鉴定西红柿品种的真实性，保证西红柿种
质资源收集的可靠性，同时显著降低检测成本。具体地，本发明包括以下内容。

[0006] 本发明的第一方面，提供一种基于SNP标记的分型方法，其包括以下步骤：

[0007] (1)提取待测西红柿的基因组DNA的步骤；

[0008] (2)基于多个SNP位点组成的位点集信息，通过程序性降低扩增温度进行待测西红柿基因组SNP位点的检测步骤，其中位点集包括以下位点：SNP01‑3、SNP02‑1、SNP02‑3、
SNP03‑1、SNP03‑3、SNP04‑1、SNP04‑2、SNP05‑3、SNP06‑3、SNP06‑6、SNP07‑4、SNP07‑5、
SNP07‑8、SNP07‑9、SNP08‑1、SNP09‑1、SNP10‑1、SNP11‑3、SNP12‑4、SNP12‑6和SNP12‑8；

[0009] (3)进行待测西红柿基因分型和分型结果的分析的步骤。

[0010] 根据本发明的基于SNP标记组合的分型方法，优选地，所述位点集进一步包括：

[0011] SNP01‑1、SNP01‑2、SNP02‑2、SNP02‑4、SNP03‑2、SNP03‑4、SNP03‑5、SNP03‑6、SNP04‑3、SNP04‑4、SNP04‑5、SNP05‑1、SNP05‑2、SNP05‑4、SNP05‑5、SNP05‑6、SNP05‑7、
SNP06‑1、SNP06‑2、SNP06‑4、SNP06‑5、SNP07‑1、SNP07‑2、SNP07‑3、SNP07‑6、SNP07‑7、
SNP07‑10、SNP07‑11、SNP07‑12、SNP07‑13、SNP11‑1、SNP11‑2、SNP12‑1、SNP12‑2、SNP12‑3、
SNP12‑5、SNP12‑7和SNP12‑9。

[0012] 根据本发明的基于SNP标记组合的分型方法，优选地，利用由第一正向引物、第二正向引物和反向引物三条引物组成的引物组来检测基因组DNA位点集中各位点的信息。

[0013] 根据本发明的基于SNP标记组合的分型方法，优选地，利用SEQ ID NO:1‑63所示的引物进行基因组DNA中位点集的检测。

[0014] 根据本发明的基于SNP标记组合的分型方法，优选地，利用SEQ ID NO:1‑177所示的引物进行基因组DNA中位点集的检测。

[0015] 根据本发明的基于SNP标记组合的分型方法，优选地，步骤(2)包括构建含缓冲液和溶解于所述缓冲液的多个引物组的反应体系的步骤，所述反应体系中各引物组中第一正
向引物、第二正向引物和反向引物的终浓度一般为50‑200μmol/L，优选80‑150μmol/L，例如
100μmol/L。

[0016] 根据本发明的基于SNP标记组合的分型方法，优选地，步骤(2)程序性降低扩增温度进行SNP位点的检测包括：

[0017] 变性步骤，94℃变性15min；94℃变性20s；

[0018] 第一循环步骤，首先61℃、退火60s，之后每个循环降低0.6℃、退火60s，共5‑20个循环；

[0019] 第二循环步骤，94℃变性20s，55℃复性延伸60s，共26‑32个循环，优选在26个循环的基础上增加2‑5，优选3‑5个循环。

[0020] 本发明的第二方面，提供一种用于基于SNP标记进行分型的组合物，其包含用于检测由多个SNP位点组成的位点集的信息的引物，其中位点集包括SNP01‑3、SNP02‑1、SNP02‑
3、SNP03‑1、SNP03‑3、SNP04‑1、SNP04‑2、SNP05‑3、SNP06‑3、SNP06‑6、SNP07‑4、SNP07‑5、
SNP07‑8、SNP07‑9、SNP08‑1、SNP09‑1、SNP10‑1、SNP11‑3、SNP12‑4、SNP12‑6和SNP12‑8。

[0021] 根据本发明的用于基于SNP标记进行分型的组合物，优选地，所述位点集进一步包括SNP01‑1、SNP01‑2、SNP02‑2、SNP02‑4、SNP03‑2、SNP03‑4、SNP03‑5、SNP03‑6、SNP04‑3、
SNP04‑4、SNP04‑5、SNP05‑1、SNP05‑2、SNP05‑4、SNP05‑5、SNP05‑6、SNP05‑7、SNP06‑1、
SNP06‑2、SNP06‑4、SNP06‑5、SNP07‑1、SNP07‑2、SNP07‑3、SNP07‑6、SNP07‑7、SNP07‑10、
SNP07‑11、SNP07‑12、SNP07‑13、SNP11‑1、SNP11‑2、SNP12‑1、SNP12‑2、SNP12‑3、SNP12‑5、
SNP12‑7和SNP12‑9。

[0022] 本发明的第三方面，提供根据第二方面所述的组合物在西红柿品种鉴定中的用途。

[0023] 本发明的第四方面，提供用于基于SNP标记进行分型的试剂盒，其包括引物组，所述引物组包括如SEQ ID NO:1‑177所示的序列。

[0024] 本发明基于西红柿重测数据与西红柿品种全基因组序列比对产生的SNP中设计筛选出一套西红柿品种鉴定相关的SNP标记集，该套标记集包含59个SNP标记。这些SNP标记具
有良好的多态性，且稳定性和可重复性好。将SNP标记通过竞争性等位基因特异性PCR检测，
能够实现更高通量的检测过程。此外，本发明提供一套核心SNP标记集，该套标记集包含21
个SNP标记。利用该套标记集可以高效、准确地鉴定西红柿品种的真实性，保证西红柿种质
资源收集的可靠性，同时显著降低检测成本。本发明的SNP标记集特别适用于形态特征不能
区分或很难区分的品种的鉴定。

附图说明

[0025] 图1为MAF筛选前后标记随机组合区分度比较的箱线图。

[0026] 图2为标记SNP04‑1荧光读取结果示例(HC Scientific公司的Matrix Scanner扫描结果)。

[0027] 图3为MAF值区间对应的SNP个数。

[0028] 图4为缺失率区间对应的SNP个数。

具体实施方式

[0029] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0030] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之
间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围
内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立
地包括或排除在范围内。

[0031] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的
实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所
有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的
文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。

[0032] 除非另作说明，否则本发明中的基因位置或位点是指相对于西红柿品种Heinz 1706(版本号为SL3.0)而言的位置。

[0033] [利用SNP标记进行基因分型方法]

[0034] 本发明的基因分型方法包括以下步骤：

[0035] (1)提取待测西红柿的基因组DNA的步骤；

[0036] (2)基于多个SNP位点组成的位点集信息，通过程序性降低扩增温度进行待测西红柿基因组SNP位点的检测步骤；

[0037] (3)进行待测西红柿基因分型和分型结果的分析的步骤。

[0038] 步骤(1)中，用于提取待测西红柿的基因组DNA的方法不特别限定，可使用本领域已知的方法进行，基因组DNA提取方法可参考已知的教科书，例如冷泉港的《分子克隆实验
指南》第四版等公开出版物等。用于提取的西红柿样本可以是西红柿子叶或西红柿植株的
真叶、根等部位。

[0039] 步骤(2)中，获得西红柿DNA序列多态性位点的具体方式不特别限定。优选地，本发明采用基于Illumina Genome Analyzer测序系统平台进行样本的重测序。进一步包括对测
序数据的处理得到含有SNP位点的多态性数据，数据处理包括以西红柿品种Heinz 1706为
参考基因组，利用PopSeq2Geno获得SNP变异位点。

[0040] 优选地，步骤(2)中，设置如下参数以获得可靠的SNP位点：过滤掉最小等位基因频率(MAF)小于0.01，基因型缺失率(Miss Rate)大于0.2，以及SNP附近50bp内无其他变异的
位点。进一步优选地，基于平均最小等位基因频率为0.379，平均缺失率为0.002，得到SNP位
点集。在某些具体实施方案中，所述SNP位点集如表1所示。

[0041] 优选地，将SNP位点分别对应于西红柿各染色体上，然后利用公式R＝(最小等位基因频率)*0.8‑(基因型缺失率)*0.2计算各染色体中存在的每个SNP位点的R，对每条染色体
中各SNP位点的R值进行大小排序。本发明的R值仅考虑了分子标记在染色体上物理位置和
遗传距离位置，而未涉及分子标记的功能或表型特征。本发明所指的功能性状或表型包括
但不限于例如植株高度、叶片大小、果实颜色、种子或根据生理、分布区域或其它与某一生
态系统过程相关以及与物种相联系的一些生物学特性来划分的特征。本发明的方法尤其适
用于解决例如西红柿种子发育至幼苗、栽培型或半栽培型西红柿幼苗无法正确分型，导致
种质资源无法有效鉴定和分析的问题。

[0042] 优选地，经R值进行大小排序得到本发明的核心SNP位点集，所述位点集为SNP01‑3、SNP02‑1、SNP02‑3、SNP03‑1、SNP03‑3、SNP04‑1、SNP04‑2、SNP05‑3、SNP06‑3、SNP06‑6、
SNP07‑4、SNP07‑5、SNP07‑8、SNP07‑9、SNP08‑1、SNP09‑1、SNP10‑1、SNP11‑3、SNP12‑4、
SNP12‑6和SNP12‑8。

[0043] 以SNP标记为基础的西红柿品种鉴定分析方面的报道较为少见。SNP标记的检测方法有很多种，本发明采用竞争性等位基因特异性PCR进行相关检测，国内外已经推出许多自
动化程度高的检测平台。因此，开发出具有普遍代表性的西红柿SNP标记，可为西红柿品种
的真实性鉴定、种质的收集和规模化管理提供技术支持，节约时间成本，提高工作效率。

[0044] 优选地，本发明利用由第一正向引物、第二正向引物和反向引物三条引物组成的引物组来检测基因组DNA位点集中各位点的信息。进一步优选地，利用SEQ ID NO:1‑63所示
的引物进行基因组DNA中位点集的检测。还优选地，利用SEQ ID NO:64‑177所示的引物进行
基因组DNA中位点集的检测。

[0045] 优选地，步骤(2)包括构建包含缓冲液和溶解于所述缓冲液的多个引物组的反应体系的步骤。反应体系中各引物的浓度不特别限定，一般在50‑200μmol/L之间，优选80‑150
μmol/L之间，例如100μmol/L。该浓度为初始浓度，当引物为干粉时，可以将干粉稀释到100μ
mol/L作为储存液。在使用前通过按规定比例稀释储存液后与其他成分混合得到反应体系
作为工作液。例如，可将各引物组中第一正向引物、第二正向引物和反向引物的浓度制备为
100μmol/L作为储存液。三种引物可以制备为三种不同的储存液，也可将三种引物制备为同
时含三种引物的同一储存液。在构建反应体系时，可将第一正向引物溶液、第二正向引物溶
液和反向引物溶液以特定的体积比，例如(10‑15):(10‑15):(28‑32)的体积比混合。进一步
优选地，第一正向引物、第二正向引物和反向引物的溶液体积比为(11‑14):(11‑14):(29‑
31)。还优选地，第一正向引物、第二正向引物和反向引物的溶液体积比为(11‑13):(11‑
13):(29‑31)。

[0046] 反应体系的总体积不限定，可以是任何适合的体积。在示例性反应体系中，总体系‑1
约5μL，具体可为基因组DNA2.5μL(60ng·μL )，引物混合液0.07μL，LGC公司的KASP V4.0 2
×Master Mix 2.5μL，适用于384孔板。在另一示例性反应中，反应总体系为10μL，具体可为
‑1
基因组DNA 5μL(60ng·μL )，引物混合液0.14μL，LGC公司的KASP V4.02×Master Mix 5μ
L，适用于96孔板。引物混合液由第一正向引物A1、第二正向引物A2、反向引物C、ddH2O按照
12:12:30:46的体积比混合得到(各引物初始浓度均为100μmol/L)。试验时可设置水的空白
对照。

[0047] 本发明通过程序性降低扩增温度进行待测西红柿基因组SNP位点的检测步骤。开始前先用高温扩增，保证扩增的严谨性，待目的基因的丰度上升后，降低扩增的温度，从而
提高扩增的效率。另外，避免了非特异性PCR产物的出现，尤其是当使用复杂的基因组DNA模
板，非特异性退火易发生时。优选地，其包括变性步骤，94℃变性15min；94℃变性20s；第一
循环步骤，首先61℃、退火60s，之后每个循环降低0.6℃、退火60s，共10个循环；第二循环步
骤，94℃变性20s，55℃复性延伸60s，共25‑32个循环，优选25‑30个循环，还优选25‑27，例如
26个循环。根据实际分型结果，可以适当增加3‑5个循环。

[0048] [用于基因分型的组合物]

[0049] 本发明的第二方面，提供用于基于SNP标记进行分型的组合物，该组合物包含用于检测由多个SNP位点组成的位点集的信息的引物，其中位点集包括SNP01‑3、SNP02‑1、
SNP02‑3、SNP03‑1、SNP03‑3、SNP04‑1、SNP04‑2、SNP05‑3、SNP06‑3、SNP06‑6、SNP07‑4、
SNP07‑5、SNP07‑8、SNP07‑9、SNP08‑1、SNP09‑1、SNP10‑1、SNP11‑3、SNP12‑4、SNP12‑6和
SNP12‑8。

[0050] 优选地，所述位点集进一步包括SNP01‑1、SNP01‑2、SNP02‑2、SNP02‑4、SNP03‑2、SNP03‑4、SNP03‑5、SNP03‑6、SNP04‑3、SNP04‑4、SNP04‑5、SNP05‑1、SNP05‑2、SNP05‑4、
SNP05‑5、SNP05‑6、SNP05‑7、SNP06‑1、SNP06‑2、SNP06‑4、SNP06‑5、SNP07‑1、SNP07‑2、
SNP07‑3、SNP07‑6、SNP07‑7、SNP07‑10、SNP07‑11、SNP07‑12、SNP07‑13、SNP11‑1、SNP11‑2、
SNP12‑1、SNP12‑2、SNP12‑3、SNP12‑5、SNP12‑7和SNP12‑9。

[0051] [用途]

[0052] 本发明的第三方面，提供第二方面所述的组合物在西红柿品种鉴定中的用途。

[0053] 本发明的第四方面，提供用于基于SNP标记进行分型的试剂盒，其包括引物组，所述引物组包括如SEQ ID NO:1‑177所示的序列。

[0054] 实施例

[0055] 1.与西红柿品种鉴定相关SNP标记的开发

[0056] 本发明中的SNP标记是基于38份西红柿重测序数据与西红柿品种Heinz 1706(版本号为SL3.0)全基因组序列比对得到的。具体地，分别提取38份西红柿基因组DNA，浓度范
围在900‑1200ng/ul，每个样品10ng在测序公司的Illumina Genome Analyzer测序系统平
台上进行重测序。

[0057] 首先使用fastp软件进行测序数据的过滤，过滤掉质量值小于10超过30％，含接头，未测出碱基比例超过10％的序列。以西红柿品种Heinz 1706(版本号为SL3.0)为参考基
因组，利用PopSeq2Geno获得SNP变异位点，初步过滤掉最小等位基因频率小于0.01，基因型
缺失率大于0.2，以及SNP附近50bp内无其他变异的位点从而获得可靠的上万个SNP位点。

[0058] 将这些SNP位点分别对应于西红柿各染色体上，然后利用公式R＝(最小等位基因频率)*0.8‑(基因型缺失率)*0.2计算各染色体中存在的每个SNP位点的R，对每条染色体中
各SNP位点的R值进行大小排序。选择分布在西红柿各染色体上R值最大的位点，共计120个
转化为竞争性等位基因特异性PCR标记。

[0059] 接下来，分析MAF筛选前后标记随机组合区分度对比。具体地，将Python脚本计算的MAF筛选前后标记数梯度对应的100种标记随机组合的区分度，利用R绘制成箱线图。MAF
筛选前为83个标记，MAF筛选后为59个标记。

[0060] MAF过滤前，标记数为50时，100种可能的平均区分度为241份样品的99.17％，标记数为40时，平均区分度为96.03％，标记数为30时，平均区分度为93.9％，标记数为20时，平
均区分度为90.3％，标记数为10时，平均区分度为75.04％。MAF过滤后，标记数为80时，100
种可能的平均区分度为241份样品的98.96％，标记数为70时，平均区分度为98.34％，标记
数为60时，平均区分度为97.51％，标记数为50时，平均区分度为96.39％，标记数为40时，平
均区分度为94.68％，标记数为30时，平均区分度为92.15％，标记数为20时，平均区分度为
88.81％，标记数为10时，平均区分度为69.97％。

[0061] 结果如图1所示，MAF筛选后的59个标记的区分度与MAF筛选前83个标记的区分度相同，均为99.59％。同时，MAF筛选后标记随机组合的区分度均比MAF筛选前标记随机组合
的区分度高。59个标记如下表1所示：

[0062] 表1

[0063]

[0064]

[0065] 平均最小等位基因频率(MAF)为0.379，平均缺失率(Miss Rate)为0.002。

[0066] 基于241份西红柿材料的竞争性等位基因特异性PCR分型结果数据的分析，将上述59个SNP标记利用生物信息学的方法进行标记的随机组合，并随机输出标记数为50、40、30、
20、10分别对应的100种可能的组合。标记数为50时，100种可能的平均区分度为241份样品
的99.17％，标记数为40时，100种可能的平均区分度为241份样品的96.03％，标记数为30
时，100种可能的平均区分度为241份样品的93.9％，标记数为20时，100种可能的平均区分
度为241份样品的90.3％，标记数为10时，100种可能的平均区分度为241份样品的75.04％。
为确保品种的区分度在90％以上，且考虑标记在染色体上物理位置和遗传距离位置，最终
选出得到具有优异效果的由21个SNP标记组成的核心标记集。该套核心标记的区分度为241
份样品的92.53％。

[0067] 3.基于本发明的SNP标记进行基因分型方法：

[0068] 3.1提取西红柿基因组DNA。

[0069] 3.2构建PCR反应体系：

[0070] 总体系约5μL，具体可为基因组DNA 5ng，引物混合液0.07μL，LGC公司的KASP V4.0 2×Master Mix 2.5μL，加ddH2O补至5μL，适用于384孔板。

[0071] 反应总体系为10μL，具体可为基因组DNA 10ng，引物混合液0.14μL，LGC公司的KASP V4.0 2×Master Mix 5μL，加ddH2O补至10μL，适用于96孔板。引物混合液由正向引物
A1、正向引物A2、反向引物C、ddH2O按照12:12:30:46的体积比混合的到(各引物初始浓度均
为100μmol/L)。试验时可设置水的空白对照。

[0072] 本发明提供用于PCR扩增西红柿SNP标记的引物对，引物包含59个引物组，每个引物组用于扩增对应的SNP标记，由两条正向引物(A1/A2)和一条反向引物组成，正向引物A1
的5’端加上FAM荧光接头(GAAGGTGACCAAGTTCATGCT)，正向引物A2的5’端加上VIC荧光接头
(GAAGGTCGGAGTCAACGGATT)。具体如序列SEQ ID NO:1‑177所示。

[0073] 4.PCR扩增的程序

[0074] 94℃变性15min；94℃变性20s，61℃(每循环降低0.6℃)退火60s，共10个循环；

[0075] 94℃变性20s，55℃复性延伸60s，共25‑32个循环，优选25‑30个循环，还优选25‑27，例如26个循环。

[0076] 荧光数据的读取和分析可利用Applied Biosystems公司的Scientific TM
QuantStudio 12K Flex实时PCR系统进行，荧光数据读取温度为30℃，读取时间为60s，荧光
为FAM和HEX荧光。也可以使用HC Scientific公司的GeneMatrix基因分型系统，或其他能进
行竞争性等位基因特异性PCR实验的PCR系统。其中，图2为标记SNP04‑1荧光读取结果(HC 
Scientific公司的Matrix Scanner扫描结果)。图3为MAF值区间对应的SNP个数。图4为缺失
率区间对应的SNP个数。

[0077] 本发明的标记集包含59个SNP标记。所述59个SNP标记具有良好的多态性，且稳定性和可重复性好，将SNP标记通过竞争性等位基因特异性PCR技术检测，检测过程更加高通
量。利用该套标记集可以高效、准确地鉴定西红柿品种的真实性，保证西红柿种质资源收集
的可靠性。