用于检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器及其制备方法转让专利
申请号 : CN202011021398.9
文献号 : CN112147200B
文献日 : 2021-11-02
发明人 : 陈智栋 , 周利君 , 单学凌 , 蒋鼎 , 王文昌
申请人 : 常州大学
摘要 :
本发明属于电化学发光检测领域，具体涉及一种用于检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器及其制备方法。将适配体负载于复合材料Au@HKUST‑1/PTC‑Cys修饰玻碳电极的表面，利用Au@HKUST‑1与PTC‑Cys之间的Au‑S键结合共同修饰到玻碳电极表面，使得电化学发光的灵敏度和稳定性显著提高，再负载适配体进而获得电化学发光适配体传感器，可特异性识别目标分子卡那霉素，提高了对卡那霉素检测的选择性。本发明电化学发光适配体传感器的检测范围为1.0×10‑13～1.0×10‑8M，最低检测限为4.2×10‑14M。修饰电极的制备方法简单，对卡那霉素检测的灵敏度高，选择性好，线性范围宽。
权利要求 :
1.一种用于检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器，其特征在于，所述电化学发光适配体传感器由适配体负载于复合材料Au@HKUST‑1/PTC‑Cys修饰玻碳电极的表面制备而成；
电化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于，所述方法通过Au‑S键结合作用将适配体负载在Au@HKUST‑1/PTC‑Cys复合材料修饰的玻碳电极表面，自然晾干，制得电化学发光适配体传感器；
所述复合材料Au@HKUST‑1/PTC‑Cys修饰玻碳电极的制备方法如下：S1.PTC‑Cys的制备：将苝四羧酸二酐溶解于氢氧化钠的水溶液中，然后向其中加入HCl，得到红色沉淀物，将红色沉淀物用去离子水洗涤以除去过量的反应物，然后经分散得到PTCA溶液，向PTCA溶液中依次加入1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与N‑羟基丁二酰亚胺，并加入L‑半胱氨酸，继续搅拌，然后通过离心、干燥，制得粉红色粉末状产物PTC‑Cys；将PTC‑Cys分散于DMF中，使其分散均匀，得到PTC‑Cys的DMF分散液；
S2.Au@HKUST‑1的制备：将苯三甲酸、N,N‑二甲基甲酰胺与Au@Cu2O异质结的乙醇溶液混合，将混合物搅拌过夜，离心分离、洗涤，得到Au@HKUST‑1，将Au@HKUST‑1分散于N,N‑二甲基甲酰胺里，超声使其分散均匀，得到Au@HKUST‑1的DMF分散液；
S3.将玻碳电极抛光，依次用硝酸溶液、乙醇溶液和超纯水超声清洗，室温下吹干，获得前处理后的玻碳电极待用；依次移取步骤S1中PTC‑Cys的DMF分散液和步骤S2中的Au@HKUST‑1的DMF分散液并将其滴涂在经前处理后的玻碳电极表面，自然晾干，得到所述Au@HKUST‑1/PTC‑Cys复合材料修饰的玻碳电极。
2.根据权利要求1所述的电化学发光适配体传感器，其特征在于，所述适配体为含有
5'‑AGATGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA‑3'碱基序列的适配体。
3.根据权利要求1所述的电化学发光适配体传感器，其特征在于，所述步骤S1中1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与N‑羟基丁二酰亚胺的摩尔比为1:1‑4:1；所得PTC‑Cys的DMF分散液的浓度为1mg/mL。
4.根据权利要求1所述的电化学发光适配体传感器，其特征在于，所述步骤S2所得Au@HKUST‑1的DMF分散液的浓度为1mg/mL。
5.根据权利要求1所述的电化学发光适配体传感器，其特征在于，所述步骤S3中PTC‑Cys和Au@HKUST‑1的复合修饰的体积比为：4:1‑4:5。
6.根据权利要求1所述的电化学发光适配体传感器，其特征在于，所述将适配体负载在Au@HKUST‑1/PTC‑Cys纳米复合材料修饰的玻碳电极表面的具体方法为：首先向含有KCl、NaCl、MgCl2和乙二胺四乙酸的Tris‑HCl缓冲溶液中加入适配体，配制适配体浓度为2～10μM的适配体溶液，然后移取所述适配体溶液并将其滴涂在所述Au@HKUST‑1/PTC‑Cys复合材料修饰的玻碳电极表面。
7.根据权利要求1所述的电化学发光适配体传感器的应用方法，其特征在于，所述方法为：以电化学发光适配体传感器作为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极组成三电极体系，样品中的卡那霉素被定量捕捉到传感器的表面，通过产生的发光信号实现卡那霉素的检测。
8.根据权利要求7所述的电化学发光适配体传感器的应用方法，其特征在于，所述应用方法的具体步骤为：
A1.含K2S2O8的PBS缓冲溶液的配制：用pH为7.4的0.1M的PBS缓冲溶液配制含0.05M K2S2O8的PBS缓冲溶液；
‑4
A2.不同浓度的卡那霉素标准溶液的配制：首先配制1×10 M的卡那霉素溶液，用超纯水溶解，然后用超纯水稀释得到不同浓度的卡那霉素标准溶液，卡那霉素标准溶液的浓度‑13 ‑8
范围为1.0×10 ～1.0×10 M；
A3.标准曲线的绘制：将所述电化学发光适配体传感器置于步骤A2配制的不同浓度的卡那霉素标准溶液中浸泡相同时间，使电化学发光适配体传感器结合卡那霉素，然后取出并淋洗，作为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，组成三电极体系，以步骤A1中的含K2S2O8的PBS缓冲溶液为电解液，在‑1.7～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压
800V，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录发光强度‑时间曲线，建立电化学发光适配体传感器结合卡那霉素前后的发光强度差值与卡那霉素标准溶液中的卡那霉素浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程；
A4.样品中卡那霉素的检测：所述样品先经过预处理再用步骤A1中的含K2S2O8的PBS缓冲溶液调节pH，然后放入电化学发光适配体传感器浸泡相同时间，使电化学发光适配体传感器结合卡那霉素，然后取出并淋洗，作为工作电极，再采用步骤A3方法检测发光强度，再根据线性回归方程计算出样品中卡那霉素的浓度。
说明书 :
用于检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于电化学发光检测领域，具体涉及一种用于检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器及其制备方法。
背景技术
[0002] 食品安全问题已经严重影响了人们的生活。对食品安全的监测显得十分重要。卡那霉素(KAN)，是一种氨基糖苷类抗生素，具有潜在的毒性，过度使用KAN会对人类和动物机
体产生严重的副作用，包括耳毒性、肾毒性和过敏性休克，会影响消费者的健康。为了提高
人们对抗生素残留物危害的认识并有效保护人体健康，欧盟明确规定，牛奶中卡那霉素的
‑1
最大残留限量(MRL)为150μg·kg ，由于不合理使用卡那霉素会导致肉类，奶制品以及其他
动物源性食品中的残留物，这些残留物会通过生物循环系统进入人体，危害人体健康，并可
能危害公共健康。因此，加强卡那霉素残留的检测具有重要意义。
体产生严重的副作用，包括耳毒性、肾毒性和过敏性休克，会影响消费者的健康。为了提高
人们对抗生素残留物危害的认识并有效保护人体健康，欧盟明确规定，牛奶中卡那霉素的
‑1
最大残留限量(MRL)为150μg·kg ，由于不合理使用卡那霉素会导致肉类，奶制品以及其他
动物源性食品中的残留物，这些残留物会通过生物循环系统进入人体，危害人体健康，并可
能危害公共健康。因此，加强卡那霉素残留的检测具有重要意义。
[0003] 现有技术中，常用的检测卡那霉素的方法主要有高效液相色谱、酶联免疫吸附法、液相色谱法、气相色谱法、电化学法等，但是这些方法普遍存在实验操作较复杂和耗时长等
缺点，难以推广到市场中进行现场检测。
缺点，难以推广到市场中进行现场检测。
[0004] 现有的适配体传感器检测灵敏性高，但检测费用较高，测定时间长，且结果误差较大。因此，建立成本低、灵敏度高、选择性高且可用于食品安全现场快速检测的卡那霉素检
测技术十分必要。
测技术十分必要。
发明内容
[0005] 鉴于背景技术中指出的现有卡那霉素的检测中存在的缺陷，本发明开发了一种检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器，以提高卡那霉素的检测效率，提高其灵敏度与选
择性，使其更具有实用性。
择性，使其更具有实用性。
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种具有灵敏度高、重现性好、选择性好和线性范围宽的优点的检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器。
[0007] 本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
[0008] 本发明提出的检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器，是由适配体负载于复合材料Au@HKUST‑1/PTC‑Cys修饰玻碳电极的表面制备而成。本发明充分利用PTC‑Cys与Au@
HKUST‑1之间的Au‑S键结合作用共同修饰到玻碳电极表面，使得电化学发光的灵敏度和稳
定性显著提高，再负载适配体进而获得电化学发光适配体传感器(简称Aptamer/Au@HKUST‑
1/PTC‑Cys/GCE传感器)，可特异性识别目标分子卡那霉素，提高了对卡那霉素检测的选择
性。
HKUST‑1之间的Au‑S键结合作用共同修饰到玻碳电极表面，使得电化学发光的灵敏度和稳
定性显著提高，再负载适配体进而获得电化学发光适配体传感器(简称Aptamer/Au@HKUST‑
1/PTC‑Cys/GCE传感器)，可特异性识别目标分子卡那霉素，提高了对卡那霉素检测的选择
性。
[0009] 其中，适配体是含有5'‑AGATGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA‑3'碱基序列的适配体。
[0010] 单独修饰PTC‑Cys在电极表面，电化学发光响应强度不高且不稳定，当负载Au@HKUST‑1后，复合物通过Au‑S键的结合作用，使复合材料的性能更加稳定，将电极浸泡在过
硫酸钾溶液中，电极上的复合材料不会脱落，所以可以提高传感器的稳定性。
硫酸钾溶液中，电极上的复合材料不会脱落，所以可以提高传感器的稳定性。
[0011] 复合材料Au@HKUST‑1/PTC‑Cys修饰玻碳电极的制备方法如下：
[0012] S1.PTC‑Cys的制备：将0.1g苝四羧酸二酐(PTCDA)溶解在含有0.04g NaOH的20mL水溶液中，接着，将1M的HCl溶液缓慢的加入上述溶液中直至有鲜红色的沉淀生成，用去离
子水洗涤沉淀数次，直至悬浊液pH值约等于7，烘干洗涤后的沉淀物(PTCA)备用。
子水洗涤沉淀数次，直至悬浊液pH值约等于7，烘干洗涤后的沉淀物(PTCA)备用。
[0013] 准确称取5mg上述制备的PTCA，分散在10mL去离子水中，超声分散均匀后，在冰水浴中搅拌30min，并加入1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)与N‑羟基丁
二酰亚胺(NHS)，继续搅拌2h，以活化羧基，随后，加入100mg半胱氨酸，搅拌过夜，最后，通过
离心收集产物PTC‑Cys。将PTC‑Cys分散于DMF中，使其分散均匀，得到PTC‑Cys的DMF分散液；
二酰亚胺(NHS)，继续搅拌2h，以活化羧基，随后，加入100mg半胱氨酸，搅拌过夜，最后，通过
离心收集产物PTC‑Cys。将PTC‑Cys分散于DMF中，使其分散均匀，得到PTC‑Cys的DMF分散液；
[0014] 其中，1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)与N‑羟基丁二酰亚胺(NHS)(m/m＝1:1‑4:1)。
[0015] 所得PTC‑Cys的DMF分散液的浓度为1mg/mL。
[0016] S2.Au@HKUST‑1的制备：
[0017] Cu2O的合成：将0.2g聚乙烯吡咯烷酮(PVP(K30))加入100mL 0.01M三水合硝酸铜(Cu(NO3)2·3H2O)，然后加入25mL 1.5M氢氧化钠(NaOH)溶液，立即产生蓝色沉淀，搅拌，加
入25mL 0.1M的抗坏血酸，15min后，Cu2O沉淀生成，分散于乙醇中；
入25mL 0.1M的抗坏血酸，15min后，Cu2O沉淀生成，分散于乙醇中；
[0018] Au@Cu2O异质结构：移取10mL上述制备的3mg/mL的Cu2O醇溶液，加入10mL3 mM的氯金酸(HAuCl4)静置，离心收集产物(8000rpm，5min)，洗涤得到Au@Cu2O异质结构，分散于乙醇
中。
中。
[0019] 将5mL 0.16M均苯三甲酸(H3BTC)、5mL N,N‑二甲基甲酰胺(DMF)与10mL上述制得的10mg/mL的Au@Cu2O异质结的乙醇溶液混合，将混合物搅拌过夜，离心分离、洗涤，干燥得
到绿色晶体Au@HKUST‑1；将Au@HKUST‑1分散于DMF里，超声使其分散均匀，得到Au@HKUST‑1
的DMF分散液；
到绿色晶体Au@HKUST‑1；将Au@HKUST‑1分散于DMF里，超声使其分散均匀，得到Au@HKUST‑1
的DMF分散液；
[0020] Au@HKUST‑1的DMF分散液的浓度为1mg/mL。
[0021] S3.将玻碳电极抛光，依次用硝酸溶液、乙醇溶液和超纯水超声清洗，室温下吹干，获得前处理后的玻碳电极待用；用微量注射器依次移取步骤S1中的PTC‑Cys的DMF分散液和
步骤S2中的Au@HKUST‑1的DMF分散液并将其滴涂在经前处理后的玻碳电极表面，自然晾干，
得到所述Au@HKUST‑1/PTC‑Cys复合材料修饰的玻碳电极。
步骤S2中的Au@HKUST‑1的DMF分散液并将其滴涂在经前处理后的玻碳电极表面，自然晾干，
得到所述Au@HKUST‑1/PTC‑Cys复合材料修饰的玻碳电极。
[0022] 其中，PTC‑Cys和Au@HKUST‑1的复合修饰的体积比为：4:1‑4:5。
[0023] 本发明的第二个目的是提供一种检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器的制备方法。
[0024] 本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
[0025] 本发明提供的检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器的制备方法，通过金硫键结合作用将适配体负载在所述Au@HKUST‑1/PTC‑Cys复合材料修饰的玻碳电极表面，自然晾
干，制得电化学发光适配体传感器。
干，制得电化学发光适配体传感器。
[0026] 将适配体负载在Au@HKUST‑1/PTC‑Cys复合材料修饰的玻碳电极表面的具体方法为：首先向含有KCl、NaCl、MgCl2和乙二胺四乙酸的Tris‑HCl缓冲溶液中加入适配体，配制
适配体浓度为2～10μM的适配体溶液，然后移取所述适配体溶液并将其滴涂在所述Au@
HKUST‑1/PTC‑Cys纳米复合材料修饰的玻碳电极表面。
适配体浓度为2～10μM的适配体溶液，然后移取所述适配体溶液并将其滴涂在所述Au@
HKUST‑1/PTC‑Cys纳米复合材料修饰的玻碳电极表面。
[0027] 进一步的，适配体溶液中适配体的浓度为8μM。
[0028] 本发明的第三个目的是提供一种检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器的应用方法。
[0029] 本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
[0030] 本发明提供的检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器的具体方法，以电化学发光适配体传感器作为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极组成三电极体系，
样品中的卡那霉素被定量捕捉到传感器的表面，通过产生的发光信号实现卡那霉素的检
测。
样品中的卡那霉素被定量捕捉到传感器的表面，通过产生的发光信号实现卡那霉素的检
测。
[0031] 进一步的，具体步骤为：
[0032] A1.含K2S2O8的PBS缓冲溶液的配制：用pH为7.4的0.1M的PBS缓冲溶液配制含0.05M K2S2O8的PBS缓冲溶液；
[0033] A2.不同浓度的卡那霉素标准溶液的配制：首先配制1×10‑4M的卡那霉素溶液，用超纯水溶解，然后用水稀释得到若干不同浓度的卡那霉素标准溶液，卡那霉素标准溶液的
‑13 ‑8
浓度范围为1.0×10 ～1.0×10 M；
‑13 ‑8
浓度范围为1.0×10 ～1.0×10 M；
[0034] A3.标准曲线的绘制：将所述电化学发光适配体传感器置于步骤A2配制的不同浓度的卡那霉素标准溶液中浸泡相同时间，使电化学发光适配体传感器结合卡那霉素，然后
取出并淋洗，作为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，组成三电极体系，以步
骤A1中的含K2S2O8的PBS缓冲溶液为电解液，在‑1.7～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管
高压800V，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录发光强度‑时间曲线，建立电化学发光适配
体传感器结合卡那霉素前后的发光强度差值与卡那霉素标准溶液中的卡那霉素浓度对数
值的线性关系，得到相应的线性回归方程；
取出并淋洗，作为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，组成三电极体系，以步
骤A1中的含K2S2O8的PBS缓冲溶液为电解液，在‑1.7～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管
高压800V，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录发光强度‑时间曲线，建立电化学发光适配
体传感器结合卡那霉素前后的发光强度差值与卡那霉素标准溶液中的卡那霉素浓度对数
值的线性关系，得到相应的线性回归方程；
[0035] A4.样品中卡那霉素的检测：所述样品先经过预处理再用步骤A1中的含K2S2O8的PBS缓冲溶液调节pH，然后向所制备的不同浓度的卡那霉素放入电化学发光适配体传感器
浸泡相同时间，使电化学发光适配体传感器结合卡那霉素，然后取出并淋洗，作为工作电
极，再采用步骤A3方法检测发光强度，再根据线性回归方程计算出样品中卡那霉素浓度。
浸泡相同时间，使电化学发光适配体传感器结合卡那霉素，然后取出并淋洗，作为工作电
极，再采用步骤A3方法检测发光强度，再根据线性回归方程计算出样品中卡那霉素浓度。
[0036] 进一步的，步骤A3中浸泡时间为25min。
[0037] 综上所述，本发明具有以下有益效果：
[0038] 本发明设计了一种基于Per衍生物PTC‑Cys与掺杂金纳米粒子的铜基金属有机框架Au@HKUST‑1复合材料的电化学发光适配体传感器，两种材料通过Au‑S键的结合，可以获
得稳定的电化学发光性能，该发明充分利用了适配体和电化学发光传感器的优势，通过卡
那霉素对该体系ECL信号强度的增强的效果，成功实现对卡那霉素的灵敏检测，该传感平台
‑13 ‑
可特异性识别检测物卡那霉素，具有高选择性。本发明的检测范围为1.0×10 ～1.0×10
8 ‑14
M，最低检测限为4.2×10 M。本发明检测卡那霉素的操作简单、选择性好、检测成本低、灵
敏度高。本发明对推广适配体传感器在食品安全方面的实际应用具有重要的意义。
得稳定的电化学发光性能，该发明充分利用了适配体和电化学发光传感器的优势，通过卡
那霉素对该体系ECL信号强度的增强的效果，成功实现对卡那霉素的灵敏检测，该传感平台
‑13 ‑
可特异性识别检测物卡那霉素，具有高选择性。本发明的检测范围为1.0×10 ～1.0×10
8 ‑14
M，最低检测限为4.2×10 M。本发明检测卡那霉素的操作简单、选择性好、检测成本低、灵
敏度高。本发明对推广适配体传感器在食品安全方面的实际应用具有重要的意义。
附图说明
[0039] 图1为本发明中的电化学发光适配体传感器的制备及对卡那霉素的检测的简要流程图。
[0040] 图2为实施例1中所构建的电化学发光适配体传感器在与不同浓度的卡那霉素结‑13 ‑12
合后的ECL响应图，其中卡那霉素的浓度从左到右依次为：(a)1.0×10 M；(b)1.0×10 M；
‑11 ‑10 ‑9 ‑8
(c)1.0×10 M；(d)1.0×10 M；(e)1.0×10 M；(f)1.0×10 M。
合后的ECL响应图，其中卡那霉素的浓度从左到右依次为：(a)1.0×10 M；(b)1.0×10 M；
‑11 ‑10 ‑9 ‑8
(c)1.0×10 M；(d)1.0×10 M；(e)1.0×10 M；(f)1.0×10 M。
[0041] 图3为实施例1加入卡那霉素前后发光强度的差值与卡那霉素浓度对数值的标准曲线；
[0042] 图4是实施例1中制备的Au@HKUST‑1/PTC‑Cys复合材料的扫描电镜图；
[0043] 图5是实施例1中制备的传感器Aptamer/Au@HKUST‑1/PTC‑Cys/GCE连续循环扫描15圈的电化学发光稳定性表征图；
[0044] 图6是实施例3在酰胺化反应中，EDC与NHS的比例为4:1(m/m)的优选表征图；图中，曲线a代表EDC:NHS＝1:1(m/m)，曲线b需代表EDC:NHS＝4:1(m/m)；
[0045] 图7是实施例4中适配体浓度的优化表征图。
具体实施方式
[0046] 下面结合实施例对本发明做进一步描述，但不限于此。
[0047] 以下实施例中，含有5'‑AGATGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA‑3'碱基序列的适配体购自生工生物工程(上海)股份有限公司，将该适配体负载在Au@HKUST‑1/PTC‑Cys复合材料修饰的
玻碳电极表面的方法为：首先向含有KCl、NaCl、MgCl2和乙二胺四乙酸的Tris‑HCl缓冲溶液
中加入所述适配体，配制适配体溶液，然后移取所述适配体溶液并将其滴涂在所述的Au@
HKUST‑1/PTC‑Cys复合材料修饰的玻碳电极表面。具体的：
玻碳电极表面的方法为：首先向含有KCl、NaCl、MgCl2和乙二胺四乙酸的Tris‑HCl缓冲溶液
中加入所述适配体，配制适配体溶液，然后移取所述适配体溶液并将其滴涂在所述的Au@
HKUST‑1/PTC‑Cys复合材料修饰的玻碳电极表面。具体的：
[0048] A1.采购的适配体开盖前先涡旋振荡10min，再以4000rpm离心20min；
[0049] A2.慢慢打开管盖，依照管上的标注，加入1020微升含有0.2mol/L KCl、0.1mol/L NaCl、5.0mmol/L MgCl2和1.0mmol/L乙二胺四乙酸的0.05M Tris‑HCl缓冲溶液的储备溶
液；
液；
[0050] A3.充分振荡均匀，稀释到10μM的浓度，放于4℃冰箱冷藏待用。
[0051] 以下实施例中不同浓度的卡那霉素标准溶液的配制方法为：配制卡那霉素溶液，然后用超纯水进行稀释，得到一系列不同浓度的卡那霉素标准溶液，本实施例中卡那霉素
‑13 ‑12 ‑11
标准溶液中卡那霉素的浓度分别为(a)1.0×10 M；(b)1.0×10 M；(c)1.0×10 M；(d)
‑10 ‑9 ‑8
1.0×10 M；(e)1.0×10 M；(f)1.0×10 M。
‑13 ‑12 ‑11
标准溶液中卡那霉素的浓度分别为(a)1.0×10 M；(b)1.0×10 M；(c)1.0×10 M；(d)
‑10 ‑9 ‑8
1.0×10 M；(e)1.0×10 M；(f)1.0×10 M。
[0052] 实施例1
[0053] (一)组装检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器
[0054] (1)PTC‑Cys与Au@HKUST‑1材料的制备：
[0055] S1.前驱体PTCA的制备，将0.1g PTCDA溶解在含有0.04g NaOH的20mL水溶液中，接着，将1M的HCl溶液缓慢的加入上述溶液中直至有鲜红色的沉淀生成，用去离子水洗涤沉淀
数次，直至悬浊液pH值约等于7，烘干备用。准确称取5mg上述制备的PTCA，分散在10mL去离
子水中，超声分散均匀后，在冰水浴中搅拌30min，并加入40mg EDC与10mg NHS(m/m＝4:1)，
继续搅拌2h，以活化羧基，随后，加入100mg半胱氨酸，搅拌过夜，最后，通过离心收集产物为
PTC‑Cys；将PTC‑Cys分散于DMF中，使其分散均匀，得到浓度为1mg/mL的PTC‑Cys的DMF分散
液。
数次，直至悬浊液pH值约等于7，烘干备用。准确称取5mg上述制备的PTCA，分散在10mL去离
子水中，超声分散均匀后，在冰水浴中搅拌30min，并加入40mg EDC与10mg NHS(m/m＝4:1)，
继续搅拌2h，以活化羧基，随后，加入100mg半胱氨酸，搅拌过夜，最后，通过离心收集产物为
PTC‑Cys；将PTC‑Cys分散于DMF中，使其分散均匀，得到浓度为1mg/mL的PTC‑Cys的DMF分散
液。
[0056] S2.制备Au@HKUST‑1
[0057] Cu2O的合成：0.2g聚乙烯吡咯烷酮(PVP(K30))加入100mL 0.01M三水合硝酸铜(Cu(NO3)2·3H2O)，然后加入25mL 1.5M氢氧化钠(NaOH)溶液，立即产生蓝色沉淀，搅拌，加入
0.4403g的抗坏血酸，15min后，Cu2O沉淀生成，分散于乙醇中；
0.4403g的抗坏血酸，15min后，Cu2O沉淀生成，分散于乙醇中；
[0058] Au@Cu2O异质结构：移取10mL上述制备的3mg/mL的Cu2O醇溶液，加入10mL3 mM的氯金酸(HAuCl4)静置，离心收集产物(8000rpm，5min)，洗涤得到Au@Cu2O异质结构，分散于乙醇
中。
中。
[0059] 5mL 0.16M H3BTC、5mL DMF与上述制得的10mL10 mg/mL Au@Cu2O异质结的乙醇溶液混合，将混合物搅拌过夜，离心分离、洗涤，得到Au@HKUST‑1；将Au@HKUST‑1分散于DMF里，
超声使其分散均匀，得到1mg/mL Au@HKUST‑1的DMF分散液。
超声使其分散均匀，得到1mg/mL Au@HKUST‑1的DMF分散液。
[0060] (2)检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器的制备
[0061] 首先将玻碳电极用抛光粉(Al2O3)在麂皮上打磨成镜面后，依次用硝酸溶液、乙醇溶液和超纯水超声清洗3min，室温下吹干获得预处理后的玻碳电极。用微量注射器依次移
取步骤(1)中制得的4μL 1mg/mL的PTC‑Cys的DMF分散液，待自然晾干后，再滴涂3μL 1mg/mL
的Au@HKUST‑1的DMF分散液，自然晾干后得到Au@HKUST‑1/PTC‑Cys/GCE修饰电极，自然晾干
待用；在Au@HKUST‑1/PTC‑Cys/GCE修饰电极表面再滴涂5μL配制好的含适配体的Tris‑HCl
缓冲溶液，自然晾干10h，得到Aptamer/Au@HKSUT‑1/PTC‑Cys/GCE传感器，作为电化学发光
测试的传感元件。
取步骤(1)中制得的4μL 1mg/mL的PTC‑Cys的DMF分散液，待自然晾干后，再滴涂3μL 1mg/mL
的Au@HKUST‑1的DMF分散液，自然晾干后得到Au@HKUST‑1/PTC‑Cys/GCE修饰电极，自然晾干
待用；在Au@HKUST‑1/PTC‑Cys/GCE修饰电极表面再滴涂5μL配制好的含适配体的Tris‑HCl
缓冲溶液，自然晾干10h，得到Aptamer/Au@HKSUT‑1/PTC‑Cys/GCE传感器，作为电化学发光
测试的传感元件。
[0062] 其中，适配体溶液中适配体的浓度为8μM。
[0063] (二)检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器的应用方法
[0064] A1.含K2S2O8的PBS缓冲溶液的配制：
[0065] 用pH为7.4的0.1M的PBS缓冲溶液配制含0.05M K2S2O8的PBS缓冲溶液；
[0066] A2.不同浓度的卡那霉素标准溶液的配制：首先配制1×10‑4M的卡那霉素溶液，用超纯水溶解，然后用超纯水稀释得到一系列不同浓度的卡那霉素标准溶液，卡那霉素标准
‑13 ‑8
溶液的浓度范围为1.0×10 ～1.0×10 M；本实施例中卡那霉素标准溶液中卡那霉素的浓
‑13 ‑12 ‑11 ‑10 ‑9
度分别为(a)1.0×10 M；(b)1.0×10 M；(c)1.0×10 M；(d)1.0×10 M；(e)1.0×10 M；
‑8
(f)1.0×10 M。
‑13 ‑8
溶液的浓度范围为1.0×10 ～1.0×10 M；本实施例中卡那霉素标准溶液中卡那霉素的浓
‑13 ‑12 ‑11 ‑10 ‑9
度分别为(a)1.0×10 M；(b)1.0×10 M；(c)1.0×10 M；(d)1.0×10 M；(e)1.0×10 M；
‑8
(f)1.0×10 M。
[0067] A3.标准曲线的绘制：将A1中的检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器作为传感元件，将其置于不同浓度的卡那霉素标准溶液中浸泡25min，取出后淋洗，作为工作电极，
Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，组成三电极体系，并以含有0.05M K2S2O8的pH 7.4的
0.1M PBS缓冲液为电解液测定发光强度，在‑1.7～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高
压800V，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录发光强度‑时间曲线，建立电化学发光适配体
传感器结合卡那霉素前后的发光强度差值与卡那霉素标准溶液中的卡那霉素浓度对数值
的线性关系，得到的相应的线性回归方程为；ΔECL＝9277.5598+2109.2115lgC(nM)，检测
‑13 ‑8 ‑14
范围为1.0×10 ～1.0×10 M，检测限为4.2×10 M。
Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，组成三电极体系，并以含有0.05M K2S2O8的pH 7.4的
0.1M PBS缓冲液为电解液测定发光强度，在‑1.7～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高
压800V，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录发光强度‑时间曲线，建立电化学发光适配体
传感器结合卡那霉素前后的发光强度差值与卡那霉素标准溶液中的卡那霉素浓度对数值
的线性关系，得到的相应的线性回归方程为；ΔECL＝9277.5598+2109.2115lgC(nM)，检测
‑13 ‑8 ‑14
范围为1.0×10 ～1.0×10 M，检测限为4.2×10 M。
[0068] A4.样品的检测：简而言之，将10mL牛奶样品用10mL PBS溶液(pH 7.4，0.01μM)稀释。随后以12,000rpm离心约20分钟，并在室温下放置20分钟。提取牛奶的上清液，用0.22mm
的微孔膜过滤，然后将KAN标准溶液加标到稀释五倍的牛奶中，以制备不同浓度的卡那霉素
样品溶液用于分析测定。并加入含有0.05M K2S2O8的0.1M的PBS缓冲溶液调pH至7.4，取25mL
所得溶液用于电化学发光分析，按步骤A1所得的线性回归方程计算出待检测样品中卡那霉
素的浓度，其结果列于表1中。
的微孔膜过滤，然后将KAN标准溶液加标到稀释五倍的牛奶中，以制备不同浓度的卡那霉素
样品溶液用于分析测定。并加入含有0.05M K2S2O8的0.1M的PBS缓冲溶液调pH至7.4，取25mL
所得溶液用于电化学发光分析，按步骤A1所得的线性回归方程计算出待检测样品中卡那霉
素的浓度，其结果列于表1中。
[0069] 本实施例以PTC‑Cys为基底材料，通过二次滴涂Au@HKUST‑1得到复合材料，形貌如图4，两者能够通过Au‑S键稳定结合，材料结合新颖，能够大幅度提高单独材料的电化学发
光强度，灵敏度好，稳定性好，且传感器选择性好，稳定性好。
光强度，灵敏度好，稳定性好，且传感器选择性好，稳定性好。
[0070] 实施例2
[0071] 实施例1中(一)组装检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器
[0072] 步骤(1)PTC‑Cys材料的制备过程中，S1在酰胺化反应中，EDC与NHS的比例改为1:1(m/m)，其他同实施例1。
[0073] 实施例3
[0074] 实施例1中(一)组装检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器，步骤(2)中，适配体溶液中适配体的浓度为2‑10μM。
[0075] 对比实施例1
[0076] (1)Aptamer/Au@HKUST‑1/GCE传感器的制备
[0077] 用移液枪移取3μL 1mg/mL的Au@HKUST‑1的DMF分散液，滴涂到前处理过的玻碳电极(前处理方法同实施例1)表面，得到Au@HKUST‑1/GCE化学修饰电极，自然晾干待用；在Au@
HKUST‑1/GCE化学修饰电极表面再滴涂5μL 8μM适配体，自然晾干10h，得到Aptamer/Au@
HKUST‑1/GCE传感器，作为电化学发光测试的传感元件。
HKUST‑1/GCE化学修饰电极表面再滴涂5μL 8μM适配体，自然晾干10h，得到Aptamer/Au@
HKUST‑1/GCE传感器，作为电化学发光测试的传感元件。
[0078] (2)标准曲线的绘制
[0079] 将步骤(1)制得的Aptamer/Au@HKUST‑1/GCE传感器作为传感元件，将其置于不同浓度的卡那霉素标准溶液中浸泡25min，取出后淋洗，作为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，
铂电极为对电极，组成三电极体系，并以含有0.05M K2S2O8的pH 7.4的0.1M PBS缓冲液为电
解液测定发光强度，在‑1.7～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s，
进行循环伏安扫描，记录发光强度‑时间曲线，建立电化学发光适配体传感器结合卡那霉素
前后的发光强度差值与卡那霉素标准溶液中的卡那霉素浓度对数值的线性关系，得到相应
的线性回归方程。
铂电极为对电极，组成三电极体系，并以含有0.05M K2S2O8的pH 7.4的0.1M PBS缓冲液为电
解液测定发光强度，在‑1.7～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s，
进行循环伏安扫描，记录发光强度‑时间曲线，建立电化学发光适配体传感器结合卡那霉素
前后的发光强度差值与卡那霉素标准溶液中的卡那霉素浓度对数值的线性关系，得到相应
的线性回归方程。
[0080] (3)样品的检测
[0081] A4.样品的检测：简而言之，将10mL牛奶样品用10mL PBS溶液(pH 7.4，0.01μM)稀释。随后以12,000rpm离心约20分钟，并在室温下放置20分钟。提取牛奶的上清液，用0.22mm
的微孔膜过滤，然后将KAN标准溶液加标到稀释五倍的牛奶中，以制备不同浓度的卡那霉素
样品溶液用于分析测定，加入含有0.05M K2S2O8的0.1M的PBS缓冲溶液调pH至7.4，取25mL所
得溶液用于电化学发光分析，按步骤(2)所得的线性回归方程计算出待检测样品中卡那霉
素的浓度，其结果列于表1中。
的微孔膜过滤，然后将KAN标准溶液加标到稀释五倍的牛奶中，以制备不同浓度的卡那霉素
样品溶液用于分析测定，加入含有0.05M K2S2O8的0.1M的PBS缓冲溶液调pH至7.4，取25mL所
得溶液用于电化学发光分析，按步骤(2)所得的线性回归方程计算出待检测样品中卡那霉
素的浓度，其结果列于表1中。
[0082] 对比实施例2
[0083] (1)Aptamer/PTC‑Cys/GCE传感器的制备
[0084] 用微量注射器移取4μL 1mg/mL的PTC‑Cys的DMF分散液，滴涂到前处理过的玻碳电极(前处理方法同实施例1)表面，得到PTC‑Cys/GCE化学修饰电极，自然晾干待用；在PTC‑
Cys/GCE化学修饰电极表面再滴涂5μL 8μM，自然晾干10h，得到Aptamer/PTC‑Cys/GCE传感
器，作为电化学发光测试的传感元件。
Cys/GCE化学修饰电极表面再滴涂5μL 8μM，自然晾干10h，得到Aptamer/PTC‑Cys/GCE传感
器，作为电化学发光测试的传感元件。
[0085] (2)标准曲线的绘制
[0086] 将步骤(1)制得的Aptamer/PTC‑Cys/GCE传感器作为传感元件，将其置于不同浓度的卡那霉素标准溶液中浸泡25min，取出后淋洗，作为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电
极为对电极，组成三电极体系，并以含有0.05M K2S2O8的pH 7.4的0.1M PBS缓冲液为电解液
测定发光强度，在‑1.7～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s，进行
循环伏安扫描，记录发光强度‑时间曲线，建立电化学发光适配体传感器结合卡那霉素前后
的发光强度差值与卡那霉素标准溶液中的卡那霉素浓度对数值的线性关系，得到相应的线
性回归方程。
极为对电极，组成三电极体系，并以含有0.05M K2S2O8的pH 7.4的0.1M PBS缓冲液为电解液
测定发光强度，在‑1.7～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s，进行
循环伏安扫描，记录发光强度‑时间曲线，建立电化学发光适配体传感器结合卡那霉素前后
的发光强度差值与卡那霉素标准溶液中的卡那霉素浓度对数值的线性关系，得到相应的线
性回归方程。
[0087] (3)样品的检测
[0088] 简而言之，将10mL牛奶样品用10mL PBS溶液(pH 7.4，0.01μM)稀释。随后以12,000rpm离心约20分钟，并在室温下放置20分钟。提取牛奶的上清液，用0.22mm的微孔膜过
滤，然后将KAN标准溶液加标到稀释五倍的牛奶中，以制备不同浓度的卡那霉素样品溶液用
于分析测定，加入含有0.05M K2S2O8的0.1M的PBS缓冲溶液调pH至7.4，取25mL所得溶液用于
电化学发光分析，按步骤(2)所得的线性回归方程计算出待检测样品中卡那霉素的浓度，其
结果列于表1中。
滤，然后将KAN标准溶液加标到稀释五倍的牛奶中，以制备不同浓度的卡那霉素样品溶液用
于分析测定，加入含有0.05M K2S2O8的0.1M的PBS缓冲溶液调pH至7.4，取25mL所得溶液用于
电化学发光分析，按步骤(2)所得的线性回归方程计算出待检测样品中卡那霉素的浓度，其
结果列于表1中。
[0089] 表1某牛奶样品的测定结果
[0090]
[0091]
[0092] 其中：实际量a为三次测定的平均值
[0093] 如表1所示，样品平行测定3次，加标回收率在96％～103％之间，相对标准偏差小于5％，回收效果较好。上述实验结果说明，不用Au@HKUST‑1/PTC‑Cys复合材料修饰而单独
用Au@HKUST‑1或PTC‑Cys修饰玻碳电极后进一步组装传感元件无法检测出卡那霉素，因此
本发明的传感器是可用于检测牛奶中的卡那霉素。
用Au@HKUST‑1或PTC‑Cys修饰玻碳电极后进一步组装传感元件无法检测出卡那霉素，因此
本发明的传感器是可用于检测牛奶中的卡那霉素。
[0094] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人
员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰
为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质
对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰
为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质
对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。