一种靶向Frizzled-7的抗体融合蛋白及其制备方法与用途转让专利
申请号 : CN202010973074.9
文献号 : CN112159477B
文献日 : 2021-09-24
发明人 : 解伟 , 黄钢 , 王进 , 张坤驰 , 孙吉 , 杨浩 , 王风仙 , 赵慧杰
申请人 : 上海健康医学院
摘要 :
本发明涉及一种靶向Frizzled‑7的抗体融合蛋白及其制备方法与用途，属于生物工程领域。与现有技术相比，本发明将靶向Fzd7人源化抗体SHH002‑hu1和MICA蛋白通过基因工程的方式融合表达，此设计首次将靶向Fzd7治疗和免疫激活相结合，利用融合蛋白的抗体部分，与阳性表达Fzd7的肿瘤细胞结合，将MICA分子锚定在肿瘤细胞表面；再利用MICA特异性结合NK细胞表面膜受体NKG2D，将NK细胞聚集到肿瘤病灶并激活NK细胞发挥对肿瘤细胞的杀伤效应，从而避免肿瘤在常规抗体治疗的免疫逃逸，同时增强抗体的抗肿瘤效应。
权利要求 :
1.一种靶向Frizzled‑7的抗体融合蛋白，其特征在于，靶向Frizzled‑7的抗体融合蛋白由两条链组成，其中一条链由SHH002‑hu1抗体重链和NKG2D的配体MICA蛋白通过柔性短肽连接而成，其氨基酸序列表为SEQ ID NO.1所示；另一条链为SHH002‑hu1抗体的轻链，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。
2.一种分离的核酸，其特征在于，编码如权利要求1所述靶向Frizzled‑7的抗体融合蛋白。
3.一组重组表达载体，其特征在于，含有如权利要求1所述靶向Frizzled‑7的抗体融合蛋白的核酸序列。
4.一种重组宿主细胞EXPICHO‑S，其特征在于，含有如权利要求3所述重组表达载体。
5.一种如权利要求1所述靶向Frizzled‑7的抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
分别以SHH002‑hu1重轻链基因，MICA基因及pcDNA3.4质粒为模板，设计并合成引物进行PCR扩增；
PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因；
PCR扩增终产物及载体pcDNA3.4用限制性内切酶进行双酶切，酶切产物切胶回收后，用T4连接酶连接，获得重组质粒H’‑MICA‑pcDNA3.4；
同时将SHH002‑hu1轻链基因L’与载体pcDNA3.4链接，获得重组质粒L’‑pcDNA3.4；
将重组质粒H’‑MICA‑pcDNA3.4和L’‑pcDNA3.4分别转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布平板，次日挑取单克隆双酶切及测序鉴定；
将重组质粒H’‑MICA‑pcDNA3.4、L’‑pcDNA3.4用脂质体转染试剂瞬时转染入EXPICHO‑S细胞，更换无血清培养基进行蛋白表达。
6.根据权利要求5所述靶向Frizzled‑7的抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于，还包括分离纯化融合蛋白的纯化方法，取细胞培养上清，离心，0.22μm滤膜过滤样品用Protein A柱进行纯化。
7.一种如权利要求1所述靶向Frizzled‑7的抗体融合蛋白的应用，其特征在于，所述靶向Frizzled‑7的抗体融合蛋白用于制备治疗癌症的药物的应用。
说明书 :
一种靶向Frizzled‑7的抗体融合蛋白及其制备方法与用途
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程领域，尤其是涉及一种靶向Frizzled‑7的抗体融合蛋白及其制备方法与用途。
背景技术
[0002] 自然杀伤(NK)细胞是先天性免疫系统发挥细胞毒性作用的细胞，在肿瘤免疫监视中起到关键性作用，是肿瘤免疫治疗中的一个重要工具。NK细胞的激活由活化性受体和抑
制性受体间的平衡所调节，NK细胞的主要活化性受体包括Fc片段受体(FcγRIIIa)和
NKG2D。激活和重建机体肿瘤免疫作用的一种常规药物是抗体，目前临床上广泛使用的抗肿
瘤抗体大多为IgG1型，可通过Fc片段与FcγRIIIa结合激活NK细胞发挥抗体依赖的细胞介
导的细胞毒性作用(antibody‑dependent cell‑mediated cytotoxicity,ADCC)。然而，这
些抗体的ADCC效应存在很大的差异；Zhang等研究发现，FcγRIIIa基因的多态性导致其与
Fc片段亲和力的不同或下降，从而导致病人对抗体反应差异(Zhang W et al,FCGR2A and
FCGR3A polymorphisms associated with clinical outcome of epidermal growth
factor receptor expressing metastatic colorectal cancer patients treated with
single‑agent cetuximab,2006,J Clin Oncol,24:3028)。为提高抗体Fc片段对NK细胞的
识别力，科研工作者通过蛋白质工程技术突变抗体的Fc片段氨基酸，改变Fc片段的糖基化
程度等；然而，上述努力都无法避免FcγRIIIa多态性带来的个体对抗体反应的差异。
制性受体间的平衡所调节，NK细胞的主要活化性受体包括Fc片段受体(FcγRIIIa)和
NKG2D。激活和重建机体肿瘤免疫作用的一种常规药物是抗体，目前临床上广泛使用的抗肿
瘤抗体大多为IgG1型，可通过Fc片段与FcγRIIIa结合激活NK细胞发挥抗体依赖的细胞介
导的细胞毒性作用(antibody‑dependent cell‑mediated cytotoxicity,ADCC)。然而，这
些抗体的ADCC效应存在很大的差异；Zhang等研究发现，FcγRIIIa基因的多态性导致其与
Fc片段亲和力的不同或下降，从而导致病人对抗体反应差异(Zhang W et al,FCGR2A and
FCGR3A polymorphisms associated with clinical outcome of epidermal growth
factor receptor expressing metastatic colorectal cancer patients treated with
single‑agent cetuximab,2006,J Clin Oncol,24:3028)。为提高抗体Fc片段对NK细胞的
识别力，科研工作者通过蛋白质工程技术突变抗体的Fc片段氨基酸，改变Fc片段的糖基化
程度等；然而，上述努力都无法避免FcγRIIIa多态性带来的个体对抗体反应的差异。
[0003] 免疫监视作用的另一个重要机制就是肿瘤细胞表面MHC‑I相关抗原分子(MICA/B)的表达。MICA/B是NK细胞和CD8+ T细胞表面活化型受体NKG2D的配体(Waldhauer I et al,
NK cells and cancer immunosurveillance,2008,Oncogene,27:5932‑5943；Nausch N,et
+
al,NKG2D ligands in tumor immunity,2008,Oncogene,27:5944‑5958)，NK细胞或CD8 T
细胞借NKG2D与MICA/B的相互作用而与肿瘤细胞靠近、结合，进而通过释放细胞因子等诱导
肿瘤细胞的溶解。理论上MICA呈阳性的肿瘤细胞在机体的免疫机制中难以逃逸；临床发现
大多数的上皮肿瘤患者肿瘤组织中MICA蛋白表达都为阳性，暗示在这类患者体内存在
MICA‑NKG2D受体系统功能性妥协，允许肿瘤细胞在MICA表达阳性的基础上增殖。Wu等研究
发现血清可溶性MICA水平的显著升高，导致了NK细胞的功能缺陷，并进一步指出可溶性
MICA由肿瘤细胞表面MICA的脱落产生，肿瘤细胞逃脱免疫即发生免疫逃逸(Wu JD et al,
Prevalent expression of the immunostimulatory MHC class I chain‑related
molecule is counteracted by shedding in prostate cancer,2004,J Clin Invest,
114:560‑568；Wu JD et al,Obstructing shedding of the immunostimulatory MHC
class I chain‑related gene B prevents tumor formation,2009,Clin Cancer Res,
15:632‑640)。经文献调研发现，在上述大多MICA呈阳性的上皮性肿瘤细胞中均存在Fzd7高
表达，包括三阴性乳腺癌(Triple‑Negative Breast Cancer,TNBC)、肝细胞癌
(Hepatocellular Carcinoma,HCC)、非小细胞肺癌(Non Small Cell Lung Cancer,NSCLC)
等(Yang L et al,FZD7has a critical role in cell proliferation in triple
negative breast cancer,2011,Oncogene,30:4437‑4446；King TD et al,Frizzled7as
an emerging target for cancer Therapy,2012,Cell Signal,24:846‑851；Polakis P,
Drugging Wnt signalling in cancer,2012,EMBO J,31:2737‑2746)。
NK cells and cancer immunosurveillance,2008,Oncogene,27:5932‑5943；Nausch N,et
+
al,NKG2D ligands in tumor immunity,2008,Oncogene,27:5944‑5958)，NK细胞或CD8 T
细胞借NKG2D与MICA/B的相互作用而与肿瘤细胞靠近、结合，进而通过释放细胞因子等诱导
肿瘤细胞的溶解。理论上MICA呈阳性的肿瘤细胞在机体的免疫机制中难以逃逸；临床发现
大多数的上皮肿瘤患者肿瘤组织中MICA蛋白表达都为阳性，暗示在这类患者体内存在
MICA‑NKG2D受体系统功能性妥协，允许肿瘤细胞在MICA表达阳性的基础上增殖。Wu等研究
发现血清可溶性MICA水平的显著升高，导致了NK细胞的功能缺陷，并进一步指出可溶性
MICA由肿瘤细胞表面MICA的脱落产生，肿瘤细胞逃脱免疫即发生免疫逃逸(Wu JD et al,
Prevalent expression of the immunostimulatory MHC class I chain‑related
molecule is counteracted by shedding in prostate cancer,2004,J Clin Invest,
114:560‑568；Wu JD et al,Obstructing shedding of the immunostimulatory MHC
class I chain‑related gene B prevents tumor formation,2009,Clin Cancer Res,
15:632‑640)。经文献调研发现，在上述大多MICA呈阳性的上皮性肿瘤细胞中均存在Fzd7高
表达，包括三阴性乳腺癌(Triple‑Negative Breast Cancer,TNBC)、肝细胞癌
(Hepatocellular Carcinoma,HCC)、非小细胞肺癌(Non Small Cell Lung Cancer,NSCLC)
等(Yang L et al,FZD7has a critical role in cell proliferation in triple
negative breast cancer,2011,Oncogene,30:4437‑4446；King TD et al,Frizzled7as
an emerging target for cancer Therapy,2012,Cell Signal,24:846‑851；Polakis P,
Drugging Wnt signalling in cancer,2012,EMBO J,31:2737‑2746)。
[0004] Fzd7为Wnt信号通路的关键膜受体，是Fzd蛋白家族成员之一，其与Wnt结合并在共受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(Low‑density lipoprotein receptor‑related
protein 5/6,LRP5/6)的作用下激活经典Wnt/β‑catenin信号通路，调控肿瘤发生发展。研
究表明Fzd7异常表达于不同种类的癌症中(包括TNBC、NSCLC、HCC、胰腺癌等)，其通过介导
Wnt通路参与肿瘤的侵袭和转移，且对肿瘤血管生成也有调节作用，对Fzd7进行基因敲除可
以显著抑制肿瘤细胞增殖、移植瘤生长及血管新生。Wnt信号和肿瘤干细胞行为也存在密切
联系，Fzd7就是肿瘤干细胞标记物之一，且这些肿瘤干细胞中Fzd7的上调与肿瘤化疗耐受
以及病人的低生存率显著相关(Barker N et al.,Crypt stem cells as the cells‑of‑
origin of intestinal cancer,2009,Nature,457:608‑11)。另外Fzd7的“context‑
specific functions”暗示了选择性靶向Fzd7可以在不影响正常组织稳态的前提下治疗癌
症。
protein 5/6,LRP5/6)的作用下激活经典Wnt/β‑catenin信号通路，调控肿瘤发生发展。研
究表明Fzd7异常表达于不同种类的癌症中(包括TNBC、NSCLC、HCC、胰腺癌等)，其通过介导
Wnt通路参与肿瘤的侵袭和转移，且对肿瘤血管生成也有调节作用，对Fzd7进行基因敲除可
以显著抑制肿瘤细胞增殖、移植瘤生长及血管新生。Wnt信号和肿瘤干细胞行为也存在密切
联系，Fzd7就是肿瘤干细胞标记物之一，且这些肿瘤干细胞中Fzd7的上调与肿瘤化疗耐受
以及病人的低生存率显著相关(Barker N et al.,Crypt stem cells as the cells‑of‑
origin of intestinal cancer,2009,Nature,457:608‑11)。另外Fzd7的“context‑
specific functions”暗示了选择性靶向Fzd7可以在不影响正常组织稳态的前提下治疗癌
症。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种靶向Frizzled‑7的抗体融合蛋白及其制备方法与用途。
[0006] 本发明的靶向Frizzled‑7的抗体融合蛋白是可与肿瘤细胞表面Frizzled‑7(Fzd7)受体蛋白及NK细胞活化型受体(NKG2D)特异结合的高亲和力抗体融合蛋白。该融合
蛋白由人源化靶向Fzd7抗体及重组人MICA蛋白两个半分子通过柔性短肽(G4S)链接而成，
+
其能和Wnt3a竞争性与细胞表面Fzd7结合，阻断Wnt/β‑catenin信号通路，抑制Fzd7 肿瘤细
+
胞的增殖、侵袭和迁移，并且可增强NK细胞对靶细胞的杀伤作用，是一种具有靶向Fzd7 肿
瘤细胞和激活机体免疫监视作用的高特异性基因工程融合蛋白。
蛋白由人源化靶向Fzd7抗体及重组人MICA蛋白两个半分子通过柔性短肽(G4S)链接而成，
+
其能和Wnt3a竞争性与细胞表面Fzd7结合，阻断Wnt/β‑catenin信号通路，抑制Fzd7 肿瘤细
+
胞的增殖、侵袭和迁移，并且可增强NK细胞对靶细胞的杀伤作用，是一种具有靶向Fzd7 肿
瘤细胞和激活机体免疫监视作用的高特异性基因工程融合蛋白。
[0007] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0008] 本发明提供一种靶向Frizzled‑7的抗体融合蛋白，所述融合蛋白由人源化抗Fzd7的全长抗体SHH002‑hu1及NKG2D的配体MICA蛋白通过柔性短肽链接而成。
[0009] 靶向Frizzled‑7的抗体融合蛋白也简写为SHH002‑hu1‑MICA。
[0010] 进一步地，靶向Frizzled‑7的抗体融合蛋白由两条链组成，其中一条链由SHH002‑hu1抗体重链和MICA蛋白通过柔性短肽连接而成，其氨基酸序列表为SEQ ID NO.1所示，核
苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；另一条链为SHH002‑hu1抗体的轻链，其氨基酸序列为SEQ ID
NO.3所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。
苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；另一条链为SHH002‑hu1抗体的轻链，其氨基酸序列为SEQ ID
NO.3所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。
[0011] 进一步地，所述柔性短肽选择为G4S(由4个Gly及1个Ser构成的柔性短肽GGGGS)。
[0012] 进一步地，所述融合蛋白为特异性结合人Fzd7及NKG2D蛋白，能抑制Fzd7+肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，且能够有效招募NK细胞并激活NK细胞对肿瘤靶细胞的杀伤作用，其
介导的免疫监视作用强于母体单抗SHH002‑hu1。
介导的免疫监视作用强于母体单抗SHH002‑hu1。
[0013] 本发明还提供一种分离的核酸，可以编码靶向Frizzled‑7的抗体融合蛋白SHH002‑hu1‑MICA。
[0014] 本发明还提供一组重组表达载体，含有靶向Frizzled‑7的抗体融合蛋白SHH002‑hu1‑MICA的核酸序列。
[0015] 本发明还提供一种重组宿主细胞EXPICHO‑S，含上述重组表达载体。
[0016] 本发明还提供一种靶向Frizzled‑7的抗体融合蛋白SHH002‑hu1‑MICA的制备方法，包括以下步骤：
[0017] 分别以SHH002‑hu1重轻链基因，MICA基因及pcDNA3.4质粒为模板，设计并合成引物进行PCR扩增；
[0018] 融合蛋白SHH002‑hu1‑MICA的构建以SHH002‑hu1重链基因H’为基础，进行重叠PCR延伸扩增获得完整的H’‑MICA基因。
[0019] PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因；
[0020] PCR扩增终产物及载体pcDNA3.4用限制性内切酶进行双酶切，酶切产物切胶回收后，用T4连接酶16℃过夜连接，获得重组质粒H’‑MICA‑pcDNA3.4；
[0021] 同时将SHH002‑hu1轻链基因L’与载体pcDNA3.4链接，获得重组质粒L’‑pcDNA3.4；
[0022] 将重组质粒H’‑MICA‑pcDNA3.4和L’‑pcDNA3.4分别转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布平板，次日挑取单克隆双酶切及测序鉴定；
[0023] 将重组质粒H’‑MICA‑pcDNA3.4、L’‑pcDNA3.4用脂质体转染试剂瞬时转染入EXPICHO‑S细胞，更换无血清培养基进行蛋白表达。
[0024] 进一步地，本发明还提供用于分离纯化上述的融合蛋白SHH002‑hu1‑MICA的纯化方法，具体而言，取细胞培养上清，8000rpm离心15min，0.22μm滤膜过滤样品用Protein A柱
进行纯化。
进行纯化。
[0025] 本发明还提供一种靶向Frizzled‑7的抗体融合蛋白的应用，所述靶向Frizzled‑7的抗体融合蛋白用于制备治疗癌症的药物的应用。
[0026] 进一步地，靶向Frizzled‑7的抗体融合蛋白可选择性地与Fzd7/NKG2D结合，抑制Fzd7与其配体的结合阻断Wnt信号通路，且可以通过锚定在肿瘤细胞膜表面的MICA与NK细
胞表面NKG2D结合，激活NKG2D途径介导的免疫监视功能。
胞表面NKG2D结合，激活NKG2D途径介导的免疫监视功能。
[0027] 在创造本申请的过程中，发明人通过研究，推测靶向Fzd7的抗体可能作为有效的载体连接MICA蛋白，激活NKG2D途径，从而恢复NK细胞的免疫监视作用。
[0028] 以对肿瘤免疫监视系统的激活为目标，本发明将一种发明人之前自主研发的靶向Fzd7人源化抗体SHH002‑hu1(目前已经公开，该专利申请号为201911078254.4，公开号为
CN111138539A)和MICA蛋白通过基因工程的方式融合表达，此设计首次将靶向Fzd7治疗和
免疫激活相结合，为相关研究中的一次创新。将MICA蛋白用柔性连接肽(由4个Gly及1个Ser
构成的柔性短肽G4S)连接在SHH002‑hu1 Fc的末端，构建表达融合抗体蛋白SHH002‑hu1‑
MICA，如图1所示，利用融合蛋白的抗体部分，与阳性表达Fzd7的肿瘤细胞结合，将MICA分子
锚定在肿瘤细胞表面；再利用MICA特异性结合NK细胞表面膜受体NKG2D，将NK细胞聚集到肿
瘤病灶并激活NK细胞发挥对肿瘤细胞的杀伤效应，从而避免肿瘤在常规抗体治疗的免疫逃
逸，同时增强抗体的抗肿瘤效应。
CN111138539A)和MICA蛋白通过基因工程的方式融合表达，此设计首次将靶向Fzd7治疗和
免疫激活相结合，为相关研究中的一次创新。将MICA蛋白用柔性连接肽(由4个Gly及1个Ser
构成的柔性短肽G4S)连接在SHH002‑hu1 Fc的末端，构建表达融合抗体蛋白SHH002‑hu1‑
MICA，如图1所示，利用融合蛋白的抗体部分，与阳性表达Fzd7的肿瘤细胞结合，将MICA分子
锚定在肿瘤细胞表面；再利用MICA特异性结合NK细胞表面膜受体NKG2D，将NK细胞聚集到肿
瘤病灶并激活NK细胞发挥对肿瘤细胞的杀伤效应，从而避免肿瘤在常规抗体治疗的免疫逃
逸，同时增强抗体的抗肿瘤效应。
[0029] 本发明，由人源化靶向Fzd7抗体及重组人MICA蛋白两个半分子通过柔性短肽链接而成的融合蛋白一方面能通过靶向Fzd7的抗体特异性阻断Wnt信号通路，精准靶向肿瘤病
灶；另一方面能有效激活机体自身免疫功能，重建NKG2D途径的NK细胞免疫监视作用，防止
肿瘤免疫逃逸的发生，能够在较低的剂量达到预期的抗肿瘤效果，为TNBC、NSCLC、HCC等恶
性肿瘤提供安全有效的临床治疗候选方案。
灶；另一方面能有效激活机体自身免疫功能，重建NKG2D途径的NK细胞免疫监视作用，防止
肿瘤免疫逃逸的发生，能够在较低的剂量达到预期的抗肿瘤效果，为TNBC、NSCLC、HCC等恶
性肿瘤提供安全有效的临床治疗候选方案。
[0030] 同时，由人源化靶向Fzd7抗体及重组人MICA蛋白两个半分子通过柔性短肽链接而成的融合蛋白的开发，为抗肿瘤抗体的临床应用提供一种新的设计思路。
[0031] 与现有技术相比，本发明利用PCR技术将筛选获得的MICA蛋白α1，α2和α3胞外结构域与本申请发明人课题组自主研发的靶向Fzd7人源化全长抗体SHH002‑hu1进行克隆重组，
构建Fzd7全长抗体/MICA融合蛋白重组载体；脂质体转染试剂瞬时转染到EXPICHO‑S细胞，
对目的蛋白进行表达；收集细胞培养液，低温离心取上清，将上清过Protein A柱进行分离
纯化；SDS‑PAGE电泳鉴定分离纯化得到的融合蛋白SHH002‑hu1‑MICA；分子排阻色谱法SEC‑
HPLC对纯化后的融合蛋白纯度进行检测，生物膜层干涉技术(Biolayer Interferometry,
BLI)对SHH002‑hu1‑MICA与重组人Fzd7蛋白及NKG2D蛋白的亲和力常数进行测定；乳酸脱氢
酶(lactate dehydrogenase,LDH)法检测实验证实融合蛋白能够增强NK细胞对肿瘤细胞的
杀伤作用，其诱导产生的细胞毒效应优于母体单抗SHH002‑hu1诱导产生的效应。
构建Fzd7全长抗体/MICA融合蛋白重组载体；脂质体转染试剂瞬时转染到EXPICHO‑S细胞，
对目的蛋白进行表达；收集细胞培养液，低温离心取上清，将上清过Protein A柱进行分离
纯化；SDS‑PAGE电泳鉴定分离纯化得到的融合蛋白SHH002‑hu1‑MICA；分子排阻色谱法SEC‑
HPLC对纯化后的融合蛋白纯度进行检测，生物膜层干涉技术(Biolayer Interferometry,
BLI)对SHH002‑hu1‑MICA与重组人Fzd7蛋白及NKG2D蛋白的亲和力常数进行测定；乳酸脱氢
酶(lactate dehydrogenase,LDH)法检测实验证实融合蛋白能够增强NK细胞对肿瘤细胞的
杀伤作用，其诱导产生的细胞毒效应优于母体单抗SHH002‑hu1诱导产生的效应。
附图说明
[0032] 图1为SHH002‑hu1‑MICA结构示意图。
[0033] 图2为H’‑MICA‑pcDNA3.4重组质粒构建过程。
[0034] 图2A：人MICA基因的扩增。以pUC57‑MICA为模板，PCR扩增人MICA基因后核酸电泳检测，并对目的片段进行胶回收，Lane1：MICA(850bp)。
[0035] 图2B：H’基因的扩增。以pcDNA3.4‑SHH002‑hu1‑HC(IgG1)为模板，PCR扩增H’基因后核酸电泳检测，并对目的片段进行胶回收，Lane1‑3：H’(1450bp)。
[0036] 图2C：H’与MICA片段的链接与扩增。以上述扩增获得的MICA及H’片段为模板，overlap PCR扩增H’‑MICA片段，扩增产物经纯化后连接T载体，转化感受态细胞DH5a，随机
挑选11个克隆进行PCR验证，Lane1‑11分别对应11个克隆的PCR结果(2300bp)。结果表明11
个克隆均为阳性克隆，选取1‑4号克隆进行测序。
挑选11个克隆进行PCR验证，Lane1‑11分别对应11个克隆的PCR结果(2300bp)。结果表明11
个克隆均为阳性克隆，选取1‑4号克隆进行测序。
[0037] 图3为4号克隆序列比对结果。
[0038] 将上述1‑4号克隆送测序，经序列比对，4号克隆序列完全正确。
[0039] 图4为SHH002‑hu1‑MICA的SDS‑PAGE电泳及SEC‑HPLC的检测结果。
[0040] 图4A：融合蛋白SHH002‑hu1‑MICA的电泳检测结果。泳道1‑5为非还原样品，泳道6‑10为还原样品。Lane1：N/A质控，Lane2：SHH002‑hu1‑MICA，Lane3：N/A质控，Lane4：SHH002‑
hu1，Lane5：IPI阳性对照抗体；Lane6：SHH002‑hu1‑MICA，Lane7：N/A质控，Lane8：N/A质控，
Lane9：SHH002‑hu1，Lane10：IPI阳性对照抗体。还原条件下SHH002‑hu1‑MICA分别在80kDa
和25kDa处出现目标条带，说明H’‑MICA与L’链均表达正确，纯度均大于98％；非还原条件下
SHH002‑hu1‑MICA在210kDa处出现目的条带，说明融合蛋白装配正确，且纯度大于95％，完
全装配的主带明显。
hu1，Lane5：IPI阳性对照抗体；Lane6：SHH002‑hu1‑MICA，Lane7：N/A质控，Lane8：N/A质控，
Lane9：SHH002‑hu1，Lane10：IPI阳性对照抗体。还原条件下SHH002‑hu1‑MICA分别在80kDa
和25kDa处出现目标条带，说明H’‑MICA与L’链均表达正确，纯度均大于98％；非还原条件下
SHH002‑hu1‑MICA在210kDa处出现目的条带，说明融合蛋白装配正确，且纯度大于95％，完
全装配的主带明显。
[0041] 图4B：融合蛋白SHH002‑hu1‑MICA的SEC‑HPLC检测结果。上图：IPI阳性对照抗体的SEC‑HPLC色谱图，参比品出峰时间10.9min，峰型对称，基线平稳，系统适应性通过。下图：
SHH002‑hu1‑MICA的SEC‑HPLC色谱图，目的蛋白出峰时间8.4min，基线平稳，目的蛋白的占
比为85％，有少部分高聚体产生。
SHH002‑hu1‑MICA的SEC‑HPLC色谱图，目的蛋白出峰时间8.4min，基线平稳，目的蛋白的占
比为85％，有少部分高聚体产生。
[0042] 图5为Fortebio仪器测得的SHH002‑hu1‑MICA分别与rhFzd7和rhNKG2D‑Fc蛋白结合解离动力学过程拟合曲线图。
[0043] 图5A：SHH002‑hu1‑MICA与rhFzd7结合解离动力学过程拟合曲线。
[0044] 图5B：SHH002‑hu1与rhFzd7结合解离动力学过程拟合曲线。0s到300s表示结合，300s到900s表示解离，图中的7条曲线从上到下分别表示固定相与1000nM、500nM、250nM、
125nM、62.5nM、31.25nM和15.625nM浓度的rhFzd7结合的曲线。每个rhFzd7浓度都两条曲
线，光滑红色曲线为计算机拟合所得，另外一条曲线是仪器实际测定曲线。Fortebio仪器算
‑12
法计算出SHH002‑hu1‑MICA及SHH002‑hu1与rhFzd7的亲和动力学常数KD均<1.0×10 M；
4 ‑7
SHH002‑hu1‑MICA与rhFzd7的结合常数ka为1.22×10 (1/Ms)，解离常数kd<1.0×10 (1/
4 ‑7
s)；SHH002‑hu1与rhFzd7的结合常数ka为1.1×10 (1/Ms)，解离常数kd<1.0×10 (1/s)；因
此融合蛋白与母体单抗相比，其与抗原Fzd7的亲和力未丢失。
125nM、62.5nM、31.25nM和15.625nM浓度的rhFzd7结合的曲线。每个rhFzd7浓度都两条曲
线，光滑红色曲线为计算机拟合所得，另外一条曲线是仪器实际测定曲线。Fortebio仪器算
‑12
法计算出SHH002‑hu1‑MICA及SHH002‑hu1与rhFzd7的亲和动力学常数KD均<1.0×10 M；
4 ‑7
SHH002‑hu1‑MICA与rhFzd7的结合常数ka为1.22×10 (1/Ms)，解离常数kd<1.0×10 (1/
4 ‑7
s)；SHH002‑hu1与rhFzd7的结合常数ka为1.1×10 (1/Ms)，解离常数kd<1.0×10 (1/s)；因
此融合蛋白与母体单抗相比，其与抗原Fzd7的亲和力未丢失。
[0045] 图5C：SHH002‑hu1‑MICA与rhNKG2D‑Fc结合解离动力学过程拟合曲线。360s到660s表示结合，660s到960s表示解离，图中的3条曲线从上到下分别表示固定相SHH002‑hu1‑
MICA与300nM、100nM和33.33nM浓度的rhNKG2D‑Fc结合的曲线，光滑黑色曲线为计算机拟合
所得，另外一条曲线是仪器实际测定曲线。
MICA与300nM、100nM和33.33nM浓度的rhNKG2D‑Fc结合的曲线，光滑黑色曲线为计算机拟合
所得，另外一条曲线是仪器实际测定曲线。
[0046] 图5D：rhMICA‑His与rhNKG2D‑Fc结合解离动力学过程拟合曲线。0s到300s表示结合，300s到900s表示解离，图中的3条曲线从上到下分别表示固定相rhNKG2D‑Fc与11.1nM，
3.7nM和1.23nM浓度的rhMICA‑His结合的曲线，光滑红色曲线为计算机拟合所得，另外一条
曲线是仪器实际测定曲线。Fortebio仪器算法计算出SHH002‑hu1‑MICA与rhNKG2D‑Fc的亲
‑8 4 ‑3
和力常数KD为4.52×10 M，结合常数ka为2.81×10 (1/Ms)，解离常数kd为1.27×10 (1/
‑9 6
s)；rhMICA‑His与rhNKG2D‑Fc的亲和力常数KD为1.26×10 M，结合常数ka为1.19×10 (1/
‑3
Ms)，解离常数kd为1.5×10 (1/s)；因此融合蛋白与MICA蛋白相比，其与NKG2D的亲和力的
变化在可接受范围内。
3.7nM和1.23nM浓度的rhMICA‑His结合的曲线，光滑红色曲线为计算机拟合所得，另外一条
曲线是仪器实际测定曲线。Fortebio仪器算法计算出SHH002‑hu1‑MICA与rhNKG2D‑Fc的亲
‑8 4 ‑3
和力常数KD为4.52×10 M，结合常数ka为2.81×10 (1/Ms)，解离常数kd为1.27×10 (1/
‑9 6
s)；rhMICA‑His与rhNKG2D‑Fc的亲和力常数KD为1.26×10 M，结合常数ka为1.19×10 (1/
‑3
Ms)，解离常数kd为1.5×10 (1/s)；因此融合蛋白与MICA蛋白相比，其与NKG2D的亲和力的
变化在可接受范围内。
[0047] 图6为融合蛋白SHH002‑hu1‑MICA介导的NK92细胞对MDA‑MB‑231细胞杀伤作用的结果，以母体单抗SHH002‑hu1和rhMICA作为对照。
[0048] 结果表明SHH002‑hu1‑MICA和SHH002‑hu1均可以介导NK92细胞对MDA‑MB‑231细胞的杀伤作用，且随着效应细胞(NK92)/靶细胞(MDA‑MB‑231)(效靶比)的增加，杀伤作用增强
(data were presented as the mean±SD,n＝3,*p<0.05，**p<0.01)；在相同效靶比的情
况下，对比control组和rhMICA组，SHH002‑hu1‑MICA和SHH002‑hu1组NK92细胞对MDA‑MB‑
# ##
231细胞的杀伤作用明显增强(data were presented as the mean±SD,n＝3,p<0.05，p
<0.01)，并且SHH002‑hu1‑MICA介导的杀伤作用也明显强于SHH002‑hu1(data were
#
presented as the mean±SD,n＝3,p<0.05)。因此，得出结论：MICA半分子的融入，可以明
显增强母体单抗SHH002‑hu1介导的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
(data were presented as the mean±SD,n＝3,*p<0.05，**p<0.01)；在相同效靶比的情
况下，对比control组和rhMICA组，SHH002‑hu1‑MICA和SHH002‑hu1组NK92细胞对MDA‑MB‑
# ##
231细胞的杀伤作用明显增强(data were presented as the mean±SD,n＝3,p<0.05，p
<0.01)，并且SHH002‑hu1‑MICA介导的杀伤作用也明显强于SHH002‑hu1(data were
#
presented as the mean±SD,n＝3,p<0.05)。因此，得出结论：MICA半分子的融入，可以明
显增强母体单抗SHH002‑hu1介导的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
具体实施方式
[0049] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0050] 实施例1：融合蛋白SHH002‑hu1‑MICA的构建
[0051] 首先从genebank中获得编码人MICA蛋白α1，α2和α3胞外结构域的基因序列(Gene ID：100507436，protein：Q29983)，以其为模板，设计引物，正向引物MICA‑F:
GAGCCTGTCTCCTGGCAAAGGAGGTG，反向引物pcDNA3.4‑3R:GTTGATTGTCGAGATATCAAATTATC，PCR
扩增MICA’片段。融合蛋白SHH002‑hu1‑MICA的重链构建以SHH002‑hu1重链基因H’及MICA’
基因为模板，进行重叠PCR延伸扩增获得完整的H’‑MICA基因，正向引物insert‑F：
GCTACGCGTGTCCACTCC，反向引物IgG1‑3R：TTTGCCAGGAGACAGGCTCAGGGACTTC。PCR产物用
1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因。PCR扩增终产物及载体
pcDNA3.4用限制性内切酶进行双酶切，酶切产物切胶回收后，用T4连接酶16℃过夜连接，获
得重组质粒H’‑MICA‑pcDNA3.4。同时将SHH002‑hu1轻链基因L’与载体pcDNA3.4链接，获得
重组质粒L’‑pcDNA3.4。将重组质粒H’‑MICA‑pcDNA3.4和L’‑pcDNA3.4分别转化大肠杆菌
DH5a感受态，涂布平板，次日挑取单克隆双酶切及测序鉴定。
GAGCCTGTCTCCTGGCAAAGGAGGTG，反向引物pcDNA3.4‑3R:GTTGATTGTCGAGATATCAAATTATC，PCR
扩增MICA’片段。融合蛋白SHH002‑hu1‑MICA的重链构建以SHH002‑hu1重链基因H’及MICA’
基因为模板，进行重叠PCR延伸扩增获得完整的H’‑MICA基因，正向引物insert‑F：
GCTACGCGTGTCCACTCC，反向引物IgG1‑3R：TTTGCCAGGAGACAGGCTCAGGGACTTC。PCR产物用
1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因。PCR扩增终产物及载体
pcDNA3.4用限制性内切酶进行双酶切，酶切产物切胶回收后，用T4连接酶16℃过夜连接，获
得重组质粒H’‑MICA‑pcDNA3.4。同时将SHH002‑hu1轻链基因L’与载体pcDNA3.4链接，获得
重组质粒L’‑pcDNA3.4。将重组质粒H’‑MICA‑pcDNA3.4和L’‑pcDNA3.4分别转化大肠杆菌
DH5a感受态，涂布平板，次日挑取单克隆双酶切及测序鉴定。
[0052] 其中，由SHH002‑hu1抗体重链和MICA蛋白通过柔性短肽连接而成的一条链，简称为H’‑MICA，其氨基酸序列表为SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；另一条
链为SHH002‑hu1抗体的轻链，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列为SEQ ID
NO.4所示。
链为SHH002‑hu1抗体的轻链，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列为SEQ ID
NO.4所示。
[0053] 实施例2：融合蛋白SHH002‑hu1‑MICA的表达、纯化、鉴定
[0054] 将重组质粒H’‑MICA‑pcDNA3.4、L‑pcDNA3.4用脂质体转染试剂瞬时转染入EXPICHO‑S细胞，更换无血清培养基进行蛋白表达。
[0055] 一、取细胞培养上清，8000rpm离心15min，0.22μm滤膜过滤样品用Protein A柱进行纯化。用100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.5，pH 2.7)洗脱，收集洗脱峰；并用1M Tris缓冲液(pH
9.0)中和收集物。纯化后蛋白用SDS‑PAGE电泳法在非还原和还原条件下分别鉴定SHH002‑
hu1‑MICA的分子量。
9.0)中和收集物。纯化后蛋白用SDS‑PAGE电泳法在非还原和还原条件下分别鉴定SHH002‑
hu1‑MICA的分子量。
[0056] 二、使用Agilent HPLC 1100仪器通过SEC‑HPLC法进一步验证纯化后融合蛋白SHH002‑hu1‑MICA的纯度。选择分子排阻色谱柱为：TSKgelG3000SWXL；柱温：20℃；进样量：
10μL；检测器参数：检测波长280nm，带宽16nm，参比波长360nm，带宽100nm，峰宽(响应时间)
>0.1min(2s)；狭缝4nm；负吸光度基线100mAU；系统适应性标准：参比品蛋白IPI出峰时间
10.9min，峰型对称，基线平稳。
10μL；检测器参数：检测波长280nm，带宽16nm，参比波长360nm，带宽100nm，峰宽(响应时间)
>0.1min(2s)；狭缝4nm；负吸光度基线100mAU；系统适应性标准：参比品蛋白IPI出峰时间
10.9min，峰型对称，基线平稳。
[0057] 图2为H’‑MICA‑pcDNA3.4重组质粒构建过程。
[0058] 图2A：人MICA基因的扩增。以pUC57‑MICA为模板，PCR扩增人MICA基因后核酸电泳检测，并对目的片段进行胶回收，Lane1：MICA(850bp)。
[0059] 图2B：H’基因的扩增。以pcDNA3.4‑SHH002‑hu1‑HC(IgG1)为模板，PCR扩增H’基因后核酸电泳检测，并对目的片段进行胶回收，Lane1‑3：H’(1450bp)。
[0060] 图2C：H’与MICA片段的链接与扩增。以上述扩增获得的MICA及H’片段为模板，overlap PCR扩增H’‑MICA片段，扩增产物经纯化后连接T载体，转化感受态细胞DH5a，随机
挑选11个克隆进行PCR验证，Lane1‑11分别对应11个克隆的PCR结果(2300bp)。结果表明11
个克隆均为阳性克隆，选取1‑4号克隆进行测序。
挑选11个克隆进行PCR验证，Lane1‑11分别对应11个克隆的PCR结果(2300bp)。结果表明11
个克隆均为阳性克隆，选取1‑4号克隆进行测序。
[0061] 图3为4号克隆序列比对结果。
[0062] 将上述1‑4号克隆送测序，经序列比对，4号克隆序列完全正确。
[0063] 图4为SHH002‑hu1‑MICA的SDS‑PAGE电泳及SEC‑HPLC的检测结果。
[0064] 图4A：融合蛋白SHH002‑hu1‑MICA的电泳检测结果。泳道1‑5为非还原样品，泳道6‑10为还原样品。Lane1：N/A质控，Lane2：SHH002‑hu1‑MICA，Lane3：N/A质控，Lane4：SHH002‑
hu1，Lane5：IPI阳性对照抗体；Lane6：SHH002‑hu1‑MICA，Lane7：N/A质控，Lane8：N/A质控，
Lane9：SHH002‑hu1，Lane10：IPI阳性对照抗体。还原条件下SHH002‑hu1‑MICA分别在80kDa
和25kDa处出现目标条带，说明H’‑MICA与L’链均表达正确，纯度均大于98％；非还原条件下
SHH002‑hu1‑MICA在210kDa处出现目的条带，说明融合蛋白装配正确，且纯度大于95％，完
全装配的主带明显。
hu1，Lane5：IPI阳性对照抗体；Lane6：SHH002‑hu1‑MICA，Lane7：N/A质控，Lane8：N/A质控，
Lane9：SHH002‑hu1，Lane10：IPI阳性对照抗体。还原条件下SHH002‑hu1‑MICA分别在80kDa
和25kDa处出现目标条带，说明H’‑MICA与L’链均表达正确，纯度均大于98％；非还原条件下
SHH002‑hu1‑MICA在210kDa处出现目的条带，说明融合蛋白装配正确，且纯度大于95％，完
全装配的主带明显。
[0065] 图4B：融合蛋白SHH002‑hu1‑MICA的SEC‑HPLC检测结果。上图：IPI阳性对照抗体的SEC‑HPLC色谱图，参比品出峰时间10.9min，峰型对称，基线平稳，系统适应性通过。下图：
SHH002‑hu1‑MICA的SEC‑HPLC色谱图，目的蛋白出峰时间8.4min，基线平稳，目的蛋白的占
比为85％，有少部分高聚体产生。
SHH002‑hu1‑MICA的SEC‑HPLC色谱图，目的蛋白出峰时间8.4min，基线平稳，目的蛋白的占
比为85％，有少部分高聚体产生。
[0066] 实施例3：融合蛋白SHH002‑hu1‑MICA的BLI实验
[0067] 使用蛋白质相互作用仪Fortebio Octet Red96通过BLI法验证SHH002‑hu1‑MICA分别与rhFzd7蛋白和rhNKG2D‑Fc蛋白的亲和力。
[0068] 一、溶液配制：PBST buffer：0.025％Tween 20以pH 7.2的PBS溶解；固定相工作溶液：SHH002‑hu1‑MICA/SHH002‑hu1用PBST buffer配制成100nM；rhFzd7工作溶液：rhFzd7用
PBST buffer配制成1000nM、500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM和15.625nM；rhNKG2D工
作溶液：rhNKG2D‑Fc用PBST buffer配制成300nM、100nM和33nM。
PBST buffer配制成1000nM、500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM和15.625nM；rhNKG2D工
作溶液：rhNKG2D‑Fc用PBST buffer配制成300nM、100nM和33nM。
[0069] 二、操作流程：打开Fortebio仪器及相关软件，选择Advance Kientics实验模式。首先利用Anti‑Human Fab‑CH1 2nd Generation(FAB2G)Sensor捕获SHH002‑hu1‑MICA/
SHH002‑hu1，然后利用捕获的融合蛋白/母体抗体结合不同浓度的抗原rhFzd7/rhNKG2D‑
Fc，接着在缓冲液中进行解离，最后通过仪器算法计算出亲和动力学常数KD。作为对照，
rhMICA‑His与rhNKG2D‑Fc的亲和力常数测定过程如下：首先利用Anti‑Human IgG Fc
Capture(AHC)Sensor捕捉rhNKG2D‑Fc蛋白，然后利用捕获的rhNKG2D‑Fc蛋白分别结合
11.1nM，3.7nM，1.23nM的rhMICA‑His蛋白，接着在缓冲液中进行解离，最后计算出亲和动力
学常数KD。
SHH002‑hu1，然后利用捕获的融合蛋白/母体抗体结合不同浓度的抗原rhFzd7/rhNKG2D‑
Fc，接着在缓冲液中进行解离，最后通过仪器算法计算出亲和动力学常数KD。作为对照，
rhMICA‑His与rhNKG2D‑Fc的亲和力常数测定过程如下：首先利用Anti‑Human IgG Fc
Capture(AHC)Sensor捕捉rhNKG2D‑Fc蛋白，然后利用捕获的rhNKG2D‑Fc蛋白分别结合
11.1nM，3.7nM，1.23nM的rhMICA‑His蛋白，接着在缓冲液中进行解离，最后计算出亲和动力
学常数KD。
[0070] 图5为Fortebio仪器测得的SHH002‑hu1‑MICA分别与rhFzd7和rhNKG2D‑Fc蛋白结合解离动力学过程拟合曲线图。
[0071] 图5A：SHH002‑hu1‑MICA与rhFzd7结合解离动力学过程拟合曲线。
[0072] 图5B：SHH002‑hu1与rhFzd7结合解离动力学过程拟合曲线。0s到300s表示结合，300s到900s表示解离，图中的7条曲线从上到下分别表示固定相与1000nM、500nM、250nM、
125nM、62.5nM、31.25nM和15.625nM浓度的rhFzd7结合的曲线。每个rhFzd7浓度都两条曲
线，光滑红色曲线为计算机拟合所得，另外一条曲线是仪器实际测定曲线。Fortebio仪器算
‑12
法计算出SHH002‑hu1‑MICA及SHH002‑hu1与rhFzd7的亲和动力学常数KD均<1.0×10 M；
4 ‑7
SHH002‑hu1‑MICA与rhFzd7的结合常数ka为1.22×10 (1/Ms)，解离常数kd<1.0×10 (1/
4 ‑7
s)；SHH002‑hu1与rhFzd7的结合常数ka为1.1×10 (1/Ms)，解离常数kd<1.0×10 (1/s)；因
此融合蛋白与母体单抗相比，其与抗原Fzd7的亲和力未丢失。
125nM、62.5nM、31.25nM和15.625nM浓度的rhFzd7结合的曲线。每个rhFzd7浓度都两条曲
线，光滑红色曲线为计算机拟合所得，另外一条曲线是仪器实际测定曲线。Fortebio仪器算
‑12
法计算出SHH002‑hu1‑MICA及SHH002‑hu1与rhFzd7的亲和动力学常数KD均<1.0×10 M；
4 ‑7
SHH002‑hu1‑MICA与rhFzd7的结合常数ka为1.22×10 (1/Ms)，解离常数kd<1.0×10 (1/
4 ‑7
s)；SHH002‑hu1与rhFzd7的结合常数ka为1.1×10 (1/Ms)，解离常数kd<1.0×10 (1/s)；因
此融合蛋白与母体单抗相比，其与抗原Fzd7的亲和力未丢失。
[0073] 图5C：SHH002‑hu1‑MICA与rhNKG2D‑Fc结合解离动力学过程拟合曲线。360s到660s表示结合，660s到960s表示解离，图中的3条曲线从上到下分别表示固定相SHH002‑hu1‑
MICA与300nM、100nM和33.33nM浓度的rhNKG2D‑Fc结合的曲线，光滑黑色曲线为计算机拟合
所得，另外一条曲线是仪器实际测定曲线。
MICA与300nM、100nM和33.33nM浓度的rhNKG2D‑Fc结合的曲线，光滑黑色曲线为计算机拟合
所得，另外一条曲线是仪器实际测定曲线。
[0074] 图5D：rhMICA‑His与rhNKG2D‑Fc结合解离动力学过程拟合曲线。0s到300s表示结合，300s到900s表示解离，图中的3条曲线从上到下分别表示固定相rhNKG2D‑Fc与11.1nM，
3.7nM和1.23nM浓度的rhMICA‑His结合的曲线，光滑红色曲线为计算机拟合所得，另外一条
曲线是仪器实际测定曲线。Fortebio仪器算法计算出SHH002‑hu1‑MICA与rhNKG2D‑Fc的亲
‑8 4 ‑3
和力常数KD为4.52×10 M，结合常数ka为2.81×10 (1/Ms)，解离常数kd为1.27×10 (1/
‑9 6
s)；rhMICA‑His与rhNKG2D‑Fc的亲和力常数KD为1.26×10 M，结合常数ka为1.19×10 (1/
‑3
Ms)，解离常数kd为1.5×10 (1/s)；因此融合蛋白与MICA蛋白相比，其与NKG2D的亲和力的
变化在可接受范围内。
3.7nM和1.23nM浓度的rhMICA‑His结合的曲线，光滑红色曲线为计算机拟合所得，另外一条
曲线是仪器实际测定曲线。Fortebio仪器算法计算出SHH002‑hu1‑MICA与rhNKG2D‑Fc的亲
‑8 4 ‑3
和力常数KD为4.52×10 M，结合常数ka为2.81×10 (1/Ms)，解离常数kd为1.27×10 (1/
‑9 6
s)；rhMICA‑His与rhNKG2D‑Fc的亲和力常数KD为1.26×10 M，结合常数ka为1.19×10 (1/
‑3
Ms)，解离常数kd为1.5×10 (1/s)；因此融合蛋白与MICA蛋白相比，其与NKG2D的亲和力的
变化在可接受范围内。
[0075] 实施例4：LDH法检测SHH002‑hu1‑MICA/SHH002‑hu1介导的NK细胞对TNBC细胞MDA‑MB‑231的毒性作用
[0076] 该实验中将SHH002‑hu1‑MICA/SHH002‑hu1与高表达Fzd7的MDA‑MB‑231细胞及NK92细胞混合后作用4h后，利用细胞毒性检测试剂盒进行检测。利用SPSS软件对实验数据
进行分析，以评估融合蛋白/母体单抗介导NK92细胞对MDA‑MB‑231细胞产生的杀伤效应。将
MDA‑MB‑231细胞、NK92细胞按比例加入96孔板中，再将融合蛋白或母体单抗或阴性对照
rhMICA‑His按100nM加入孔板中作用4h，250g离心平板4min后，将50μL上清液转移到酶分析
板中，把配好的底物按50μL/孔加到酶分析板中，盖好平板，室温避光孵育30min，向每孔中
加入50μL终止液，在490nm记录吸光值。按照公式％cytotoxicity＝((experimental‑
effector spontaneous‑target spontaneous)/(target maximum‑target spontaneous))
×100计算细胞毒性，利用软件分析结果。
进行分析，以评估融合蛋白/母体单抗介导NK92细胞对MDA‑MB‑231细胞产生的杀伤效应。将
MDA‑MB‑231细胞、NK92细胞按比例加入96孔板中，再将融合蛋白或母体单抗或阴性对照
rhMICA‑His按100nM加入孔板中作用4h，250g离心平板4min后，将50μL上清液转移到酶分析
板中，把配好的底物按50μL/孔加到酶分析板中，盖好平板，室温避光孵育30min，向每孔中
加入50μL终止液，在490nm记录吸光值。按照公式％cytotoxicity＝((experimental‑
effector spontaneous‑target spontaneous)/(target maximum‑target spontaneous))
×100计算细胞毒性，利用软件分析结果。
[0077] 图6为融合蛋白SHH002‑hu1‑MICA介导的NK92细胞对MDA‑MB‑231细胞杀伤作用的结果，以母体单抗SHH002‑hu1和rhMICA作为对照。
[0078] 结果表明SHH002‑hu1‑MICA和SHH002‑hu1均可以介导NK92细胞对MDA‑MB‑231细胞的杀伤作用，且随着效应细胞(NK92)/靶细胞(MDA‑MB‑231)(效靶比)的增加，杀伤作用增强
(data were presented as the mean±SD,n＝3,*p<0.05，**p<0.01)；在相同效靶比的情
况下，对比control组和rhMICA组，SHH002‑hu1‑MICA和SHH002‑hu1组NK92细胞对MDA‑MB‑
# ##
231细胞的杀伤作用明显增强(data were presented as the mean±SD,n＝3,p<0.05，p
<0.01)，并且SHH002‑hu1‑MICA介导的杀伤作用也明显强于SHH002‑hu1(data were
#
presented as the mean±SD,n＝3,p<0.05)。因此，得出结论：MICA半分子的融入，可以明
显增强母体单抗SHH002‑hu1介导的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
(data were presented as the mean±SD,n＝3,*p<0.05，**p<0.01)；在相同效靶比的情
况下，对比control组和rhMICA组，SHH002‑hu1‑MICA和SHH002‑hu1组NK92细胞对MDA‑MB‑
# ##
231细胞的杀伤作用明显增强(data were presented as the mean±SD,n＝3,p<0.05，p
<0.01)，并且SHH002‑hu1‑MICA介导的杀伤作用也明显强于SHH002‑hu1(data were
#
presented as the mean±SD,n＝3,p<0.05)。因此，得出结论：MICA半分子的融入，可以明
显增强母体单抗SHH002‑hu1介导的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
[0079] 上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般
原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领
域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的
保护范围之内。
原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领
域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的
保护范围之内。