胜红蓟内生真菌Letendraea sp.WZ07及其在纳米银合成中的应用

摘要

本发明公开了胜红蓟内生真菌Letendraea sp.WZ07及其在纳米银合成中的应用。该真菌菌株分离自入侵植物胜红蓟，2020年08月04日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2020395。该菌株经ITS序列进行鉴定，其与Letendraea sp.1 NV‑2015具有最高的相似性(100％)，鉴定为Letendraea sp.WZ07，菌株ITS基因序列的GenBank登录号为MN712504。该真菌菌株可以在含硫酸链霉素和青霉素钾的马铃薯葡萄糖培养基中生长，其最适温度为28℃，最适pH为5。菌株Letendraea sp.WZ07具有合成纳米银的能力，可催化AgNO3溶液合成不同粒径、形状的纳米银。该菌株扩展了真菌在纳米材料绿色合成中的应用，也为银纳米材料的生物制备提供了一种新的微生物资源。

权利要求

1.一种真菌菌株，其特征在于：所述真菌菌株为从胜红蓟分离的内生真菌Letendraea sp.WZ07，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为武汉市武昌珞珈山武汉大学，其保藏号为CCTCC NO：M2020395，保藏日期为2020年08月04日。

2.根据权利要求1所述的真菌菌株，其特征在于：所述真菌Letendraea sp.WZ07的培养基为含有0.14～0.16g/L硫酸链霉素和0.11～0.13g/L青霉素钾的马铃薯葡萄糖培养基。

3.根据权利要求2所述的真菌菌株，其特征在于：所述马铃薯葡萄糖培养基还包括马铃薯280～320g/L，葡萄糖18～22g/L。

4.根据权利要求1所述的真菌菌株，其特征在于：所述真菌Letendraea sp.WZ07的生长温度为20～36℃，生长pH值为pH 4～9。

5.根据权利要求1所述的真菌菌株，其特征在于：所述真菌Letendraea sp.WZ07的生长最适温度为27～29℃，生长最适pH为4.8～5.2。

6.一种权利要求1至5中任一项所述的真菌菌株在纳米银合成中的应用。

7.一种利用权利要求1至5中任一项所述的真菌菌株合成纳米银的方法，其特征在于：所述真菌Letendraea sp.WZ07催化AgNO3合成纳米银。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：每100mL孵育反应体系加入1～3g真菌Letendraea sp.WZ07的湿菌丝体，在27～29℃、160～200rpm条件下，孵育22～26h获得菌液；将所述菌液与0.8～1.2mmo1/L AgNO3溶液按照体积比1:8～10的比例混合，室温避光反应合成纳米银。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述纳米银的粒径为8～56nm，形状为球形、五边形、三角形或六边形。

说明书

胜红蓟内生真菌Letendraea sp.WZ07及其在纳米银合成中的

应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及微生物合成纳米材料。

背景技术

[0002] 纳米银(AgNPs)是一种重要的贵金属纳米颗粒，在生物传感器材料、低温超导材料、催化剂材料和生物医药等方面均具有极高的应用价值。因此纳米银的合成与制备成为近来分析的热点。纳米银的合成方法多种多样，主要有物理法、化学法和生物法。物理合成法对仪器设备要求高，生产费用昂贵，且耗能高；化学合成法最大的优点之一是可以在短时间内合成大量的纳米粒子，但通常依赖于有毒、价格昂贵的化学试剂，会产生不环保的副产品，从而限制了其在食品检测、生物医学等领域的应用。生物法由于成本低廉、具可持续性、反应条件温和、产物稳定，且过程中不使用毒性化学试剂，环境友好而备受关注。

[0003] 在生物法中，用于合成AgNPs的材料主要包括三类“成员”，即植物、细菌及真菌，其+中真菌是生物合成AgNPs优势的来源，因为它们对Ag 具有很高的耐受性，而且易于操作。与细菌材料相比，真菌可以分泌大量合成纳米颗粒相关的胞外酶、多肽类物质及次级代谢产物等，合成的纳米颗粒产量高、易与真菌分离，因此在下游过程中节省了相当大的成本。与植物材料相比，真菌菌丝体具有更强的抗搅拌和抗压力的能力，为金属盐与金属纳米颗粒的转化提供了很大的表面积，更适合于大规模合成。

[0004] 随着真菌优势的突出，合成AgNPs的报道也逐渐增多。然而，关于Letendraea属真菌可合成AgNPs的研究至今还未见报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了胜红蓟内生真菌Letendraea sp.WZ07及其在纳米银合成中的应用。

[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

[0007] 一种真菌菌株，所述真菌菌株为从入侵植物胜红蓟(Ageratum conyzoides L.)分离的内生真菌Letendraea sp.WZ07，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为武汉市武昌珞珈山武汉大学，其保藏号为CCTCC NO：M2020395，保藏日期为2020年08月04日。

[0008] 进一步地，所述真菌Letendraea sp.WZ07的ITS序列如SEQ ID No.1所示。该真菌菌株的ITS基因序列在GenBank数据库中登录号为MN712504。

[0009] 进一步地，所述真菌Letendraea sp.WZ07的培养基为含有0.14～0.16g/L硫酸链霉素和0.11～0.13g/L青霉素钾的马铃薯葡萄糖培养基。

[0010] 进一步地，所述马铃薯葡萄糖培养基还包括马铃薯280～320g/L，葡萄糖18～22g/L。

[0011] 具体地，Letendraea sp.WZ07生长采用的液体培养基成分为马铃薯280～320g/L，葡萄糖18～22g/L，硫酸链霉素0.14～0.16g/L，青霉素钾0.11～0.13g/L；所用的固体培养基为对应的液体培养基中加入2wt％琼脂。

[0012] 进一步地，所述真菌Letendraea sp.WZ07的生长温度为20～36℃，生长pH值为pH 4～9。

[0013] 优选地，所述真菌Letendraea sp.WZ07的生长最适温度为27～29℃，生长最适pH为4.8～5.2。

[0014] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：

[0015] 真菌菌株Letendraea sp.WZ07在纳米银合成中的应用。

[0016] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：

[0017] 一种利用真菌菌株合成纳米银的方法，所述真菌Letendraea sp.WZ07催化AgNO3合成纳米银。

[0018] 具体地，每100mL孵育反应体系加入1～3g真菌Letendraea sp.WZ07的湿菌丝体，在27～29℃、160～200rpm条件下，孵育22～26h获得菌液；将所述菌液与0.8～1.2mmo1/L AgNO3溶液按照体积比1:8～10的比例混合，室温避光反应合成纳米银。所述孵育反应体系包括水。

[0019] 进一步地，所述纳米银的粒径为8～56nm，形状为球形、伪球形、三角形或六边形。

[0020] 本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。

[0021] 本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。

[0022] 本发明所述“大约”、“约”或“左右”等指的是所述范围或数值的±10％范围内。

[0023] 本发明中，除有特别说明外，％均为质量百分比。

[0024] 本发明中，所述“室温”即常规环境温度，可以为10～30℃。

[0025] 本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

[0026] 本发明提供了一种分离自入侵植物胜红蓟的菌株Letendraea sp.WZ07，其可在含0.15g/L硫酸链霉素和0.12g/L青霉素钾的马铃薯葡萄糖培养基中生长，最适温度为28℃，最适pH为6。该菌株可催化AgNO3合成不同形态的纳米银AgNPs，且该催化制备工艺生产成本低、设备简单。该菌株扩展了真菌在纳米材料绿色合成中的应用，为纳米银的生物制备提供一种新的微生物资源，在生物合成纳米材料领域尤其是绿色合成纳米银领域中具有重要的应用价值。

附图说明

[0027] 图1为本发明实施例提供的邻接法构建的Letendraea sp.WZ07的系统发育树。

[0028] 图2为本发明实施例提供的不同温度对Letendraea sp.WZ07生长的影响图。

[0029] 图3为本发明实施例提供的不同pH对Letendraea sp.WZ07生长的影响图。

[0030] 图4为本发明实施例提供的Letendraea sp.WZ07的二次发酵液(实线)及其制备的纳米银(虚线)的紫外可见吸收光谱图。

[0031] 图5为本发明实施例提供的Letendraea sp.WZ07合成纳米银的透射电镜图。

具体实施方式

[0032] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

[0033] 以下实施例中，Letendraea sp.WZ07生长采用的液体培养基成分为马铃薯300g/L，葡萄糖20g/L，硫酸链霉素0.15g/L，青霉素钾0.12g/L；所用的固体培养基为对应的液体培养基中加入2wt％琼脂。固体培养基或液体培养基均在120℃湿热灭菌20min后使用。

[0034] 实施例1菌株的获得

[0035] 本实施例中的Letendraea  sp.WZ07分离自入侵植物胜红蓟(Ageratum conyzoides L.)。将采集于福建省厦门市华侨大学校园的胜红蓟茎部用自来水冲洗干净后，在超净工作台中用无菌小刀将茎切成4cm。将处理后的茎按照按以下操作方法进行表面消毒处理：先用5％乙醇浸泡2min，无菌吸水纸蘸干水分，再用4％的次氯酸钠溶液浸泡5min，用无菌水漂洗4次，剪去两端褐变部分，将中间部分剪成0.5cm左右的组织块，接种于含0.15g/L硫酸链霉素和0.12g/L青霉素钾的马铃薯葡萄糖固体培养基中，28℃倒置培养。
每12h观察1次，待茎部切口处长出菌丝后，采用菌丝尖端挑取法，根据菌丝形态及颜色的差异，挑取少许菌落边缘的菌丝，转接到新鲜的含0.15g/L硫酸链霉素和0.12g/L青霉素钾的马铃薯葡萄糖固体培养基培养数日，并观察记录菌落的形态特征。纯化好的菌种进行PDA双抗斜面培养基上斜面冷冻保藏。

[0036] 该菌株于2020年08月04日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为武汉市武昌珞珈山武汉大学，其保藏号为CCTCC NO：M2020395。

[0037] 实施例2菌株WZ07的ITS序列分子鉴定

[0038] 将纯化后的WZ07菌株接种至含0.15g/L硫酸链霉素和0.12g/L青霉素钾的马铃薯葡萄糖液体培养基培养5d，发酵液离心后取菌丝研磨破碎，按照真菌基因组DNA快速提取试剂盒所述方法提取DNA。利用通用引物ITS1(5'‑TCCGTAGGTGAACCTGCGG‑3')(如SEQ ID No.2所示)和ITS4(5'‑TCCTCCGCTTATTGATATGC‑3')(如SEQ ID No.3所示)扩增序列。PCR反应体系为50μL，包括：ITS1和ITS4引物各1μL，模板DNA 1μL，2×PCRmix 25μL，ddH2O 22μL。反应程序为：95℃变性3min；95℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min，如此处理30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物将经琼脂糖凝胶电泳检测后，条带清晰的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，所得序列在NCBI数据库中进行Blast比对及同源性比较分析，得到与其最相近的菌株Letendraea sp.1NV‑2015，二者ITS基因序列相似性为100％，利用MEGA7.0软件采用邻近法(Neighbor‑Joining)最大组合复合似然模型(Maximum Composite Likelihood)构建系统发育树，自检重复数1 000。因此判定WZ07为Letendraea sp.。图1为菌株WZ07的系统发育树。其ITS序列已登录GenBank数据库，登录号为MN712504。菌株WZ07的ITS序列如SEQ ID No.1所示。

[0039] >WZ07 genomic DNA sequence(SEQ ID No.1)

[0040] CTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCTTTGGCTGCCGTGAGCGCTTCGGCGTGAGCGACAGTCATTCTATAGCGATGCCTCCGTGTCCGGGAAACCGGCGCGGGGCTGACCTAACCCTTCTCTACGAGTACCTATTATTCTCCTTCGGCGGGGCAACCCGCCGCTGGAACTTAAGAACCAACTTGCATTTAGCATTACCTGTTCTGATAACAATTAATTATTACAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATCTACACCCTCAAGCACTGCTTGGTGTTGGGCGTCTGTCCCGCCTTCGCGCGTGGACTCGCCCCAAAGTCATTGGCAGCGGTCTCTGGCACCTCAACGCGCAGTACAATGCGTTCATTGGGGTGCCGTGGGCGCGTCCATAAGCTATTTACCGTCTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA[0041] 实施例3不同温度对菌株WZ07生长的影响

[0042] 将5个直径为6mm的WZ07菌块，接种到含0.15g/L硫酸链霉素和0.12g/L青霉素钾的马铃薯葡萄糖液体培养基中(100mL/250mL)，然后分别置于20、24、28、32和36℃恒温培养箱中避光培养5d，测定菌丝干重，如图2所示。结果表明，菌株WZ07在20℃至36℃时均可以生长，其中28℃时生长量最大，干重为5984.33±85.51mg/L。

[0043] 实施例4不同pH对菌株WZ07生长的影响

[0044] 将5个直径为6mm的WZ07菌块，接种到含0.15g/L硫酸链霉素和0.12g/L青霉素钾的马铃薯葡萄糖液体培养基中(100mL/250mL)，用NaOH和HCl溶液(2.0mol/L)调节培养基pH分别为4、5、6、7、8和9，置于28℃恒温摇床中160r/min避光培养5d，测定菌丝干重，如图3所示。结果表明，菌株WZ07在pH 4～9的条件下均能生长，pH为5时生长量最大，干重为6716.67±
107.5mg/L。

[0045] 实施例5利用菌株WZ07合成纳米银

[0046] 取实施例1中培养至5d的菌液，过滤去除培养基成分，无菌水洗涤菌体3次，收集湿菌丝体。取2g湿菌丝体放入装无菌去离子水中的锥形瓶中(100mL/250mL)，28℃，180rpm条件下二次发酵24h。过滤收集二次发酵液，置于4℃备用。将二次发酵液与1.0mmo1/L AgNO3溶液按照1:9的比例(体积比)混合，室温避光反应24h。利用未添加AgNO3的二次发酵液作为空白对照，观察反应混合液的颜色变化，并使用紫外分光光度计对反应混合液进行全波长扫描，判定是否有纳米银生成，检测范围为300～600nm。结果显示，未加入AgNO3的二次发酵液为无色，加入AgNO3的二次发酵液由无色变为黄色，这是由于金属纳米粒子存在表面等离子体共振效应(SPR效应)，这种SPR效应决定了其光学特性，表现为对自然光产生特异性的吸收，纳米银溶液成为棕黄色或黄色，是生成纳米银的典型特征。此外，全波长扫描显示，在420nm左右呈现单、强而宽的表面等离子体共振峰，证实纳米银的形成及其稳定性(纳米银在400nm～450nm有特征吸收峰)，如图4所示。

[0047] 实施例6菌株WZ07合成纳米银的透射电镜表征

[0048] 将实施例6中最后得到的黄色溶液滴在200目碳支持膜(铜网)上，重复滴定2～3次，自然晾干，制好的铜网利用透射电镜观察产物的形貌和大小，如图5所示。结果显示，菌株WZ07可催化AgNO3合成不同粒径(8～56nm)和不同形状(多数呈不规则的球形、少数呈五边形、三角形)的纳米银。

[0049] 以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。