生物逆境诱导型启动子PBBI7及其应用

摘要

本发明涉及植物基因工程技术领域，公开了一种生物逆境诱导型启动子及应用。生物逆境诱导型启动子PBBI7在不同的生物逆境危害的条件下可以显著提高下游基因的表达水平，在水稻抗逆基因工程育种中具有良好的应用价值。

权利要求

1.一种生物逆境诱导型启动子，其特征在于，如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

2.一种遗传构建体，其特征在于，包含：(a) 权利要求1所述的启动子；和(b) 与 (a) 所述启动子有效连接的异源核酸序列；和任选的(c) 3'转录终止子。

3.包含权利要求2所述遗传构建体的表达盒。

4.包含权利要求2所述遗传构建体的转化载体。

5.包含权利要求2所述遗传构建体的表达载体。

6.一种提高水稻抗逆境能力的方法，包括：(a) 将水稻抗性外源基因有效连接至权利要求1所述的启动子，和(b) 将得到的遗传构建体导入水稻或水稻细胞。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述水稻抗性外源基因包括抗白叶枯基因、抗褐飞虱基因及抗二化螟基因。

8.一种转基因水稻生产的方法，包括：(a) 将权利要求1所述的启动子、或权利要求2所述的遗传构建体、或权利要求3所述的表达盒、或权利要求4所述的转化载体、或权利要求5所述的表达载体导入水稻或水稻细胞，和

(b) 在促进水稻生长的条件下培养所述水稻或水稻细胞。

9.权利要求1所述的启动子在提高外源基因在转基因水稻中表达中的应用。

说明书

生物逆境诱导型启动子PBBI7及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域，特别是涉及一种生物逆境诱导型启动子PBBI7及应用。

背景技术

[0002] 植物在生长过程中，会受到多种病虫害如白叶枯病菌、褐飞虱以及二化螟等生物逆境的侵害。利用抗性基因资源改良植物的抗性，是预防病虫害同时又保护环境的根本出
路。采用转基因技术将抗性基因导入植物是改良农作物抗病虫性的主要途径之一。但是目
前的基因工程体系存在一些不足，很重要的一点是转化载体中使用的启动子大多是组成型
过量表达启动子，如玉米Ubiquitin启动子和CaMV35S启动子。这不仅给植物体带来代谢负
担，使植物在不需要发生抗病虫反应时大量表达外源蛋白或mRNA，造成了浪费；严重的还造
成了植物体生理和代谢的紊乱，致其产生变异或死亡。

[0003] 使用特异诱导性启动子调控目标基因的表达很有必要。启动子是一段对基因表达起调控作用的DNA片段。启动子在原核生物和真核生物中均存在，它是一段对基因转录的时
间、空间和表达量起调控作用的DNA序列。在原核和真核生物中，启动子的结构有所不同。真
核生物有三种RNA聚合酶，每一种都有其识别的不同启动子。RNA聚合酶II负责蛋白质基因
和部分snRNA基因的转录，结构最为复杂。人们比较了上百个聚合酶II识别的真核启动子的
序列，发现了一些共同的结构。如1)帽子位点，即转录起始位点，其碱基大多为A，两侧各有
若干个嘧啶核苷酸，其中A为转录起点。2)TATA框，又称Hogness框或Goldberg‑hogness框，
其一致序列为：TATAAAA或TATATAT，而在它的两侧由富含G和C碱基对的序列组成。TATA框决
定了转录起始点的选择，它是RNA聚合酶和DNA链结合的部位。3)CAAT框，其一致序列为GGC
(T)CAATCT。该框的碱基一旦缺失或突变，将会造成转录效率的急剧降低，CAAT框可能控制
着转录起始的频率。4)增强子(enhancer)，又称为远上游序列，一般都在‑100bp以上，它对
依赖和不依赖TATA框的转录均有增强转录的作用。另外，不同的启动子上还有其他不同的
顺式(cis)调控元件，它们是反式(trans)调控因子或转录调控蛋白的结合位点。不同的反
式调控因子/转录调控蛋白特异性的与顺式调控元件结合，对基因的表达时间、空间或表达
量进行特异性的调控。

[0004] 特异性的启动子一般分为两类，一类是受诱导表达的特异启动子，称之为诱导型启动子，另一类是组织特异性表达的启动子，称之为组织特异型启动子。诱导型的启动子对
外界的某些物质，如虫害、病原物、化学物质或逆境作出反应，启动植物体内相应的基因表
达。组织特异型的启动子则驱动基因在特定的组织中表达。特异性的启动子可避免基因过
量表达对植物体产生伤害。因此，利用水稻来源的生物逆境诱导表达的启动子驱动抗性基
因的表达，是改良水稻抗病虫性的最佳选择之一。

发明内容

[0005] 本发明通过克隆一个水稻基因Os01g03390启动子PBBI7的DNA片段，对水稻中分离克隆的生物逆境诱导表达启动子PBBI7区段进行功能验证，并利用这个启动子调控水稻抗
病虫基因的表达，从而改良水稻的抗病虫性。

[0006] 本发明提供的生物逆境诱导型启动子包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

[0007] 本发明还提供了一种遗传构建体，包含：

[0008] (a)本发明上述启动子；和

[0009] (b)与(a)所述启动子有效连接的异源核酸序列；和任选的

[0010] (c)3'转录终止子。

[0011] 如此处使用的术语“遗传构建体”指通过遗传工程制得的核酸。

[0012] 如此处使用的术语“有效连接”至启动子指转录通过该启动子驱动和/或调节。本领域技术人员将理解与启动子有效连接优选指启动子位于该有效连接的核酸的上游(即在
5'‑末端)。只要本发明的启动子能够驱动和/或调节该有效连接的核酸的转录，与有效连接
的核酸的距离是可变的。例如，在启动子和该有效连接的核酸间，可能有克隆位点、接头、转
录或翻译增强子。

[0013] 如此处使用的术语“异源的”指“与本发明启动子异源的”。与本发明的启动子异源的核酸当在其生物基因组环境中时并不天然存在于本发明启动子侧翼的核酸序列中。虽然
该核酸可以是与本发明的启动子异源的，其可以是与植物宿主细胞同源的或天然的或异源
的或外源的。本发明的异源核酸序列可选的为SEQ ID NO:3‑5中的任意一种。

[0014] (c)中使用的术语“转录终止子”指其给出转录终止信号的转录单元末端的DNA序列。终止子为通常包含聚腺苷酸化信号的3'‑非翻译DNA序列，其促进聚腺苷酸序列加至初
级转录本的3'‑末端。在和/或分离自病毒、酵母、霉菌、细菌、昆虫、禽类、哺乳动物和植物中
有活性的终止子是已知的且已在文献中描述过。适用于本发明遗传构建体的终止子的实例
包含根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)胭脂碱合酶(NOS)基因终止子(如SEQ ID 
NO:2所示)、根癌土壤杆菌章鱼碱合酶(OCS)基因终止子序列、花椰菜花叶病毒(CaMV)35s基
因终止子序列、稻ADP‑葡萄糖焦磷酸化酶终止子序列(t3′Bt2)、玉米的玉米蛋白基因终止
子序列、rbcs‑1A基因终止子和rbcs‑3A基因终止子序列等等。

[0015] 本发明还提供了包含上述遗传构建体的表达盒、转化载体及表达载体。

[0016] 此处“表达盒”指核酸表达所需的最小遗传构建体。一般的表达盒包括启动子‑基因‑终止子组合。表达盒可另外包括克隆位点，例如Gateway TM重组位点或限制性内切酶识
别位点以方便有效连接的核酸的克隆或方便表达盒转入载体。表达盒可进一步包括5'非翻
译区、3'非翻译区、筛选标记、转录增强子或翻译增强子。

[0017] “转化载体”指遗传构建体，其可通过转化导入生物体且可在所述生物体中稳定维持。一些载体可在例如大肠杆菌、A.tumefaciens、酿酒酵母或粟酒裂殖糖酵母中维持，而其
它的如噬粒和粘粒载体可在细菌和/或病毒中维持。转化载体可在其宿主细胞中增殖且可
再次从中分离而转化至另一宿主细胞。载体序列通常包括一组限制性内切酶识别的唯一位
点、多克隆位点(MCS)，其中可插入一个或多个非载体序列。载体序列可进一步包括一复制
起点，其为在特定宿主细胞中维持和/或复制所必需的。复制起点的实例包含但不限于，f1‑
ori和colE1。

[0018] “表达载体”构成转化载体的亚群，其由于包含适当的调节序列，能启动插入的非载体序列的表达。已记载适于在细菌(例如大肠杆菌)、真菌(例如啤酒酵母、粟酒裂殖糖酵
母、巴斯德毕赤氏酵母)、昆虫细胞(例如杆状病毒表达载体)、动物细胞(例如COS或CHO细
胞)和植物细胞中表达的表达载体。本发明的一种合适的表达载体为植物表达载体，用于植
物细胞的转化、植物基因组中的稳定整合、植物细胞内的维持和植物细胞中非载体序列的
表达。

[0019] 本发明的遗传构建体可进一步包括“筛选标记”。如此处使用的，术语“筛选标记”包含任何基因，其赋予细胞表型，在其中得到表达以便于转染的或转化的细胞的鉴定和/或
选择。合适的标记可选自赋予抗生素或除草剂抗性的标记。包含该遗传构建体的细胞因此
将在杀死未转化细胞的抗生素或除草剂浓度下存活。筛选标记基因的实例包含赋予抗生素
抗性的基因(如编码能磷酸化新霉素和卡那霉素的新霉素磷酸转移酶的nptII，或编码能磷
酸化潮霉素的潮霉素磷酸转移酶的hpt)、赋予除草剂抗性的基因(例如bar，其提供Basta的
抗性；提供草甘膦抗性的aroA或gox)，或提供代谢作用特性的基因(如允许植物利用甘露糖
作为单独碳源的manA)。可见的标记基因引起颜色的生成(例如β‑葡糖醛酸酶，GUS)、发光
(如萤光素酶)或产生荧光(绿色荧光蛋白，GFP和其衍生物)。合适筛选标记基因进一步的实
例包括氨苄青霉素抗性(Ampr)、四环素抗性基因(Tcr)、细菌卡那霉素抗性基因(Kanr)、膦
丝菌素抗性基因和氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因，等等。

[0020] 此外，本发明包括包含本发明上文所述的启动子，或遗传构建体，或表达盒，或转化载体或表达载体的宿主细胞。在本发明的具体实施方案中，宿主细胞选自水稻细胞。

[0021] 本发明还提供了一种提高水稻抗逆境能力的方法，包括：

[0022] (a)将水稻抗性外源基因有效连接至权利要求1所述的启动子，和

[0023] (b)将得到的遗传构建体导入水稻或水稻细胞。

[0024] 优选(a)的有效连接的核酸与本发明核酸是异源的。此外，该有效连接的核酸的表达可以在水稻特定的细胞、组织或器官中得到驱动和/或调节。其中，本发明水稻抗性外源
基因包括抗白叶枯基因、抗褐飞虱基因及抗二化螟基因。

[0025] 该方法可进一步包括在促进生长、促进再生和/或促进成熟的条件下培养转化的水稻或水稻细胞。

[0026] 本发明还提供了一种转基因水稻生产的方法，包括：

[0027] (a)将上述的启动子、或遗传构建体、或表达盒、或转化载体、或表达载体导入水稻或水稻细胞，和

[0028] (b)在促进水稻生长的条件下培养所述水稻或水稻细胞。

[0029] 优选通过转化完成“导入”上述分离的启动子，或遗传构建体，或表达盒，或转化载体或表达载体至宿主细胞中(例如水稻细胞)。如此处使用的术语“转化”包含外源多核苷酸
转入宿主细胞中，而不考虑用于转入的方法。植物品种的转化目前是相当常规的技术。方便
地，一些转化方法中任何一个都可用来将本发明的核酸导入合适的祖细胞。转化方法包括
利用脂质体、电穿孔法、增强游离DNA摄取的化学试剂、DNA直接注射入植物、基因枪轰击、利
用病毒或花粉的转化以及显微投影。本发明的转基因水稻优选利用任何熟知的稻转化的方
法通过土壤杆菌‑介导的转化而产生。

[0030] 通常在转化后，选择具有一个或多个标记的水稻细胞或细胞团，其由用目的基因共转染的植物可表达的基因编码(其可受本发明任何启动子控制)，随之在促进水稻生长的
条件下培养被转化的材料。

[0031] 得到的转化水稻细胞随后可用于以本领域技术人员已知的方式再生转化植株。本发明进一步提供包括上文所述水稻细胞的水稻。该水稻植物可生长，或甚至达到成熟包括
例如果实产生、种子形成、种子成熟和结籽。

[0032] 此外，可从这些种子生产子代，其子代是可育的。做为选择或另外，转化的和再生的水稻也可以通过无性繁殖如克隆、嫁接产生子代。产生的转化水稻可通过多种方式繁殖，
如通过无性繁殖或传统的育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可自花授精以得到纯
合的第二代(或T2)转化体，而T2植株进一步通过传统的育种技术繁殖。产生的转化生物体
可有多种形式。例如，其可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；无性转化体(例如，所有细
胞被转化以包含表达盒)；转化和未转化组织的嫁接物(例如，在植株中，转化的根茎嫁接至
未转化的接穗)。

[0033] 本发明进一步包含上述的启动子在提高外源基因在转基因水稻中表达中的应用。

[0034] 本发明的有益效果：

[0035] 本发明筛选得到一个在水稻全生育期各组织组成型低表达，且表达水平受各种生物逆境诱导上调表达的基因，通过PCR的方法从水稻基因组中分离该基因的启动子区域，将
这个启动子命名为PBBI7，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。利用PBBI7与抗白叶枯人工小
RNA(amiB)，抗稻褐飞虱基因OsLecRK1和抗螟虫基因Cry1C构建融合表达基因，通过农杆菌
介导的方法转化水稻中花11。对获得的转基因水稻苗在接种白叶枯病菌，褐飞虱以及二化
螟前后的RT‑PCR检测，确定PBBI7启动子在不同的生物逆境危害的条件下可以显著提高下
游基因的表达水平，该特征在水稻抗逆基因工程育种中具有良好的应用价值。

附图说明

[0036] 图1：是本发明启动子内源基因在MH63全生育期芯片的表达模式。

[0037] 图2：是本发明启动子内源基因在针刺、白叶枯接种、褐飞虱接种以及二化螟接种下的表达模式。

[0038] 图3：是本发明启动子PBBI7驱动3个抗性基因的转化载体结构示意图。

[0039] 图4：PBBI7‑amiB转基因植株在白叶枯接种72h后转录水平检测结果以及抗性表型。

[0040] 图5：PBBI7‑OSLecRK1转基因植株在褐飞虱接种24h后转录水平检测结果以及抗性表型。

[0041] 图6：PBBI7‑Cry1C转基因植株在二化螟接种48h后转录水平检测结果以及抗性表型。

具体实施方式

[0042] 根据本申请人所在的作物遗传改良国家重点实验室褐飞虱取食水稻的全基因组表达芯片数据及水稻品种明恢63和珍汕97全基因组全生育期表达谱芯片数据，挑选出一个
在水稻全生育期各组织组成型低表达(图1)，并且受不同生物逆境诱导表达上调的基因(图
2)Os01g03390。确定该基因的第一个起始密码子ATG，针对其上游2Kb左右的区间设计引物，
以中花11水稻品种的基因组作为模板，克隆该基因启动子片段并命名为PBBI7。在不同的生
物逆境为害后，转基因植株中不同目标基因表达水平上调明显，证明该启动子片段确实为
一个生物逆境诱导型启动子。

[0043] 本发明通过一步法将启动子PBBI7和NOS终止子分别与amiB，OslecRK1和Cry1c构建到1300上，形成终载体1300‑PBBI7‑amiB，1300‑PBBI7‑OslecRK1和1300‑PBBI7‑Cry1c(图
3)。通过农杆菌介导法将1300‑PBBI7‑amiB，1300‑PBBI7‑OslecRK1和1300‑PBBI7‑Cry1c导
入粳稻品种中花11。对获得的转基因苗接种分别接种白叶枯病菌，褐飞虱以及二化螟，并对
接种前后水稻样品目标基因表达量进行检测，确定PBBI7启动子驱动目标基因的表达模式
(图4，图5和图6)。在不同的生物逆境为害后，转基因植株中不同目标基因表达水平上调明
显，证明该启动子片段确实为一个生物逆境诱导型启动子。

[0044] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0045] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0046] 实施例1

[0047] 启动子的分离

[0048] 根据http://rice.plantbiology.msu.edu/网站获得2015bp BB1‑7基因启动子序列，设计引物P‑F/P‑R利用水稻品种TN1的叶片基因组DNA为模版进行PCR扩增。

[0049] P‑F：agtggtaccaggaatccaaaac；

[0050] P‑R：cctaactgactttaattgtgtggat。

[0051] PCR反应体系为：DNA模板(50ng/μL)2μL、2×KOD Buffer 10μL、10μM P‑F 0.2μL、10μM P‑R 0.2μL、KOD(Toyobo)0.2μL、10mM dNTPs0.4μL、ddH20 7μL；

[0052] 获得BB1‑7基因启动子全长ORF序列的PCR扩增的程序为：98℃3min；98℃20s、54℃30s、68℃1min30s、32个循环；68℃7min；25℃1s，PCR产物测序正确即获得BB1‑7基因启动
子，命名为PBBI7。

[0053] 实施例2

[0054] 载体的构建

[0055] 将实施例中1中的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，对目的条带进行切胶回收。以回收产物为模板，分别以P‑HF/PamiB‑R，P‑HF/PLECRK1‑R，P‑HF/P1C‑R为引物进行PCR扩增，
给基因启动子加上不同的接头。

[0056] P‑HF：cgacggccagtgccaagcttagtggtaccaggaatccaaa；

[0057] PamiB‑R：ctgtggctgctgctgggatcccctaactgactttaattgtg；

[0058] PLECRK1‑R：aagagcaggagggccaccatcctaactgactttaattgtg；

[0059] P1C‑R：cactggttctgattgttctcctccatcctaactgactttaattgtgtgg。

[0060] PCR反应体系为：DNA模板(50ng/μL)2μL、2×KOD Buffer 25μL、10μM F 0.5μL、10μM R 0.5μL、KOD(Toyobo)0.5μL、10mM dNTPs 1μL、ddH20 20.5μL；

[0061] PCR扩增的程序为：98℃3min；98℃20s、68℃2min、35个循环；68℃7min；25℃1s。

[0062] 将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，对目的条带进行切胶回收，分别得到PamiB(序列1+3)、PLECRK1(序列1+4)和P1C(序列1+5)。

[0063] 分别以含有amiB、OsLecRK1和Cry1C基因的质粒为模板，以amiB‑F/R，LECRK1‑F/LECRK1‑R，1C‑F/1C‑R为引物进行PCR扩增，给amiB、Lecrk1、Cry1C基因也加上相应的接头。

[0064] amiB‑F：cacaattaaagtcagttaggggatcccagcagcagccacag；

[0065] amiB‑R：gatcggggaaattcgagctcggtaccgctgctgatgctgat；

[0066] LECRK1‑F：cacaattaaagtcagttaggatggtggccctcctgctctt；

[0067] LECRK1‑R：gatcggggaaattcgagctcctacgggagagagctgatga；

[0068] 1C‑F：ccacacaattaaagtcagttaggatggaggagaacaatcagaaccagtg；

[0069] 1C‑R：cgatcggggaaattcgagctcctacttttgtgctctttcaagg。

[0070] PCR反应体系为：DNA模板(50ng/μL)2μL、2×KOD Buffer 25μL、10μM F 0.5μL、10μM R 0.5μL、KOD(Toyobo)0.5μL、10mM dNTPs 1μL、ddH20 20.5μL；

[0071] PCR扩增的程序为：98℃3min；98℃20s、68℃2min、35个循环；68℃7min；25℃1s。

[0072] 将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，对目的条带进行切胶回收，分别得到amiB、OsLECRK1、和Cry1c。

[0073] HindIII+SacI双酶切pCAMBIA1300‑NOS载体，在37℃反应1h，双酶切的反应体系如下：10×Buffer 10μl、pCAMBIA1300‑NOS载体5μg、HindIII1μl、SacI 1μl、补水至100μl，将
回收产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，对目的条带进行切胶回收，得到线性化的载体1300‑
NOS。采用诺唯赞公司One Step Cloning Kit进行重组反应，体系如下：5×CE II Buffer 4
μl、线性化克隆载体1300‑NOS 250ng、插入片段PamiB和amiB各100ng、 II 2μl、补
水至20μl。体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡(请勿
剧烈震荡或者涡旋混匀)；置于37℃反应30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中
冷却5min；取20μl冷却反应液，加入到200μl感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置
30min。42℃热激45～90秒，冰水浴孵育2min；加入600μl LB培养基，37℃孵育10min充分复
苏；37℃摇菌45min；取100μl菌液均匀涂布在含有Kan+(50mg/ml)的LB平板上；将平板倒置，
于37℃过夜培养。

[0074] 挑取单克隆进行质粒抽提(常规质粒抽提方法即可)，并用HindIII+SacI进行酶切，37℃反应20min，对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，把阳性克隆送测序，测序正确的
质粒即为1300‑PBBI7‑amiB。同理构建为1300‑PBBI7‑LECRK1和1300‑PBBI7‑Cry1C。HindIII
+SacI双酶切的反应体系如下：10×Buffer 2μl、重组质粒2μl、HindIII 0.2μl、SacI 0.2μ
l、补水至20μl。

[0075] 实施例4

[0076] 表达载体的遗传转化

[0077] 参考Lin等(2005)年发表的农杆菌介导的转化方法，将构建的3个表达载体1300‑PBBI7‑amiB，1300‑PBBI7‑OslecRk3和1300‑PBBI7‑Cry1c转化到粳稻品种中花11中。利用潮
霉素抗性基因的PCR引物Hpt‑F和Hpt‑R进行转基因植株的PCR阳性筛选。

[0078] Hpt‑F：agaatctcgtgctttcagcttcga；

[0079] Hpt‑R：tcaagaccaatgcggagcatatac。

[0080] PCR反应体系为：DNA模板(50ng/μL)2μL、2×KOD Buffer 25μL、10μM Hpt‑F 0.5μL、10μM Hpt‑R 0.5μL、KOD(Toyobo)0.5μL、10mM dNTPs1μL、ddH20 20.5μL；

[0081] PCR扩增的程序为：98℃3min；98℃20s、68℃2min、35个循环；68℃7min；25℃1s。

[0082] 将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，3个载体分别获得了38、29和25个独立的T0代阳性转化植株。

[0083] 实施例5

[0084] 1300‑PBBI7‑amiB转基因植株的白叶枯抗性鉴定以及amiB表达模式鉴定

[0085] 为了检测转基因植物是否获得了预期的抗病性，我们在分蘖盛期，对所有的T0转基因植株接种了白叶枯病菌生理小种PXO99(作物遗传改良国家重点实验室保存菌株，使用
比浊法，接菌浓度控制在9亿到12亿/ml之间)。每个转基因单株接种5‑6片叶，接种后14天考
察病斑长度和病斑面积。接种结果表明，野生型中花11发病明显，而转基因1300‑PBBI7‑
amiB表现出了极强的白叶枯抗性。

[0086] amiB基因通过沉默水稻内源基因Xa13在叶片中的表达从而达到抗病效果，但是花药中Xa13的表达如果受到影响就会造成育性下降。

[0087] 对野生型中花11对照和部分具有高抗病性转基因水稻株系进行了花粉碘化钾染色(0.67％的碘化钾和0.33％的碘)的检测，结果表明大多数转基因水稻(包括高抗病的植
株)花粉发育正常，与对照无明显差异(图4)。

[0088] Ubiquitin‑F：gttcgcccagttgacatctc；

[0089] Ubiquitin‑R：cagattgttgaggttagtattgc。

[0090] 表达量检测显示，在未接种白叶枯病菌时叶片中amiB表达量非常低，接种白叶枯病菌72小时后表达量显著上调，有助于水稻达到抗病的效果。同时amiB在转基因水稻花药
中表达量低，没有影响靶基因Xa13在花药中的功能从而保证了花药水稻育性的正常。

[0091] 实施例6

[0092] 1300‑PBBI7‑LecRK1转基因植株的稻褐飞虱抗性鉴定以及LecRK1表达模式鉴定

[0093] 为了检测转基因植物是否获得了预期的褐飞虱抗性，我们在分蘖期，对部分T0转基因阳性植株接种了褐飞虱。等野生型中花11死亡后统计转基因水稻的褐飞虱抗性。接种
结果表明，转基因1300‑PBBI7‑LecRK1表现出了极强的褐飞虱抗性。(图5)。

[0094] 表达量检测显示，在未接种褐飞虱时转基因水稻中LecRK1表达量非常低，接种褐飞虱24小时后表达量显著上调，有助于水稻达到抗褐飞虱的效果。

[0095] 实施例7

[0096] 1300‑PBBI7‑Cry1C转基因植株的二化螟抗性鉴定以及Cry1C表达模式鉴定

[0097] 为了检测转基因植物是否获得了预期的二化螟抗性，我们在分蘖盛期，对部分T0转基因阳性植株接种了二化螟。等野生型中花11死亡后统计转基因水稻的二化螟抗性。接
种结果表明，该启动子驱动的Cry1C表现出了二化螟取食的诱导性，并且表现出了抗二化螟
表型，转基因1300‑PBBI7‑Cry1C表现出了极强的二化螟抗性。(图6)。

[0098] 表达量检测显示，在未接种二化螟时转基因水稻中Cry1C表达量非常低，接种二化螟24小时后表达量显著上调，有助于水稻达到抗二化螟的效果。

[0099] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。