一种生物催化制备(R)-1-(3-三氟甲基苯基)乙醇的方法

摘要

本发明公开了一种生物催化制备(R)‑1‑(3‑三氟甲基苯基)乙醇的方法，以重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以间三氟甲基苯乙酮为底物，加入辅助底物，以pH 6.0～8.0磷酸缓冲液为反应介质构成转化体系，于20～40℃、200rpm条件下进行生物催化不对称还原反应，反应结束后，反应液经分离纯化得到(R)‑1‑(3‑三氟甲基苯基)乙醇；本发明当底物浓度为400mM时，产物(R)‑1‑(3‑三氟甲基苯基)乙醇的产率为74.2％，e.e.值>99.9％，表现出更优的催化效率。

权利要求

1.一种生物催化制备 (R)‑1‑(3‑三氟甲基苯基)乙醇的方法，其特征在于所述方法为：以重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以间三氟甲基苯乙酮为底物，加入辅助底物和低共熔溶剂，以pH7.0～8.0磷酸缓冲液为反应介质构成转化体系，于30～35℃、

200 rpm条件下进行生物催化不对称还原反应，反应结束后，反应液经分离纯化得到(R)‑1‑(3‑三氟甲基苯基)乙醇；所述辅助底物为异丙醇；所述重组大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)‑LXCAR；

所述转化体系由催化剂、底物、辅助底物、低共熔溶剂和磷酸缓冲液构成；所述低共熔溶剂组成中的氢键受体和氢键供体的摩尔比为1:1；所述氢键受体为氯化胆碱，所述氢键供体为赖氨酸；

所述催化剂加量以转化体系总体积计为40 60 g/L；所述底物加量以转化体系总体积~

计为100 mmol/L；所述辅助底物体积加入量以转化体系总体积计为15 20%；所述低共熔溶~

剂加入量以转化体系总体积计为1 4%；

~

所述重组大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)‑LXCAR按如下方法构建：以含雷弗松氏菌（Leifsonia xyli）HS0904源短链脱氢酶的质粒pET28a(+)为模板，经易错PCR、定点突变获得突变体LXCAR，该突变体核苷酸序列为SEQ IDNO.3所示；将获得的突变体基因与表达质粒pET28a(+)连接后转入大肠杆菌BL21(DE3)，从而构建获得了含雷弗松氏菌（Leifsonia xyli）HS0904短链脱氢酶突变体基因的重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET28a(+)‑LXCAR；

SEQ IDNO.3：

atggcgcagt acgacgtggc cggacggtcc gcgatcgtga ccggaggcgg ctcgggcatc   60gggcgcgcca tcgccctcac cctcgcggcg agcggagcgg ccgtcctcgt caccgacctg   120aacgaggaaa acgcaaatgc cgtcgtggcg gagatcagcg ccgcgggcgg caccgcgcgg   180gcactcgccg gcgatgtgac cgacccggcc ttcgccgagg ccagcgtcgc ggccgcgaac   240gagctggccc cgctgcgcat cgccgtcaac aacgccggca tcggcggagc ggcagcaccg   300gtcggcgact acccgctcga ctcgtggcgc aaggtcatcg aggtcaacct caacgccgtc   360ttctacggga tgcaggcgca gctcgacgcg atcggcgcga acggcggcgg cgcgatcgtc   420aacatggcgt ccatcctggg cagcgtcggc ttcgccaact attcggcgta cgtcaccgcg   480aagcacgcgc tgctcggcct gacgcagaac gcggcgctgg agtacgccgg caagaacgtc   540cgtgtcgtcg cggtcggccc cggcttcatc cgcaccccgc tcgtggcgtc gaacatggac   600gcggacaccc tcgccttcct cgagggcaag cacgcgctcg gccgcctggg cgagccggag   660gaggtcgcct cgctggtcgc gttcctcgcc tccgacgccg ccagcttcat caccggcagc   720taccacctgg tcgacggagg ctacacagca caatag                             756。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述催化剂的制备方法为：重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)‑LXCAR接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200 rpm振荡培养12 h，再以体积浓度1%的接种量接种到新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200  rpm培养至菌体浓度OD600为0.6～0.9后，向培养液中加入终浓度为

0.1mmol/L的异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷，置于30℃、200 rpm下诱导培养10 h；培养结束后，

4℃、10000 rpm离心10 min，收集菌体，用生理盐水洗涤菌体两次，收集湿菌体，即为重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)‑LXCAR湿菌体。

说明书

一种生物催化制备(R)‑1‑(3‑三氟甲基苯基)乙醇的方法

(一)技术领域

[0001] 本发明涉及一种(R)‑1‑(3‑三氟甲基苯基)乙醇的制备方法，特别涉及利用重组大肠杆菌高选择性生物催化间三氟甲基苯乙酮不对称还原制备(R)‑1‑(3‑三氟甲基苯基)乙
醇的方法。
(二)技术背景

[0002] (R)‑3‑(1‑(3‑(三(三氟甲基)苯基)乙氧基)氮杂环丁烷‑1‑羧酰胺是一种神经保护类化合物，可用于治疗脑缺血、中枢神经系统损伤或眼疾。在小鼠永久性MCAo模型中，闭
塞前30分钟给药时，该化合物以60mg/kg的剂量显示出显著的神经保护作用。(R)‑1‑(3‑三
氟甲基苯基)乙醇((R)‑MTF‑PEL)，分子式C9H9F3O，CAS号：127852‑24‑8，是制备该神经保护
剂的关键手性中间体。

[0003] 来国桥等人以手性呋喃亚胺和醋酸锌反应生成的络合物为催化剂，还原间三氟甲基苯乙酮得到(R)‑1‑(3‑(三氟甲基苯基)乙醇。底物间三氟甲基苯乙酮的浓度为500mM，反
应时间为45h，收率为81％，光学纯度为60％，该方法得到的产物对映体选择性偏低反应时
间较长。盖萍等人筛选得到一株氧化微杆菌C3(Microbacterium oxydans C3)，可不对称还
原底物间三氟甲基苯乙酮为(R)‑1‑(3‑(三氟甲基苯基)乙醇，反应的底物浓度较低，仅为
5mM，37℃转化24h，底物转化率和e.e.值分别为88％和99％。许建和等人利用来源于耐热克
鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)CGMCC 2.1492羰基还原酶构建的重组大肠杆
菌细胞，对底物间三氟甲基苯乙酮进行生物还原，底物浓度为10mM，30℃反应12h，底物转化
率为99％，e.e.值大于99％。目前报道的利用微生物细胞催化制备(R)‑1‑(3‑(三氟甲基苯
基)乙醇存在催化底物浓度偏低，催化效率不理想等问题。

[0004] 低共熔溶剂是由氢键受体(HBA)和氢键供体(HBD)之间通过氢键作用而形成的透明均一液态共熔盐。它具有比常规有机溶剂和离子液体更优越的性能，例如，低熔点，可设
计性，良好的生物相容性，易于制备，稳定性高且环境友好。天然低共熔溶剂主要是由天然
的初级代谢产物组成，例如糖，糖醇，有机酸，氨基酸和胺，通常还含有一定摩尔比的水，它
具有比一般低共熔溶剂更佳的生物相容性和可持续性。

[0005] 本发明利用源于雷弗松氏菌短链脱氢酶构建的重组大肠杆菌工程菌BL21(DE3)/pET28a(+)‑LXCAR静息细胞为催化剂，在含氯化胆碱：赖氨酸(ChCl:Lys)低共熔溶剂‑缓冲
液介质体系中转化间三氟甲基苯乙酮制备(R)‑1‑(3‑三氟甲基苯基)乙醇((R)‑MTF‑PEL)。
由于低共熔溶剂可改变作为催化剂的微生物细胞膜通透性，减少底物和产物的抑制作用，
从而可进一步提高还原反应效率。
(三)发明内容

[0006] 本发明目的是提供一种利用重组大肠杆菌催化间三氟甲基苯乙酮不对称还原制备(R)‑1‑(3‑三氟甲基苯基)乙醇的新方法。该方法较化学还原法具有立体选择性高，催化
剂制备成本低，反应条件温和、操作简单、环境友好等优点，并且可催化的底物浓度以及产
物的产率和e.e.值均较高。

[0007] 本发明采用的技术方案：

[0008] 本发明提供一种生物催化制备(R)‑1‑(3‑三氟甲基苯基)乙醇((R)‑MTF‑PEL)的方法，所述方法为：以源于雷弗松氏菌的短链脱氢酶(LXCAR)构建的重组大肠杆菌经发酵培养
获得的湿菌体为催化剂，以间三氟甲基苯乙酮为底物，加入辅助底物，以pH 6.0～8.0(优选
pH 7.5)磷酸缓冲液为反应介质构成转化体系，于20～40℃、200rpm条件下进行生物催化不
对称还原反应，反应结束后，反应液经分离纯化得到(R)‑1‑(3‑三氟甲基苯基)乙醇产物；所
述辅助底物为葡萄糖、甘油、麦芽糖、乳糖、异丙醇、乙醇或正丁醇中的一种，优选异丙醇；所
述重组大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)‑LXCAR。

[0009] 进一步，所述催化剂加量以转化体系总体积计为20～160g/L(优选160g/L)；所述底物加量以转化体系总体积计为50～400mmol/L(优选400mmol/L)；所述辅助底物为葡萄
糖、麦芽糖、乳糖时，加入量以转化体系总体积计为100g/L；所述辅助底物为甘油时，加入量
以转化体系总体积计为60g/L；所述辅助底物为异丙醇、乙醇或正丁醇时，体积加入量以转
化体系总体积计为5～30％(优选10％)。

[0010] 更进一步，所述转化体系由催化剂、底物、辅助底物、低共熔溶剂和磷酸缓冲液构成，所述低共熔溶剂加入量以转化体系总体积计为1～10％(优选4％)。

[0011] 所述低共熔溶剂组成中的氢键受体(HBA)和氢键供体(HBD)摩尔比为1:1。所述低共熔溶剂中的HBA为氯化胆碱、甜菜碱、L‑肉碱、L‑脯氨酸中之一，HBD为天然氨基酸、异丙
醇、尿素、果糖、海藻糖、葡萄糖、甘油中之一。

[0012] 本发明所述低共熔溶剂优选为下列之一：氯化胆碱：赖氨酸(ChCl:Lys)、氯化胆碱：尿素(ChCl:U)、氯化胆碱：异丙醇(ChCl:IPA)、氯化胆碱：甘氨酸(ChCl:Gly)、氯化胆碱：
丙氨酸(ChCl:Ala)、氯化胆碱：色氨酸(ChCl:Trp)、氯化胆碱：酪氨酸(ChCl:Tyr)、氯化胆
碱：谷氨酸(ChCl:Glu)、氯化胆碱：谷胱甘肽(ChCl:GSH)、氯化胆碱：果糖(ChCl:Flu)、氯化
胆碱：海藻糖(ChCl:Myc)、甜菜碱：异丙醇(B:IPA)、甜菜碱：半胱氨酸(B:Cys)、甜菜碱：丙氨
酸(B:Ala)、甜菜碱：赖氨酸(B:Lys)、甜菜碱：谷氨酸(B:Glu)、L‑肉碱：赖氨酸(C:Lys)、L‑脯
氨酸：赖氨酸(P:Lys)、L‑肉碱：葡萄糖：甘油(C:Glc:G)，摩尔比均为1:1。优选低共熔溶剂种
类为氯化胆碱：赖氨酸(ChCl:Lys)。

[0013] 本发明所述重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)‑LXCAR的构建过程详见申请人在先前专利申请(CN104212841A，公开日期2014年12月17日)。所述催化剂的制备方法为：重组
大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)‑LXCAR接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37
℃、200rpm振荡培养12h，再以体积浓度1％的接种量接种到新鲜的含50μg/mL卡那霉素的LB
液体培养基中，37℃、200rpm培养至菌体浓度OD600为0.6～0.9后，向培养液中加入终浓度为
0.1mM的异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷(IPTG)，30℃、200rpm下诱导培养10h。培养结束后，4℃、
10000rpm离心10min，收集菌体，用生理盐水洗涤菌体两次，收集湿菌体，即为重组大肠杆菌
BL21(DE3)/pET28a(+)‑LXCAR湿菌体。

[0014]

[0015] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明利用重组大肠杆菌全细胞为催化剂，通过生物不对称还原间三氟甲基苯乙酮制备(R)‑1‑(3‑三氟甲基苯基)乙醇。
该方法具有产物立体选择性高，工艺简单，环境友好，反应产率高等优点，并且在生物还原
过程中通过添加价廉的辅助底物，可实现辅酶的原位再生。同时在反应介质体系中加入低
共熔溶剂氯化胆碱：赖氨酸(ChCl:Lys)，显著提高了反应的底物浓度和产率。许建和等人利
用来源于耐热克鲁维酵母的羰基还原酶构建重组工程菌，对间三氟甲基苯乙酮底物进行生
物催化，反应的底物浓度较低，为10mM，30℃反应12h，底物转化率为99％，e.e.值大于99％。
本发明提出了利用重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)‑LXCAR全细胞生物还原间三氟甲基
苯乙酮制备(R)‑1‑(3‑三氟甲基苯基)乙醇的新方法，当底物浓度为100mM时，产物(R)‑1‑
(3‑三氟甲基苯基)乙醇的产率为93.8％，e.e.值>99.9％。当反应介质体系中加入低共熔溶
剂氯化胆碱：赖氨酸(ChCl:Lys)，底物浓度提高到400mM时，产物(R)‑1‑(3‑三氟甲基苯基)
乙醇的产率为74.2％，e.e.值>99.9％，表现出更优的催化效率。与已报道的转化菌株相比，
本发明提出的重组大肠杆菌催化间三氟甲基苯乙酮的底物浓度和产物产率均较高。
(四)附图说明

[0016] 图1为底物间三氟甲基苯乙酮标准品和产物1‑(3‑三氟甲基苯基)乙醇标准品的气相检测图谱。

[0017] 图2为重组工程菌BL21(DE3)/pET28a(+)‑LXCAR催化间三氟甲基苯乙酮还原反应萃取液的气相检测色谱图(含内标十二烷)。
(五)具体实施方式

[0018] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0019] 本发明中湿菌体，间三氟甲基苯乙酮底物，辅助底物，表面活性剂，低共熔溶剂的加量，均以转化体系总体积计量。本发明所述催化剂用量除特别说明外，均以湿重计。

[0020] 本发明所述低共熔溶剂购自上海复捷化工有限公司。

[0021] 实施例1：以不同种类的微生物细胞为生物催化剂，进行间三氟甲基苯乙酮的不对称还原反应。

[0022] 1、催化剂

[0023] (1)重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)‑LXCAR湿菌体

[0024] 重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)‑LXCAR的构建过程详见申请人在先前专利申请(公开号：CN104212841A，公开日期2014年12月17日)实施例1。

[0025] 将构建获得的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)‑LXCAR接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养12h，再以体积浓度1％的接种量接种到新
鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至菌体浓度OD600为0.6～
0.9后，向培养液中加入终浓度为0.1mM的异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷(IPTG)，置于30℃、
200rpm下诱导培养10h。培养结束后，4℃、10000rpm离心10min，收集菌体，用生理盐水洗涤
菌体两次，收集湿菌体，即为重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)‑LXCAR湿菌体。LB液体培
养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 9g/L，溶剂为水，pH自然。

[0026] (2)土星轮头酵母ZJPH1807湿菌体

[0027] 土星轮头酵母(Cyberlindnera saturnus)ZJPH1807保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2019215，保藏日期为2019年3月
29日，已在申请人先前的专利申请(公开号：CN110283733A，公开日期：2019年9月27日)中公
开。

[0028] 土星轮头酵母ZJPH 1807湿菌体的制备方法同专利申请(公开号：CN110283733A)实施例3。

[0029] (3)半乳糖地霉ZJPH1810湿菌体

[0030] 半乳糖地霉(Galactomyces geotrichum)ZJPH1810保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2019822。保藏日期为2019年10月14
日，已在申请人先前的专利申请(公开号：CN110760449A，公开日期：2020年02月07日)中公
开。

[0031] 半乳糖地霉ZJPH1810湿菌体的制备同先前的专利申请(公开号：CN110760449A)实施例2。

[0032] (4)白地霉ZJPH1704湿菌体

[0033] 白地霉(Geotrichum candidum)ZJPH1704保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉，武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2017380。保藏日期为2017年6月26日，保藏
邮编430072，已在申请人先前的专利申请(公开号：CN107746861A，公开日期：2018年3月2
日)中公开。

[0034] 白地霉ZJPH1704湿菌体的制备方法同先前的专利申请(公开号：CN107746861A)实施例2。

[0035] (5)铜绿假单胞菌ZJPH1504湿菌体

[0036] 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ZJPH1504保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2016188。已在专利申请(申请号
CN201610369158.5，申请日2016年5月27日)中公开。

[0037] 铜绿假单胞菌ZJPH1504湿菌体的制备方法同先前的专利申请(申请号：201610369158.5，申请日2016年5月27日)实施例3。

[0038] 2、间三氟甲基苯乙酮的不对称还原

[0039] 在50mL三角瓶中加入5mL磷酸缓冲液(200mM，pH 7.0)，再加入终浓度为50g/L的湿菌体(表1所示)为催化剂、终浓度为100g/L的葡萄糖为辅助底物、终浓度为50mM的底物间三
氟甲基苯乙酮构成5mL转化体系，30℃、200rpm条件下转化12h。

[0040] 3、检测方法

[0041] 转化反应结束后，将反应液用等体积的乙酸乙酯萃取，离心收集乙酸乙酯层，采用气相色谱法测定产物的产率和e.e.值。

[0042] 气相色谱的检测条件为：美国安捷伦气相色谱仪，N2000色谱工作站，美国Chirasil‑Dex CB毛细管柱。载气为氮气；流速为2mL/min；进样量：1μL；分流比为15:1；检测
器为氢火焰离子检测器；进样口温度和检测器温度为250℃；柱温为程序升温：115℃保留
2min，然后以2℃/min升温至140℃，保留1min。各物质的保留时间分别为：底物间三氟甲基
苯乙酮2.64min，十二烷3.94min，(S)‑1‑(3‑三氟甲基苯基)乙醇6.92min，以及(R)‑1‑(3‑三
氟甲基苯基)乙醇6.35min。底物间三氟甲基苯乙酮，以及光学纯产物1‑(3‑三氟甲基苯基)
乙醇标准品的气相检测色谱图见图1，不同种类的微生物细胞生物转化结果见表1，重组工
程菌BL21(DE3)/pET28a(+)‑LXCAR催化间三氟甲基苯乙酮还原反应萃取液的气相检测色谱
图见图2。

[0043] 产率计算方法为：

[0044] 内标法：以十二烷为内标物，测得产物浓度标准曲线。测定时在样品中加入十二烷为内标物，根据内标物浓度计算得出产物浓度。

[0045] 产物的产率由下述公式计算获得：

[0046] 产率＝Cp/C0

[0047] 式中Cp为(R)‑1‑(3‑三氟甲基苯基)乙醇浓度，C0为间三氟甲基苯乙酮初始浓度。

[0048] 产物的光学纯度由对映体过量值(enantiomeric excess,e.e.)来表征。计算公式为：

[0049]

[0050] 式中CR和CS分别为R‑1‑(3‑三氟甲基苯基)乙醇和S‑1‑(3‑三氟甲基苯基)乙醇的摩尔浓度。

[0051] 表1不同全细胞生物催化剂对产物产率、e.e.值和构型的影响

[0052]

[0053] 实施例2：辅助底物种类的影响

[0054] 在50mL三角瓶中加入5mL磷酸缓冲液(200mM，pH 7.0)，加入终浓度为50g/L的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)‑LXCAR湿菌体、不同种类的辅助底物(表2)，终浓度为50mM
底物间三氟甲基苯乙酮构成5mL转化体系，30℃、200rpm条件下转化12h。反应结束后，采用
实施例1方法测定产率和e.e.值，结果见表2所示。结果表明，采用异丙醇为辅助底物时的产
率最高，达86.2％，产物e.e.值大于99.9％。

[0055] 表2不同辅助底物对产物产率和ee值的影响

[0056]

[0057]

[0058] 实施例3：缓冲液pH值对转化结果的影响

[0059] 在50mL三角瓶中加入pH值为6.0～8.0磷酸缓冲液(200mM)，加入终浓度为50g/L重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)‑LXCAR湿菌体、10％(v/v)异丙醇为辅助底物，终浓度为
50mM间三氟甲基苯乙酮底物构成5mL转化体系。30℃、200rpm条件下转化12h。反应结束后，
采用实施例1方法测定产率和产物e.e.值，结果见表3。结果表明，最适的缓冲液pH值为7.5，
此时产率为89.6％。

[0060] 表3缓冲液pH值对反应产率和e.e.值的影响

[0061]

[0062] 实施例4：缓冲液离子强度对转化结果的影响

[0063] 在50mL三角瓶中加入50‑400mM的磷酸缓冲液(pH 7.5)、终浓度为50g/L重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)‑LXCAR湿菌体、10％(v/v)异丙醇和终浓度为50mM底物间三氟甲
基苯乙酮构成5mL转化体系。30℃、200rpm条件下转化12h。反应结束后，采用实施例1方法测
定产率和产物e.e.值，结果见表4。结果表明，最适的离子强度为100mM。

[0064] 表4缓冲液离子强度对该还原反应产率和e.e.值的影响

[0065]

[0066] 实施例5：异丙醇加量对转化结果的影响

[0067] 在50mL三角瓶中加入磷酸缓冲液(100mM，pH 7.5)、终浓度为50g/L重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)‑LXCAR湿菌体、终浓度为5‑30％(v/v)异丙醇辅助底物，终浓度为
100mM底物间三氟甲基苯乙酮构成5mL转化体系。30℃、200rpm条件下转化12h。反应结束后，
采用实施例1方法测定产率和产物e.e.值，结果见表5。结果表明，最适的异丙醇加量为
15％。

[0068] 表5不同异丙醇加量对产物的产率和e.e.值的影响

[0069]

[0070] 实施例6：反应温度对转化结果的影响

[0071] 在50mL三角瓶中加入磷酸缓冲液(100mM，pH 7.5)、终浓度为50g/L重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)‑LXCAR湿菌体、终浓度为15％(v/v)异丙醇辅助底物，终浓度为100mM
底物间三氟甲基苯乙酮构成5mL转化体系。20℃～40℃、200rpm条件下转化12h。反应结束
后，采用实施例1方法测定产率和产物e.e.值，结果见表6。结果表明，最适转化温度为30℃。

[0072] 表6转化温度对产物的产率和e.e.值的影响

[0073]

[0074] 实施例7：湿菌体添加量对转化结果的影响

[0075] 在50mL三角瓶中加入磷酸缓冲液(100mM，pH 7.5)、终浓度为20‑100g/L的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)‑LXCAR湿菌体、终浓度为15％(v/v)异丙醇辅助底物和终浓度
分别为100mM和200mM的底物间三氟甲基苯乙酮构成5mL转化体系。30℃、200rpm条件下转化
12h。反应结束后，采用实施例1方法测定产率和产物e.e.值，结果见表7。结果表明，底物浓
度为100mM时，最适的湿菌体添加量为40g/L；底物浓度为200mM时，最适的湿菌体添加量为
80g/L。

[0076] 表7湿菌体添加量对产物的产率和e.e.值的影响

[0077]

[0078] 实施例8：转化时间对转化结果的影响

[0079] 在50mL三角瓶中加入磷酸缓冲液(100mM，pH 7.5)、终浓度分别为40g/L和80g/L的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)‑LXCAR湿菌体、终浓度为15％(v/v)异丙醇辅助底物和
终浓度分别为100mM和200mM的底物间三氟甲基苯乙酮构成5mL转化体系。30℃、200rpm条件
下转化不同时间。反应结束后，采用实施例1方法测定产率和产物e.e.值，结果见表8。结果
表明，最佳转化时间为21h。

[0080] 表8反应时间对还原反应产率和e.e.值的影响

[0081]

[0082] 实施例9：加入不同种类的低共熔溶剂对转化结果的影响

[0083] 在50mL三角瓶中加入3.25mL磷酸缓冲液(100mM，pH 7.5)、终浓度为160g/L重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)‑LXCAR湿菌体、终浓度为10g/L不同种类的低共熔溶剂，终浓
度为15％(v/v)异丙醇辅助底物和终浓度为400mM底物间三氟甲基苯乙酮构成5mL转化体
系。30℃、200rpm条件下转化21h。反应结束后，采用实施例1方法测定产率和产物e.e.值，同
样条件下以不含低共熔溶剂的体系作为对照，结果见表9。

[0084] 表9加入不同种类的低共熔溶剂对产物的产率和e.e.值的影响

[0085]

[0086] 由表9可知，在含不同种类低共熔溶剂的转化体系中，所得产物的产率均为99.9％以上，但不同种类的低共熔溶剂对还原产率的影响不同。以氯化胆碱：赖氨酸(摩尔比为1:
1)为最佳，其产率为70.2％，而不含低共熔溶剂的转化体系的产率为66.8％。因此，优选的
低共熔溶剂种类为氯化胆碱:赖氨酸(ChCl:Lys)。

[0087] 实施例10：氯化胆碱：赖氨酸(ChCl:Lys)加量对转化结果的影响

[0088] 在50mL三角瓶中加入3.25mL磷酸缓冲液(100mM、pH 7.5)、终浓度为160g/L重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)‑LXCAR湿菌体、1‑10％(v/v)氯化胆碱：赖氨酸(ChCl:Lys)、终
浓度为15％(v/v)异丙醇辅助底物和终浓度为400mM的底物间三氟甲基苯乙酮5mL转化体
系。30℃、200rpm条件下转化21h，反应结束后采用实施例1方法测定产率和产物e.e.值，结
果见表10。

[0089] 表10氯化胆碱：赖氨酸(ChCl:Lys)加量对产物的产率和e.e.值的影响

[0090]

[0091] 由表10可知，当氯化胆碱：赖氨酸(ChCl:Lys)加量为4％，底物终浓度为400mM时，产率为74.2％。