一种β-葡聚糖酶、其编码基因IDSGH5-26及其应用

摘要

本发明领域涉及一种葡聚糖酶，具体涉及一种β‑葡聚糖酶、其编码基因IDSGH5‑26及其应用，属于基因工程领域。一种编码所述湖羊瘤胃微生物来源的β‑葡聚糖酶的β‑葡聚糖酶基因IDSGH5‑26，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明所述的β‑葡聚糖酶最适温度为50℃，在40℃条件下保持良好的稳定性。该酶最适pH为5.0且具有较强的pH耐受性，在pH4.0‑10.0能保持74%以上的活性，其降解β‑葡聚糖的产物是单糖和聚合度为2~4的低聚纤维寡糖。该重组β‑葡聚糖酶具有良好的工业应用价值。

权利要求

1.一种编码湖羊瘤胃微生物来源的β‑葡聚糖酶的β‑葡聚糖酶基因IDSGH5‑26，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种包含权利要求1所述的β‑葡聚糖酶基因IDSGH5‑26的重组载体。

3.一种包含权利要求1所述的β‑葡聚糖酶基因IDSGH5‑26的重组菌。

4.一种制备β‑葡聚糖酶的方法，是发酵培养权利要求3所述的重组菌，得到β‑葡聚糖酶。

5.扩增权利要求1所述β‑葡聚糖酶基因IDSGH5‑26采用的特异性引物，其特征在于所述的特异性引物为：IDSGH5‑26‑F: 5’ ACAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGTTGAATAAACTTAAAGTTATAAATGG 3’；

IDSGH5‑26‑R: 5’ CTTGTCGACGGAGCTCGAATTCTTATCTGTCATTCTCCTCATCTG 3’。

6.一种权利要求1所述的β‑葡聚糖酶基因IDSGH5‑26编码的β‑葡聚糖酶在广泛pH条件下降解纤维多糖方面的应用，其特征在于：所述的广泛pH条件为4.0‑10.0。

7.一种β‑葡聚糖酶的获取方法，其特征在于该方法包括以下步骤：a、β‑葡聚糖酶基因IDSGH5‑26的克隆及重组质粒pET28a/IDSGH5‑26的构建；

b、重组质粒pET28a/IDSGH5‑26在大肠杆菌BL21中的表达；

c、重组蛋白的诱导、纯化及酶学特性分析；β‑葡聚糖酶基因IDSGH5‑26的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤aβ‑葡聚糖酶基因IDSGH5‑26的克隆及重组质粒pET28a/IDSGH5‑26的构建过程具体如下：①PCR扩增β‑葡聚糖酶基因IDSGH5‑26并纯化；

②同时用BamHI和EcoRI对pET28a载体进行双酶切；

③纯化后的IDSGH5‑26与双酶切后的pET28a进行同源重组；

④重组质粒pET28a/IDSGH5‑26转化至大肠杆菌BL21感受态细胞。

说明书

一种β‑葡聚糖酶、其编码基因IDSGH5‑26及其应用

技术领域

[0001] 本发明领域涉及一种葡聚糖酶，具体涉及一种β‑葡聚糖酶、其编码基因IDSGH5‑26及其应用，属于基因工程领域。

背景技术

[0002] β‑葡聚糖由数百甚至上千个β‑D‑葡萄糖残基通过β‑1,3和β‑1,4‑糖苷键连接形成的线性多聚糖，是禾本科植物细胞壁的主要结构性多糖成分之一，约占其干物质的5.5％，同时也广泛存在于细菌、酵母、大型真菌等微生物的细胞壁。作为一类非淀粉多糖(non‑starch polysaccharide，NSP)，β‑葡聚糖是植物性饲料中一种重要的抗营养因子。它具有高粘稠性且不易被降解，难以被猪、禽等单胃动物消化吸收利用，这会导致谷物及其相关饲料的利用率下降，大大提高了养殖成本。

[0003] β‑葡聚糖酶是指能够降解β‑葡聚糖的一大类糖苷水解酶(Glycoside hydrolases，GHs)，作为饲料添加剂、多糖改性增溶剂等在饲料工业和食品工业中具有重要应用价值。β‑葡聚糖酶在工业上的高效应用取决于其在高温、pH等环境中维持较高的催化活性。近年来，新酶筛选、非理性/半理性/理性改造、计算机模拟等方法分析和改造β‑葡聚糖酶的酶学性质，取得了一定成果。但是目前得到的β‑葡聚糖酶依然存在缺陷，尤其是β‑葡聚糖酶的耐酸性不足。因此寻找大量新型β‑葡聚糖酶至关重要。随组学技术在微生物基因组测序方面的应用，获得越来越多遗传背景清晰的纤维素酶，有效的丰富了传统的酶系统。而转录组测序提供基因的cDNA序列和基因的表达水平，更加准确地反映了蛋白在体内的表达情况。因此，从瘤胃微生物转录组发掘葡聚糖酶基因是新颖且行之有效的研究方向。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种β‑葡聚糖酶，该酶具有较强的pH耐受性，在pH4.0‑10.0能保持74％以上的酶活性,可用于广泛pH条件下纤维多糖的降解。

[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

[0006] 一种β‑葡聚糖酶IDSGH5‑26，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。生物信息学表明，该基因编码的β‑葡聚糖酶属于糖苷水解酶5家族。该原核表达重组酶IDSGH5‑26为嗜中温酶，其最适温度为50℃，在40℃条件下保持良好的稳定性；该酶最适pH为5.0，且具有较强的pH耐受性，在pH4.0‑10.0能保持74％以上的酶活性。

[0007] 一种编码所述β‑葡聚糖酶的β‑葡聚糖酶基因IDSGH5‑26，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。该基因来自于湖羊瘤胃微生物转录组数据。

[0008] 一种包含所述的β‑葡聚糖酶基因IDSGH5‑26的重组载体pET28a/IDSGH5‑26。

[0009] 一种包含所述的β‑葡聚糖酶基因IDSGH5‑26的重组菌BL21/pET28a/IDSGH5‑26。

[0010] 一种制备β‑葡聚糖酶的方法，是发酵培养所述的重组菌，得到β‑葡聚糖酶。

[0011] 扩增所述β‑葡聚糖酶基因IDSGH5‑26采用的特异性引物，所述的特异性引物为：IDSGH5‑26‑F:5’ACAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGTTGAATAAACTTAAAGTTATAAATGG 3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

[0012] IDSGH5‑26‑R:5’CTTGTCGACGGAGCTCGAATTCTTATCTGTCATTCTCCTCATCTG 3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

[0013] 一种所述的β‑葡聚糖酶在广泛pH条件下降解纤维多糖方面的应用。如：酸性环境下的动物饲料生产及碱性环境下的纤维素降解。

[0014] 作为优选，所述的广泛pH条件为4.0‑10.0。

[0015] 一种β‑葡聚糖酶基因IDSGH5‑26的获取方法，该方法包括以下步骤：

[0016] a、β‑葡聚糖酶基因IDSGH5‑26的克隆及重组质粒pET28a/IDSGH5‑26的构建；

[0017] b、重组质粒pET28a/IDSGH5‑26在大肠杆菌BL21中的表达；

[0018] c、重组蛋白的诱导、纯化及酶学特性分析。

[0019] 作为优选，步骤a IDSGH5‑26β‑葡聚糖酶基因的克隆及重组质粒pET28a/IDSGH5‑26的构建过程具体如下：

[0020] ①PCR扩增β‑葡聚糖酶基因IDSGH5‑26并纯化；

[0021] ②同时用BamHI和EcoRI对pET28a载体进行双酶切；

[0022] ③纯化后的IDSGH5‑26与双酶切后的pET28a进行同源重组；

[0023] ④重组质粒pET28a/IDSGH5‑26转化至大肠杆菌BL21感受态细胞。

[0024] 与现有技术相比，本发明的优点在于：

[0025] 1.本发明中所克隆的基因来自湖羊瘤胃微生物转录组数据，保证基因的新颖性；

[0026] 2.本发明中选用原核表达系统，具有遗传背景清晰、能够在较短时间内获得基因表达产物及所需成本较低等优点；

[0027] 3.本发明中PCR扩增目的片段时采取的是自行设计的特异性引物，可以有效保证扩增效率和产物特异性；

[0028] 4、本发明所述的β‑葡聚糖酶IDSGH5‑26最适温度为50℃，在40℃条件下保持良好的稳定性。该酶具有较强的pH耐受性，在pH4.0‑10.0能保持74％以上的活性，催化降解葡聚糖的产物是单糖和聚合度为2～4的低聚纤维寡糖。因此，该重组β‑葡聚糖酶具有良好的工业应用价值。

附图说明

[0029] 图1是克隆IDSGH5‑26 PCR产物；

[0030] 图2是重组蛋白IDSGH5‑26的SDS‑PAGE分析图；

[0031] 图3是温度对重组蛋白IDSGH5‑26酶活性的影响；

[0032] 图4是重组蛋白IDSGH5‑26的热稳定性；

[0033] 图5是pH对重组蛋白IDSGH5‑26酶活性的影响；

[0034] 图6是重组蛋白IDSGH5‑26的pH稳定性；

[0035] 图7是重组蛋白IDSGH5‑26的水解产物分析。

具体实施方式

[0036] 下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

[0037] 在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

[0038] 实施例

[0039] 一、湖羊瘤胃内容物总RNA提取

[0040] (1)将‑80℃冷冻保存的瘤胃内容物样品在液氮中迅速研磨成粉末，每50～100mg样品加1ml的RNApure超纯总RNA快速提取试剂盒(艾德莱生物科技有限公司，北京，中国)中裂解液RL后匀浆。样品容积不能超过RL容积的10％；

[0041] (2)将匀浆样品于旋涡振荡器上剧烈振荡混匀以裂解细胞，在15‑30℃条件下孵育5min以使核蛋白体完全分解；

[0042] (3)4℃，12000rpm条件下离心10min移除不溶物，小心取上清转入一个新的无RNA酶的离心管中；

[0043] (4)每毫升裂解液RL加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，12000rpm，4℃离心10min；

[0044] (5)取上层无色水相转移至新管中，加入水相体积一半的无水乙醇，混匀后加入吸附柱RA中，室温12000rpm离心45s，弃上清；

[0045] (6)加500μl去蛋白液RE，室温12000rpm离心45s，弃上清；

[0046] (7)加500μl漂白液RW，室温12000rpm离心45s，弃上清；

[0047] (8)重复步骤7；

[0048] (9)室温13000rpm离心2min，尽量除去漂白液；

[0049] (10)将吸附柱RA放入无RNA酶的离心管中，在吸附膜中间部位加50‑80μl无RNA酶的灭菌水，室温放置2min,12000rpm离心1min，得到总RNA，‑80℃保存。

[0050] 二、IDSGH5‑26基因的克隆

[0051] 1.cDNA的合成

[0052] 以瘤胃内容物总RNA为模板逆转录合成第一链cDNA。

[0053] (1)在微量离心管中配置下列混合液

[0054] Random Primer(25pmol/μl) 1μl总RNA 1μg以下
加RNase Free Water至 12μl

[0055] 65℃孵育5min使RNA热变性，立即置于冰上。

[0056] (2)配置下列逆转录反应混合液

[0057] 第一步变性后的RNA溶液 12μl5×RT Buffer 4μl
dNTP Mixture(各10mM) 2μl
RNase Inhibitor(10U/μl) 1μl
ReverTra Ace 1μl
总体积 20μl

[0058] (3)陆续将反应液于30℃孵育10min；42℃孵育20min；99℃孵育5min；4℃孵育5min，然后瞬时离心得到cDNA。

[0059] 2.目的基因PCR扩增以合成的cDNA为模板，利用自行设计的特异性引物“IDSGH5‑26‑F和IDSGH5‑26‑R”PCR扩增目的基因，扩增体系如下：

[0060]2×Hide‑Fidelity Master Mix 25μl
IDSGH5‑26‑F 2μl
IDSGH5‑26‑R 2μl
cDNA模板 2μl
加ddH2O至 50μl

[0061] 涡旋振荡混匀，稍离心后放入PCR仪中。目的基因的扩增条件如下：

[0062]循环数 程序
1 98℃预变性2min
35 98℃变性10s，66℃退火15s，72℃延伸30s
1 72℃继续延伸5min
  4℃保存

[0063] PCR扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳，得到大小为915bp的目的条带(图1)，DNA割胶回收试剂盒(Takara，上海，中国)进行纯化回收。

[0064] 三、重组质粒pET28a/IDSGH5‑26的构建

[0065] (1)线性化pET28a载体的制备

[0066] 限制性内切酶切割pET28a载体，制备线性化载体(限制性内切酶试剂均购自takara宝日医生物技术有限公司，北京，中国)。线性化酶切体系如下：

[0067] pET28a 2μgBamHI 2μl
EcoRI 2μl
Buffer 5μl
加ddH2O至 50μl

[0068] 涡旋振荡混匀，稍离心后放入37℃培养箱中2‑3个小时。

[0069] (2)目的基因与pET28a载体连接

[0070] 利用同源重组的原理，通过TreliefTMSoSoo Cloning Kit(擎科生物科技有限公司，北京，中国)同源重组试剂盒将目的基因定向克隆到线性化pET28a载体中。反应体系如下：

[0071] 纯化回收后的PCR产物 3μl线性化pET28a 1μl
2×SoSoo Mix 5μl
灭菌ddH2O 1μl
总计 10μl

[0072] 10μl体系，目的基因与表达载体摩尔比为5:1，50℃反应30min。

[0073] 四、重组菌BL21/pET28a/IDSGH5‑26的构建及蛋白表达

[0074] 1.重组质粒热激转化至大肠杆菌

[0075] (1)取10μl连接产物与大肠杆菌感受态BL21(DE3)小心混匀，冰浴30min；

[0076] (2)将离心管置于42℃水浴热激60s，立即取出冰浴2‑3min，该过程不要摇动离心管；

[0077] (3)向离心管中加入890μl 37℃预热的无菌SOC培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床150rpm恒温培养45min，使质粒上相关的抗性标记基因表达，菌体复苏；

[0078] (4)吸取100μl已转化后的感受态细胞，涂布于含卡那霉素的LB固体培养基中(涂布量可根据具体实际情况调整，如果预计的克隆较少通过4000rpm，2min离心后吸除部分培养液)。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板37℃恒温培养12‑16h；

[0079] (5)挑取菌斑进行PCR鉴定，将筛选出的阳性克隆子送公司测序。通过基因比对检测转录组分析的准确性。

[0080] 2.阳性菌株的诱导表达与纯化

[0081] (1)阳性菌株的诱导表达

[0082] ①挑取阳性重组工程菌BL21/pET28a/IDSGH5‑26单菌落，置于5mL含50μg/mL Kan的LB液体培养基，37℃，200rpm培养12～16h；

[0083] ②以1％接种量转接入500mL含10μg/mL Kan的LB培养基，37℃，200rpm震荡培养至OD600为0.6～1.0；

[0084] ③添加终浓度为1mmol/L IPTG，16℃，100rpm诱导培养16h；

[0085] ④8000rpm，4℃离心10min收集细胞，用100mL 1×PBS缓冲液(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/L KH2PO4，pH7.4)洗涤细胞，8000rpm离心10min。
弃上清，50mL 1×PBS缓冲液重新悬浮菌体；

[0086] ⑤流速6L/h，压力810MPa，6℃，在FB‑2010均质机(上海励途公司)中破碎5min；

[0087] ⑥10000rpm，4℃离心15min，收集上清液即为重组蛋白粗酶液。

[0088] (2)重组蛋白亲和纯化与电泳分析

[0089] ①装柱：2mL Ni‑NTA agarose填料加入DE01层析柱；

[0090] ②平衡：20mmol/L咪唑磷酸盐缓冲液以0.5mL/min的流速进行柱平衡1h；

[0091] ③上样：75mL蛋白上清液以0.5mL/min的流速进行上样；

[0092] ④再平衡：20mmol/L咪唑磷酸盐缓冲液以0.5mL/min的流速进行柱平衡1h；

[0093] ⑤洗脱：20mmol/L(A液)与2mol/L(B液)的混合磷酸盐缓冲液梯度洗脱，设置B液最终比例为13％，收集洗脱液；

[0094] ⑥清洗：20mmol/L咪唑磷酸盐缓冲液以0.5mL/min的流速清洗层析柱1h；

[0095] ⑦将纯化后蛋白用于SDS‑PAGE电泳(4％浓缩胶，15％分离胶)分析，得到预期大小的目标蛋白(图2)。

[0096] 五、酶学特性分析以0.5％葡聚糖为底物，采用3,5二硝基水杨酸(DNS)法测定葡聚糖酶活性，每min释放底物生成1μmol还原糖所需的酶量定义为1个酶活性单位(U)。采用Bradford法测定蛋白浓度。

[0097] (1)最适温度

[0098] 将15μL IDSGH5‑26纯化酶液(约12μg，下同)与60μL 0.5％葡聚糖底物混合，分别置于30～80℃下反应15min。同时设置空白对照组，空白管中加入15μL预先煮沸灭活的酶液，反应10min。在上述试验和对照体系加入75μL DNS试剂，99℃保温5min。待冷却至室温后，使用SpectraMax M3酶标仪(Molecular Devices)于540nm下测定吸光值。以最高活性时的温度为100％，计算各温度条件下相对活性，设置三组重复实验。

[0099] 结果显示(图3)：重组酶IDSGH5‑26的最适温度为50℃。

[0100] (2)热稳定性

[0101] 在pH5.0条件下，将15μL IDSGH5‑26纯化酶液分别在40～70℃保温60min。在0、2、5、10、20、40、60min取样，分别加入60μL 0.5％葡聚糖底物，于最适条件下反应10min，按上述条件测定酶活。以未经热处理的实验组为100％，计算各温度条件下的残余活性，设置三组重复实验。

[0102] 实验结果显示(图4)：重组酶IDSGH5‑26在40℃孵育60min，其残余活性不受影响，50℃孵育5min之后迅速失活。

[0103] (3)最适pH

[0104] 将15μL IDSGH5‑26纯化酶液分别与用pH2.2～10缓冲液(柠檬酸/磷酸缓冲液pH2.2～8.0；甘氨酸/氢氧化钠缓冲液pH9～10)配制的葡聚糖底物在最适温度下反应10min，按上述条件测定酶活。以最高活性时的pH为100％，计算各pH条件下相对活性，设置三组重复。

[0105] 实验结果显示(图5)：重组酶IDSGH5‑26的最适pH为5。

[0106] (4)pH稳定性

[0107] 在最适温度下，将7.5μL IDSGH5‑26纯化酶液分别在7.5μL不同pH缓冲液(pH2.2～10.6)中孵育1h后，加入60μL 0.5％的葡聚糖底物，于最适条件下反应10min，按上述条件测定酶活。以未经缓冲液孵育的实验组为100％，计算各pH条件下的残余活性，设置三组重复实验。

[0108] 实验结果显示(图6)：重组酶IDSGH5‑26在pH4.0～10.0之间较为稳定，处理1h后仍能保持74％以上活性。

[0109] (5)底物水解分析

[0110] 取1mL IDSGH5‑26纯化酶液与4mL 0.5％葡聚糖，在最适反应条件下孵育72h，分别于2h、10h、24h、48h和72h取样。于95℃保温30min，13 000rpm离心15min，取上清，设置三组重复实验。利用Asahipak NH2P‑50 4E色谱柱(Shodex公司)和LC‑1200高效液相色谱仪(Agilent公司)，流动相为乙腈：水＝65：35，柱温35℃，流速0.5mL/min，采用RID‑20A时差折光检测器分析底物水解样品。

[0111] 实验结果显示(图7)：IDSGH5‑26催化降解葡聚糖的产物是单糖和聚合度为2～4的低聚纤维寡糖。经IDSGH5‑26处理48h后，葡聚糖的水解产物单糖、纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖的产量分别为82.25±15.44、829.44±9.87、628.75±26.89和52.86±4.03umol/umol蛋白。

[0112] 结论：根据上述实验结论，证明本发明的内切葡聚糖酶IDSGH5‑26具有较广的pH耐受性，在pH4.0‑10.0范围内，均能保持74％以上酶活性，催化降解葡聚糖的产物是单糖和聚合度为2～4的低聚纤维寡糖，有较大的工业化生产和应用潜力，可应用于酸性条件下啤酒酿造、动物饲料和生物燃料以及强碱性环境下的纤维素降解，如碱性洗涤剂、纺织业等工业生产。

[0113] 以上所述的实施例是本发明挖掘基因和体外制备内切葡聚糖酶方法的较佳方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。