一株红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5及其应用

摘要

本发明属于食用菌技术领域，特别是涉及一株红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5及其应用。本发明提供了一株快速繁殖的红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5，所述红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的保藏编号为CGMCC No.19369。在相同培养条件下，本发明所述红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5具有更强的竞争能力和生长速度，与宿主合成菌根的能力较强，培育的菌根苗质量高，能用于规模化高效培育红汁乳菇菌根苗。

权利要求

1.一株红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5，其特征在于，所述红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的保藏编号为CGMCC No.19369。

2.基于权利要求1所述红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的培养方法，包括以下步骤：

将权利要求1所述红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5在PDA平板培养基中进行固体培养，得到的菌丝块接种于液体培养基中，摇床震荡进行液体培养可得到红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5接种菌剂。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述液体培养基包括以下质量浓度的组分：二水氯化钙0.1g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L、肌醇0.05mg/L、叶酸

0.1mg/L、维生素B10.05 mg/L、寡糖0.05mg/L、三十烷醇0.001mg/L、硫酸锰0.005g/L、七水硫酸锌0.01g/L、六水氯化铁0.01g/L、葡萄糖30g/L、酵母提取物0.2g/L和蛋白胨2g/L。

4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述摇床震荡液体培养的温度为18～

24℃，转速为160～210r/min，时间为18～35天；所述液体培养基的起始pH值为5.0～6.5，装液量为(200～300)mL/500mL。

5.权利要求1所述红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5在培育红汁乳菇菌根苗中的应用。

6.基于权利要求1所述红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5培育红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5菌根苗的方法，包括以下步骤：(1)制备育苗基质；所述育苗基质的组分包括泥炭土、蛭石和黄心土，含水量为60％；所述泥炭土、蛭石和黄心土的体积比为2:1:1；所述育苗基质的组分混合后进行灭菌处理；

(2)对宿主种子进行催芽和播种处理得到松科植物的苗；

(3)制备红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的接种菌剂；

(4)向步骤(2)获得的松科植物的苗接种步骤(3)获得的接种菌剂并进行菌根苗的培养，得到红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5菌根苗；所述接种的方法包括：当松科植物的苗培养至25～40天时，将经过稀释的接种菌剂注入苗的根部，接种结束后培养90～150天，红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5菌株与宿主形成稳定的共生关系，再培养60～90天获得红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5菌根苗；

上述步骤(3)和(1)(2)之间没有时间先后顺序的要求。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述松科植物包括马尾松、国外松、华山松、云南松。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中催芽的方法包括：使用无菌水浸泡宿主种子16～24h，浸泡结束后取出宿主种子置于过氧化氢质量百分含量为30％的过氧化氢水溶液中振荡浸泡10～15min，震荡浸泡结束后使用无菌水冲洗宿主种子4～5次，将经过冲洗的宿主种子置于棉布袋中，于24～26℃的环境内催芽，催芽期间每天用喷撒水；

所述步骤(2)中播种的方法包括：待宿主种子萌发率≥80％时，将萌发的宿主种子点播至灭菌育苗基质中，置于温室中进行育苗。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中接种用菌剂的制备方法包括：将经过液体培养21～28天的红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5培养液打碎获得菌丝球直径小于2mm的菌丝体悬液，即为接种菌剂。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中菌剂的稀释倍数为8～10倍；所述经过稀释的菌剂的接种量为5～10mL/株。

说明书

一株红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于食用菌技术领域，特别是涉及一株红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5及其应用。

背景技术

[0002] 红汁乳菇(Lactarius hatsudakeNobuj.Tanaka)隶属真菌界(Fungi)、担子菌门(Basidiomycota)、伞菌纲(Agaricomycetes)、红菇目(Russulales)、红菇科
(Russulaceae)、乳菇属(Lactarius)，是世界著名的美味食用菌。红汁乳菇的子实体营养丰
富、味道鲜美、食药用价值高，富含蛋白、粗纤维、多种氨基酸、真菌多糖、不饱和脂肪酸、核
酸衍生物，以及维生素B1、B2、维生素C、维生素PP等生物活性成份，具有益肠胃、治疗糖尿病、
提高人体免疫功能、抗癌等药用功效，是理想的多功能森林食品，深受国内外消费者青睐，
可鲜食、速冻或加工成菌油，产业链长、市场容量大，开发前景广。

[0003] 野生红汁乳菇是产地及其周边地区市场最重要最活跃的野生菌，但野生产量低、不可控。而且野生环境频遭破坏，无法满足市场的需求，实现红汁乳菇的可持续利用与人工
栽培成为人们孜孜以求的梦想。

[0004] 近年来，红汁乳菇的栽培已悄然兴起。红汁乳菇是典型的与松、栎类树种共生的菌根性食用菌，离开宿主无法正常完成生活史，目前无法按照腐生性食用菌栽培方式栽培成
功。谭著明等人的研究表明，建立大规模外生担子菌菌根性食用菌‑红汁乳菇种植园是可行
的。红汁乳菇成为我国乃至全世界首个被人工种植成功的担子菌类菌根性食用菌，其栽培
兼具经济和生态效益，深受市场欢迎，是近年来我国东南部地区正在推广的以生态优先为
前提的林下经济模式和特色种植产业。

[0005] 国内外有关红汁乳菇的研究，主要集中在红汁乳菇的子实体的营养成分、保健功能、菌种的分离、发酵培养、菌根合成、室内模拟野外生长环境等方面。如专利号为
ZL20130238366.8(一种制备红汁乳菇菌根的方法)提供了一种制备红汁乳菇菌根的方法，
即采用组织分离法，在无菌条件下取红汁乳菇的菌柄与菌盖之间的组织接种于PDA试管斜
面培养基上，待所述PDA试管斜面培养基组织块儿上长出菌丝后，将其转接到WAY试管斜面
培养基上进行避光培养，并通过培养后得到纯净红汁乳菇菌丝、红汁乳菇液体菌剂与固体
菌剂，将上述纯净红汁乳菇菌丝、红汁乳菇液体菌剂与固体菌剂分别接种到一年苗龄的板
栗无菌苗之根系上培育至少三个月，从板栗无菌苗之根系上得到红汁乳菇菌根。该发明侧
重菌剂的制作。申请号为201710535014.7(一种红汁乳菇完全人工培育种植方法)公开了一
种红汁乳菇母种的制备、原种的制备、生产种的制备及人工栽培的完全人工培育种植方法，
即在含蚁巢的母种培养基上17～19℃、培养270～295小时获得成熟母种，接入以棉籽皮、麸
皮、蚁巢浸出液为主要原料的原种培养基中17～19℃、经30～40天培养获得原种，再次接入
以棉籽皮、麸皮、蔗糖、钻木屑为主要原料的生产种培养基上22～25℃、30～40天即为成熟
的生产种，再将菌丝长满袋的生产种直接埋入智能出菇房培育箱中，控制温度在22～25℃，
湿度85％～95％进行出菇管理。据称，生长周期20天左右就可长出第一批子实体。

[0006] 尽管一些现有技术在红汁乳菇菌根的取得或子实体栽培上宣称有独到之处，但迄今尚无关于红汁乳菇的优良菌株的获取的报道。

发明内容

[0007] 为了解决上述问题，本发明提供了一株红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5及其应用。本发明提供的红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5具有快速繁殖、适应能力强、侵染
宿主能力高的特点，能够有效提高红汁乳菇菌根苗的培育效果。

[0008] 为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

[0009] 本发明提供了了一株红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5，其特征在于，所述红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的保藏编号为CGMCCNo.19369。

[0010] 本发明还提供了一种基于上述红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的培养方法，包括以下步骤：

[0011] 将上述红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5在PDA平板培养基中进行固体培养，得到的菌丝块接种于液体培养基中，摇床震荡进行液体培养可得到红汁乳菇(Lactarius 
hatsudake)JH5接种菌剂。

[0012] 优选的，所述液体培养基包括以下质量浓度的组分：二水氯化钙0.1g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L、肌醇0.05mg/L、叶酸0.1mg/L、维生素B10.05mg/L、寡糖
0.05mg/L、三十烷醇0.001mg/L、硫酸锰0.005g/L、七水硫酸锌0.01g/L、六水氯化铁0.01g/
L、葡萄糖30g/L、酵母提取物0.2g/L和蛋白胨2g/L。

[0013] 优选的，所述摇床震荡液体培养的温度为18～24℃，转速为160～210r/min，时间为18～35天；所述液体培养基的起始pH值为5.0～6.5，装液量为(200～300)mL/500mL。

[0014] 本发明还提供了上述红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5在培育红汁乳菇菌根苗中的应用。

[0015] 本发明提供了一种基于上述红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5培育红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5菌根苗的方法，包括以下步骤：

[0016] (1)制备育苗基质；所述育苗基质的组分包括泥炭土、蛭石和黄心土，含水量为60％；所述泥炭土、蛭石和黄心土的体积比为2:1:1；所述育苗基质的组分混合后进行灭菌
处理；

[0017] (2)对宿主种子进行催芽和播种处理得到松科植物的苗；

[0018] (3)制备红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的接种菌剂；

[0019] (4)向步骤(2)获得的松科植物的苗接种步骤(3)获得的接种菌剂并进行菌根苗的培养，得到红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5菌根苗；所述接种的方法包括：当松科植物
的苗培养至25～40天时，将经过稀释的接种菌剂注入苗的根部，接种结束后培养90～150
天，红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5菌株与宿主形成稳定的共生关系，再培养60～90
天获得红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5菌根苗；

[0020] 上述步骤(3)和(1)(2)之间没有时间先后顺序的要求。

[0021] 优选的，所述松科植物包括马尾松、国外松、华山松、云南松。

[0022] 优选的，所述步骤(2)中催芽的方法包括：使用无菌水浸泡宿主种子16～24h，浸泡结束后取出宿主种子置于过氧化氢质量百分含量为30％的过氧化氢水溶液中振荡浸泡10
～15min，震荡浸泡结束后使用无菌水冲洗宿主种子4～5次，将经过冲洗的宿主种子置于棉
布袋中，于24～26℃的环境内催芽，催芽期间每天用喷撒水；

[0023] 所述步骤(2)中播种的方法包括：待宿主种子萌发率≥80％时，将萌发的宿主种子点播至灭菌育苗基质中，置于温室中进行育苗。

[0024] 优选的，所述步骤(3)中接种用菌剂的制备方法包括：将经过液体培养21～28天的红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5培养液打碎获得菌丝球直径小于2mm的菌丝体悬液，
即为接种菌剂。

[0025] 优选的，所述步骤(4)中菌剂的稀释倍数为8～10倍；所述经过稀释的菌剂的接种量为5～10mL/株。

[0026] 本发明提供了一株快速繁殖的红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5，所述红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的保藏编号为CGMCC No.19369。在相同培养条件下，本发明
所述红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5具有更强的竞争能力和生长速度，与宿主合成菌
根的能力较强，培育的菌根苗质量高，能用于规模化高效培育红汁乳菇菌根苗。由实施例可
知，本发明提供的红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5菌丝生长速度快、茂密、不易老化，
基本上能在28～35天长满整个平皿，且污染率低；在对峙培养中，红汁乳菇(Lactarius 
hatsudake)JH5的菌落均大于其它菌株；红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的单株根系
感染率、菌根化率、菌根侵染率菌根显著高于其它菌株，分别高达60.33％、90.67％、
79.60％，单株菌根数平均高达48.65个，且根系中菌根分布均匀。

附图说明

[0027] 图1为在相同培养条件和时间下红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5菌株与其他红汁乳菇菌株生长对比；其中A为JH5，B为JH1，C为JH4，D为JH8，E为JH10，F为JH11，G为JH12；

[0028] 图2为不同菌株在PDA培养基上的生长曲线；

[0029] 图3为红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5与其他菌株竞争能力的观察图片；其中A为菌株JH5，B为菌株JH1，C为菌株JH4，D为菌株JH8，E为菌株JH10，F为菌株JH11，G为菌株
JH12；

[0030] 图4为体式显微镜下红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的菌根形态；

[0031] 图5为培育的红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5菌根苗；

[0032] 图6为红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5与马尾松形成的菌根；

[0033] 图7为红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5菌根横切面扫描电镜形态；

[0034] 图8为红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5在不同液体菌剂种培养获得的菌丝干重的统计曲线；

[0035] 图9为实施例7中，不同培养条件下红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的生长曲线；

[0036] 图10为红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的进化树；

[0037] 图11为红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5。

具体实施方式

[0038] 本发明提供了一株红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5，所述红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的保藏编号为CGMCCNo.19369；所述红汁乳菇(Lactarius 
hatsudake)JH5的ITS1序列为：

[0039] GAGCCTTCCGTCTCGTGTGTGAGGCGTGTGAGGGCTGTCGCTGACTTTTTGACACAAAAGTCGTGCACGCCGGAGCACGTCCTCTCTCTCACATAAAATCCATCTCACCCTTTTGTGCACCACCGCGCGGGCACCCTTTGGGAT
GCTTGCGTTTTCACACAAACCCCTTTTAAAAAAGTGTAGAATGACCCCACTTTGCGATGACACGCAATCAATACAA
CTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGA
ATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCACACCCGTTTGAGTGTCG
TGAAAATCTCAACCTTCTCGGTTTTCTTCTGGACACCGAAGGAGGCTTGGACTTTGGAGGCCTTTGCTGGCGTCTC
TCTAGAGCCAGCTCCTCTTAAATGAATTAGCGGGGTCCTCTTTGCCGATCCTTGACATGTGATAAGATGTTTCCAT
GACTCGGTTTCTGGCTCTGTTGCATTTGGGACCTGCTTCTAACCGTCTCGACGAGACGATGTTTGGGAGTGTCTCC
CTTCTCGGGAGACTCTCTCGACCCCACGAACCCTTGACCTCAAATCGGGTGAGACTACCCGCTGAACTTAAGCATA
TCAATAAGCCGGAGGAA，SEQ ID NO:1；所述红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的进化树如
图10所示。

[0040] 本发明提供的红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5具有长势优秀，竞争能力强，极强的侵染宿主能力，菌根合成能力等方面显著优于其它菌株，在真菌通用PDA培养基上菌
落边缘整齐，圆形，菌丝浓密洁白，散发蘑菇清香，生长速度快于其他菌株，竞争优势高于其
他菌种，具有很大的应用价值。红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的生长示意图如图11
所示。

[0041] 本发明还提供了一种基于上述红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的培养方法，包括以下步骤：

[0042] 将上所述红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5在PDA平板培养基中进行固体培养，得到的菌丝块接种于液体培养基中，摇床震荡液体培养，可得到红汁乳菇(Lactarius 
hatsudake)JH5液体菌剂。本发明提供的红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的培养方法
能够高效地培育红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5。

[0043] 在本发明中，所述液体培养基优选包括以下质量浓度的组分：二水氯化钙0.1g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L、肌醇0.05mg/L、叶酸0.1mg/L、维生素B10.05mg/L、
寡糖0.05mg/L、三十烷醇0.001mg/L、硫酸锰0.005g/L、七水硫酸锌0.01g/L、六水氯化铁
0.01g/L、葡萄糖30g/L、酵母提取物0.2g/L和蛋白胨2g/L。在本发明中，红汁乳菇
(Lactarius hatsudake)JH5在液体培养基中生长速度快，获得的干菌丝量多，而且污染率
低。

[0044] 在本发明中，所述摇床震荡液体培养条件优选为：培养的温度18～24℃，转速为160～210r/min，起始pH值为5.0～6.5，装液量优选为(200～300)mL/500mL。

[0045] 本发明提供的培养方法能够有效提高培养获得的红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的菌丝干重，缩短红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的培养周期。

[0046] 本发明还提供了上述红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5在培育红汁乳菇菌根苗中的应用。本发明提供的红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5在培育红汁乳菇菌根苗中
与宿主合成菌根的能力强。

[0047] 本发明提供了上述红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5培育红汁乳菇菌根苗的方法，包括以下步骤：

[0048] (1)制备育苗基质；所述育苗基质的组分包括泥炭土、蛭石和黄心土，含水量为60％；所述泥炭土、蛭石和黄心土的体积比为2:1:1；所述育苗基质的组分混合后进行灭菌
处理；

[0049] (2)对宿主种子进行催芽和播种处理得到松科植物的苗；

[0050] (3)制备红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的接种菌剂；

[0051] (4)向步骤(2)获得的松科植物的苗接种步骤(3)获得的接种菌剂并进行菌根苗的培养，得到红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5菌根苗；所述接种的方法包括：当松科植物
的苗培养至25～40天时，将经过稀释的接种菌剂注入苗的根部，接种结束后培养90～150
天，红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5菌株与宿主形成稳定的共生关系，再培养60～90
天获得红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5菌根苗；

[0052] 上述步骤(3)和(1)(2)之间没有时间先后顺序的要求。

[0053] 本发明提供的方法培育获得的菌根苗质量高于其它菌株，适用于规模化高效培育红汁乳菇菌根苗。

[0054] 在本发明中，所述松科植物优选包括马尾松、国外松、华山松、云南松。

[0055] 在本发明中，所述步骤(2)中催芽的方法优选包括：使用无菌水浸泡宿主种子16～24h，浸泡结束后取出宿主种子置于过氧化氢质量百分含量优选为30％的过氧化氢水溶液
中振荡浸泡10～15min，震荡浸泡结束后使用无菌水冲洗宿主种子4～5次，将经过冲洗的宿
主种子置于棉布袋中，于24～26℃的环境内催芽，催芽期间每天用喷撒水；

[0056] 所述步骤(2)中播种的方法优选包括：待宿主种子萌发率≥80％时，将萌发的宿主种子点播至灭菌育苗基质中，置于温室中进行育苗。本发明在步骤(2)中所有操作均处于无
菌条件下；所述无菌条件的灭菌处理方法优选包括高温、厌氧、臭氧、紫外线；所述洁净的环
境，指没有红汁乳菇之外的菌根性杂菌污染的环境，包括用于培养菌根苗的空气、水、基质、
容器等均不得沾染菌根性杂菌。

[0057] 在本发明中，所述步骤(3)中接种用菌剂的制备方法优选包括：将经过液体培养21～28天的红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5培养液打碎获得菌丝球直径小于2mm的菌丝
体悬液，即为接种菌剂。

[0058] 在本发明中，所述步骤(4)中菌剂的稀释倍数优选为8～10倍；所述经过稀释的菌剂的接种量优选为5～10mL/株。

[0059] 为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一株红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护
范围的限定。

[0060] 实施例1

[0061] 红汁乳菇菌株的分离

[0062] 2016年～2017年11月，申请人在湖南郴州嘉禾县普满乡大量发生红汁乳菇的马尾松林中，于单次产红汁乳菇数量多、产菇密集的宿主林冠下，挑选无病虫害、健壮、菌盖直径
为3～5cm、未开伞的新鲜红汁乳菇子实体，每棵宿主只挑选3～4朵符合要求的红汁乳菇子
实体，低温下带回实验室采用组织分离法分离菌株。具体步骤为：在超净台上，用棉签或脱
脂棉花沾75％的酒精轻轻擦拭子实体表面，再用无菌滤纸吸干子实体表面水分，切取菌盖、
菌柄以及菌盖和菌柄交界处的内层组织，置于PDA平板上，待长出菌落后，剔除有污染的菌
落，挑选无污染的菌落边缘的菌丝至新鲜的PDA平板中培养，每棵树的每个子实体所得的分
离物编为同一号，一个子实体为一个号，如JH1‑1、JH1‑2、JH1‑3、JH1‑4；JH2‑1、JH2‑2、JH2‑
3、JH2‑4；JH3‑1、JH3‑2、JH3‑3、JH3‑4；JH4‑1……；每棵树分离成功及生长最旺盛的菌株保
留下来，保留树的编号为JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6……。

[0063] 实施例2

[0064] 取实施例1提供的菌株。采用9厘米的玻璃培养皿，每个培养皿中倒入经过灭菌处理的PDA培养基10毫升，备用。将各个菌株同批次活化培养相同的时间后，用直径为0.5cm的
打孔器在平板上取下相同大小的组织块分别接种于备用的平板上，每个菌株培养3皿，重复
三次，接种后在21～24℃的环境下进行培养，每7天用十字交叉法调查菌落直径大小，绘制
红汁乳菇的生长曲线。图1不同菌株在PDA培养基上培养35天的生长情况，图2为不同菌株在
PDA培养基上的生长曲线。

[0065] 表1 JH5与其他菌株在PDA培养基上的生长情况比较

[0066]

[0067] 由图1、图2和表1可知，在与其它菌株相比，在相同的培养时间内红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的菌丝洁白茂盛，基外菌丝生长较快，茂密，不易老化，能在28
～35天长满整个平皿，且污染率低。

[0068] 实施例3

[0069] 取实施例1提供的菌株。使用不同的培养基对JH5和其他菌株进行培养，考察JH5和其他菌株的营养适应能力,不同培养基的配方如表2所示，培养结果如表3、表4所示。

[0070] 表2不同培养基的编号及其对应的配方

[0071]

[0072]

[0073] 表3 JH5和其他菌株在不同营养条件下的生长速度

[0074]

[0075]

[0076] 表4 JH5和其他菌株在不同营养条件下的菌落形态

[0077]

[0078]

[0079] 由表3和表4可知，与其他菌株相比，红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5能适应不同营养条件，而且在每种营养条件下红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的基外菌丝比
较茂盛、洁白致密，明显优于其它菌株。

[0080] 实施例4

[0081] 采用平皿对峙法检测红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的竞争能力。在直径9cm的PDA平板培养基上，相距3cm分别接入直径0.5cm的JH5和另一菌株菌片，对照未接入统
一菌株的菌丝片，置于24℃恒温培养箱内培养，至两个菌落相交后，再培养6天，观察两个菌
落之间是否相融合或有一条明显拮抗带来判断拮抗作用的有无及竞争能力的大小。试验结
果见图3和表5。

[0082] 表5红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5与其它菌株竞争能力的检测

[0083]

[0084] 由图3和表5可知，红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5与其它菌株均有拮抗带，在对峙培养中，红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的菌落均大于其它菌株。

[0085] 实施例5

[0086] 以马尾松为宿主，检测红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的菌根形成能力。基质配方及灭菌基质的制备：泥炭土：蛭石：黄心土＝2:1:1(体积比)，含水量为60％，拌匀后
‑2
高温高压(121℃，1.5kg·cm )灭菌2小时，冷却后备用。

[0087] 宿主马尾松种子催芽与播种：选取饱满、无虫害的马尾松种子。在室内，首先用无菌水浸泡16～24h，然后在30％过氧化氢中振荡浸泡15min，再用无菌水冲洗4～5次，放置到
垫有灭过菌的湿润纱布的培养皿或透明塑料盒中，24～26℃的培养箱内催芽。每天用喷壶
喷适量无菌水，保存纱布湿润，待种子萌发率达80％以上时，将萌发的种子点播至装有灭菌
基质的32格育苗容器盘中，置于大棚温室中进行育苗管理。

[0088] 接种菌剂的制备：在无菌操作台上将液体培养21～28d的各红汁乳菇菌株菌丝体用灭菌纱布过滤，并用滤液冲洗干净，放入无菌烧杯中，加入适量滤液，用组织搅拌机将菌
丝体打碎1min左右，将菌丝体悬液与过滤液混合得到菌剂，放入4℃冰箱保存。

[0089] 红汁乳菇‑马尾松菌根合成：马尾松苗在无菌基质中培养25～40d时，用无菌医用注射器将稀释10倍的菌剂注入苗的根部，接种量为5毫升/株。培养期间用无菌水浇水，保持
基质湿润度维持在田间容水量，每个菌株各接种160株，重复三次；对照(CK)组除了不接种
菌株，其它条件保持一致。接种7个月后，每个处理随机抽取30株苗子，调查苗高、主根长、地
径、一级侧根数、二级侧根数(2cm以上)、单位厘米的菌根数量、地上干重、地下干重、每株苗
菌根(二叉分支状)数量、菌根化率、单株根系菌根化率、菌根侵染率。

[0090] 计算菌根化率＝(形成菌根株数/接种株数)×100％；

[0091] 单株根系菌根化率＝(单株有菌根的根系数/单株一级二级侧根总数)×100％；

[0092] 菌根侵染率＝有菌根的根段数/总根段数×100％；

[0093] 每厘米菌根数＝单条根上菌根数/根长。

[0094] 试验结果见图4～图7，表6、7，其中图4为体式显微镜下红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的菌根形态；图5为培育的红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5菌根苗；图6
为红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5与马尾松形成的菌根；图7为红汁乳菇(Lactarius 
hatsudake)JH5菌根横切面扫描电镜形态。

[0095] 表6 JH5与其它菌株形成菌根的能力比较

[0096]

[0097] 表7接种不同菌株对宿主马尾松幼苗生长的影响

[0098]

[0099]

[0100] 由表6、7可知，与其它菌株相比，JH5的单株根系感染率、菌根化率、菌根侵染率菌根显著高于其它菌株，分别达60.33％、90.67％、79.60％；单株菌根数也是最高的，平均为
48.65个，且根系中菌根分布均匀。没有接菌的CK组则没有任何菌根形成。接种红汁乳菇
(Lactarius hatsudake)JH5菌株的马尾松幼苗的苗高、主根长、地径、总生物量、根冠比均
高于不接菌的对照。红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5菌株可用于培育适用于野外栽植
的菌根苗。

[0101] 实施例6

[0102] 分别在相同条件下(每瓶装液量为250mL/500mL，24℃，180转，pH值为5.5)培养JH5菌株，筛选JH5最适液体培养配方。方法为：使用灭过菌的打孔器在装有PDA培养基的培养皿
上扩大培养18～21d的红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的菌株平板上打孔，用接种钩
连同培养基一起挑取两块菌丝块放入不同培养基的各培养瓶中，每5天测量一次菌丝干重，
三次重复，根据结果绘制生长曲线。菌丝干重测定方法为：将培养液用5层纱布过滤，蒸馏水
充分冲洗至不黏糊，在60℃下烘干至恒重，用电子天平进行称重。

[0103] 统计结果见图8，由图8可知，红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5在BAF、PDA、WPM、BAF‑1四种液体培养基中生长比较快，干菌丝量较多，但在BAF‑1的营养条件下，生长速
度最快，培养20～25天时，菌丝干重可达0.49～0.55g/L，且在实验过程中观察到污染率最
低。BAF‑1为JH5液体菌剂生产用最佳培养基。

[0104] 实施例7

[0105] 以BAF‑1为培养基，采用单因素方法，摇床培养，依次对红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5的各项培养条件进行优化，即分别对培养基初始pH值(4、4.5、5.0、5.5、6、
6.5、7、7.5、8、8.5、9)、摇瓶装液量(50mL、100mL、150mL、200mL、250mL、300mL、350mL、
400mL)、培养温度(15℃、18℃、21℃、24℃、27℃、30℃、33℃、36℃)、摇床转速(100r/min、
120r/min、140r/min、160r/min、180r/min、200r/min、220r/min)筛选出各个因素在发酵过
程中的最适区间。结果图9表明，红汁乳菇(Lactarius hatsudake)JH5比较好的培养条件
为：培养的温度18～24℃，转速为160～210r/min，起始pH值为5.0～6.5，装液量为(200～
300)mL/500mL，在此条件下培养20～25天，菌丝干重可达0.62～0.84g/L。

[0106] 虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护
范围应该以权利要求书所界定的为准。