一种平菇多糖硒苷-Ⅲ在制备治疗卵巢癌的药物中的应用

摘要

本发明属于药物开发技术领域，具体公开了一种平菇多糖硒苷‑Ⅲ在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。本发明研究发现，所述的平菇多糖硒苷‑Ⅲ具有灵敏的抗卵巢癌活性，不仅如此，还不损伤正常细胞甚至可以促进正常细胞的生长增殖，比已有含硒多糖有更高的灵敏度、更高效的抗卵巢癌肿瘤效果。因而所述的平菇多糖硒苷‑Ⅲ可作为一种卵巢癌治疗或辅助治疗的药物或辅助药物。

权利要求

1.一种平菇多糖硒苷‑Ⅲ在制备治疗卵巢癌的药物中的应用，其特征在于，平菇多糖硒苷‑Ⅲ为修饰有有机硒的杂多糖化合物；该杂多糖化合物为葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、木糖、氨基葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、核糖和鼠李糖中的糖单元通过糖苷键连接得到；

水解后的杂多糖化合物中，葡萄糖含量为82 84%，半乳糖含量为3 5%、甘露糖含量为~ ~

2.5 3.5%、葡萄糖醛酸含量为1 2%；半乳糖醛酸、木糖、氨基葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、核糖~ ~和鼠李糖各自含量不高于1%；

所述的平菇多糖硒苷‑Ⅲ的重均分子量为15306；

所述的有机硒通过Se=O和Se‑C‑O修饰在所述的多糖化合物中；

硒含量在28.38 μg/g；

所述的平菇多糖硒苷‑Ⅲ获得步骤为：富硒平菇粉经醇水溶液脱脂、水提、醇沉、脱蛋白得到粗多糖，将粗多糖经纤维素交换柱进行分离处理，分离过程包括依次进行的蒸馏水洗脱、0.05 0.15 mol/L的氯化钠溶液洗脱、0.25 0.35 mol/L的氯化钠溶液洗脱和0.45 0.55 ~ ~ ~mol/L的氯化钠溶液洗脱过程；

收集0.25 0.35 mol/L的氯化钠溶液的洗脱液为目标洗脱液，并进行脱盐、浓缩处理，~葡聚糖凝胶柱分离，即得；

富硒平菇粉为在包含亚硒酸钠基料中种植得到的平菇的干燥粉料。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的纤维素交换柱为DEAE‑52纤维素离子交换柱。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将其用于制备特异性使卵巢癌SKOV3细胞凋亡的治疗卵巢癌的药物。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，将其用于制备不影响或者利于正常卵巢细胞增殖的治疗卵巢癌的药物。

5.如权利要求1 4任一项所述的应用，其特征在于，将所述的平菇多糖硒苷‑Ⅲ与药学~上可接受的辅料联合，制得所述的治疗卵巢癌的药物。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，将所述的平菇多糖硒苷‑Ⅲ用于制备药学上可接受的任意治疗卵巢癌的药物剂型。

说明书

一种平菇多糖硒苷‑Ⅲ在制备治疗卵巢癌的药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种治疗卵巢癌的潜在药物，尤其涉及一种高硒含量的多糖硒苷‑Ⅲ。技术背景

[0002] 卵巢癌是一种女性常见的恶性肿瘤，在妇科恶性肿瘤发病率中，卵巢癌排名第三，仅次于宫颈癌和子宫内膜癌。已成为女性恶性肿瘤中发病率第二高的恶性肿瘤。每年有近二十五万新增卵巢癌患者，超过十五万人死于卵巢癌。同时卵巢癌是妇科恶性肿瘤中死亡率最高的肿瘤，五年生存率仅有45％，严重危害着女性的健康和影响着女性的生活质量。

[0003] 目前已有制备多种来源的硒多糖，如专利《一种香菇硒多糖的制备方法》(申请号：CN109554416A)等，它们大多应用于清除机体自由基和抗氧化等领域，在近期的报道中，硒多糖对卵巢癌细胞具有一定的抑制作用，如Sun等报道的《Selenium‑enriched polysaccharides from Pyracantha fortuneana(Se‑PFPs)inhibit the growth and invasive potential ofovarian cancer cells through inhibitingβ‑catenin signaling》(文献DOI号：10.18632/oncotarget.8619)，尽管所述的硒多糖对卵巢细胞具有一定的抑制效果，但抑制效果较低且不灵敏，在加入硒多糖孵育24h后，50μg/mL硒多糖对卵巢癌SKOV3细胞抑制率不足10％，加大剂量至800μg/mL才达到40％(文中Figure 1B)。由于目前所报道的含硒多糖对卵巢癌细胞的敏感性低，必将通过增加用药剂量或是采用多药联用的模式才能达到设想的治疗效果，这将带来给药途径、用药成本、多种副作用等多方面的潜在困难与风险。

[0004] 综上，目前仍没有一种含硒的多糖衍生物能在低浓度能实现对卵巢癌的高效抑制作用，出于市场和社会效益考虑，对卵巢癌细胞高灵敏性抑制的含硒多糖衍生物作为卵巢癌治疗药物仍亟待开发。

发明内容

[0005] 为实现治疗或辅助治疗卵巢癌，本发明的第一目的在于提供一种在较低浓度下能有效抑制卵巢癌细胞生长、对正常细胞无损伤作用的平菇多糖硒苷‑Ⅲ。

[0006] 本发明第二目的在于，提供了一种包含所述的平菇多糖硒苷‑Ⅲ的治疗卵巢癌的药物。

[0007] 现有技术披露了一些平菇多糖硒苷的提取方式以及在抗氧化方面的作用，但现有技术中很少涉及平菇多糖硒苷在抗肿瘤方面的作用。事实上，本发明研究发现，从平菇中提取的平菇粗多糖(多种活性成分的混合物)基本不具备抗癌活性。然而，在获知平菇粗多糖不具备抗癌活性的研究背景下，行业内没有动机从其中筛查出抗癌成分，然而，本发明人仍通过深入研究，意外地发现，从所述的平菇粗多糖分离得到的平菇多糖硒苷‑Ⅲ出人意料地具有良好的抗癌活性，甚至还对正常细胞具有良好的促代谢，促修复增值功效，故提供以下技术方案：

[0008] 一种平菇多糖硒苷‑Ⅲ在制备治疗卵巢癌的药物中的应用，所述的平菇多糖硒苷‑Ⅲ为修饰有有机硒的杂多糖化合物(多糖化合物)；该杂多糖化合物为包含葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、木糖、氨基葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、核糖和鼠李糖中的单糖单元通过糖苷键连接得到；

[0009] 水解后的杂多糖化合物中，葡萄糖含量大于80％，半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸含量大于1％；半乳糖醛酸、木糖、氨基葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、核糖和鼠李糖各自含量低于1％；优选地，水解后的杂多糖化合物中，葡萄糖含量为82～84％，半乳糖含量为3～5％、甘露糖含量为2.5～3.5％、葡萄糖醛酸含量为1～2％；半乳糖醛酸、木糖、氨基葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、核糖和鼠李糖各自含量不高于1％。

[0010] 本发明所述的平菇多糖硒苷‑Ⅲ是从平菇粗多糖(各成分的混合物)中分离得到的成分，其水解后的单糖包含葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、木糖、氨基葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、核糖和鼠李糖。本发明研究发现，所述的平菇多糖硒苷‑Ⅲ具有优异的抗癌活性，不仅如此，不但不会损伤正常细胞，还能够促进正常细胞的新陈代谢，改善正常细胞的修复和增殖。

[0011] 对于大部分已上市的抗癌药物而言，在治疗的过程中其在抑杀癌细胞的同时，对正常细胞也会造成一定的伤害。然而，本发明人通过对平菇多糖硒苷‑Ⅲ的深入研究，发现平菇多糖硒苷‑Ⅲ对卵巢癌细胞具有较强的抑杀效果，对正常细胞却没有明显损伤，反而促进正常细胞的新陈代谢，有利于正常细胞的修复和增殖生长，避免在治疗过程中带来的毒副作用。

[0012] 经过单糖组分分析显示，所述的平菇多糖硒苷‑Ⅲ水解后的葡萄糖含量超过80％，半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸含量超过1％，而该单糖组成与现有的平菇来源的多糖或多糖衍生物均有明显差别，表明所述的平菇多糖硒苷‑Ⅲ是新获取的物质。

[0013] 作为优选，所述的平菇多糖硒苷‑Ⅲ抗癌活性成分，分子量为13000～18000。本发明所述的平菇多糖硒苷‑Ⅲ分子量经过GPC测量，其具有较窄的分布宽度，表明提取的平菇多糖硒苷纯度高、质量均一可控(如图2所示)，这为平菇多糖硒苷‑Ⅲ在卵巢癌治疗或辅助治疗的临床前研究及临床应用提供更为有利的条件。

[0014] 优选地，所述的有机硒通过Se＝O和Se‑C‑O修饰在所述的多糖化合物中。

[0015] 优选地，所述的其含硒量为硒含量25μg/g以上(每克平菇多糖硒苷‑Ⅲ的硒含量大于25μg/g)；所述的硒以Se＝O和Se‑C‑O的形式与多糖结合。所述的平菇多糖硒苷‑Ⅲ有很高的硒含量，经测定达到25μg/g以上(通过荧光光度计测定，如图5所示)，保证了平菇多糖硒苷的补硒和保健功能，同时平菇多糖硒苷‑Ⅲ更能结合硒元素的优势以用于卵巢癌的治疗或辅助治疗。

[0016] 本发明还提供了所述的平菇多糖硒苷‑Ⅲ获得步骤，为将粗多糖经纤维素交换柱进行分离处理，分离过程包括依次进行的蒸馏水洗脱、0.05～0.15mol/L的氯化钠溶液洗脱、0.25～0.35mol/L的氯化钠溶液洗脱和0.45～0.55mol/L的氯化钠溶液洗脱过程；

[0017] 收集0.25～0.35mol/L的氯化钠溶液的洗脱液为目标洗脱液，并进行脱盐、浓缩处理，葡聚糖凝胶色谱柱纯化，即得。

[0018] 本发明所述的制备方法，通过所述的特殊的洗脱机制，可以出人意料地获得纯的平菇多糖硒苷‑Ⅲ。进一步实验证明，平菇多糖硒苷‑Ⅲ是一种具有优异抗癌活性，且利于正常细胞新陈代谢增殖的抗癌活性成分。

[0019] 作为优选，所述的粗多糖由富硒平菇粉经醇水溶液脱脂、水提、醇沉、脱蛋白得到。

[0020] 作为优选，富硒平菇粉为在包含亚硒酸钠基料中种植得到的平菇的干燥粉料。其可采用现有方法获得，例如，采用在现有平菇粉培育的基质中添加亚硒酸钠基料，从而获得富硒平菇。

[0021] 所述的醇水溶液脱脂过程的条件为：醇‑水溶液为乙醇水溶液，且乙醇的体积含量为75～85％；回流脱脂；

[0022] 醇水溶液脱脂后进行固液分离，将沉淀在水中分散提取；所述的水提的温度为80～90℃；

[0023] 水提获得提取液，经浓缩后再加入乙醇中，进行醇沉，固液分离得到醇沉物；

[0024] 将醇沉物进行脱蛋白处理，即得粗多糖。

[0025] 所述的纤维素交换柱为DEAE‑52纤维素离子交换柱。

[0026] 优选地，采用透析手段对目标洗脱液进行脱盐处理。

[0027] 作为优选，目标洗脱液脱盐后，再选用G‑100葡聚糖进一步纯化。

[0028] 本发明所述的应用，将其用于制备特异性使卵巢癌SKOV3细胞凋亡的治疗卵巢癌的药物。

[0029] 所述的应用，将其用于制备不损伤甚至利于正常卵巢增殖的治疗卵巢癌的药物。

[0030] 本发明所述的平菇多糖硒苷‑Ⅲ对卵巢癌细胞(SKOV3细胞系)表现出高灵敏度的抑制作用，在50μg/mL剂量下即可达到40％的抑制率，进一步提高浓度，还能够进一步提升抑制效果，且对正常细胞(IOSE细胞系)无抑制作用，更是直接表明其在卵巢癌治疗中具有巨大的应用潜能。

[0031] 本发明所述的应用，低浓度指平菇多糖硒苷‑Ⅲ在细胞培养液终浓度为50μg/mL；高浓度指平菇多糖硒苷‑Ⅲ在细胞培养液终浓度为600μg/mL；

[0032] 本发明所用的是典型卵巢癌细胞SKOV3细胞系作为模型研究，在施用了本发明所述的平菇多糖硒苷后，在低浓度(50μg/mL)下即表现出强烈的抑制肿瘤细胞生长的效果，表明所述平菇多糖硒苷比已报道的含硒多糖衍生物对卵巢癌细胞都要灵敏。而施用600μg/mL所述平菇多糖硒苷对卵巢癌细胞抑制率达到60％，表明其卓越的抑制效果(如图6所示)。此外，以IOSE正常细胞为模型，则发现即便施用高浓度本发明所述的平菇多糖硒苷‑Ⅲ后IOSE正常细胞的生长并未受到抑制(如图9所示)，表明所述的平菇多糖硒苷‑Ⅲ能高效抗卵巢癌细胞且对正常细胞无毒副作用甚至促进正常细胞增殖，具有良好的应用前景。

[0033] 本发明所述的应用，将所述的平菇多糖硒苷‑Ⅲ与药学上可接受的辅料联合，制得所述的治疗卵巢癌的药物。

[0034] 进一步优选，将所述的平菇多糖硒苷‑Ⅲ用于制备药学上可接受的任意治疗卵巢癌的药物剂型；平菇多糖硒苷‑Ⅲ可制成口服制剂或注射制剂。

[0035] 口服制剂或外用制剂常用的赋形剂或辅料包括但不仅限于填充剂、稀释剂、润滑剂、分散剂、湿润剂、粘合剂、调节剂、增溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、崩解剂等，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、乳糖、糖粉、糊精、微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石粉、氢氧化铝、淀粉及其衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、十二烷基硫酸钠、水或醇等。注射制剂常用的赋形剂或辅料包括但不仅限于：抗氧剂、抑菌剂、调节剂、乳化剂、增溶剂等，例如亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、苯酚、甲酚、盐酸、枸橼酸、聚山梨酯‑80、卵磷酯、豆磷脂、吐温‑80、胆汁、甘油等。

[0036] 本发明还提供了一种所述的治疗卵巢癌的药物，其包含所述的平菇多糖硒苷‑Ⅲ。所述的药物还允许含有药学上可接受的辅料，可以为药学上可接受的任意剂型。所述的治疗卵巢癌的药物对卵巢癌细胞的生长表现出高灵敏度的抑制作用，且对正常细胞无明显抑制作用，表明其对肿瘤有特异性的、高效率的抑制作用，能用于制备预防或治疗卵巢癌的药物或辅助药物。

[0037] 有益效果

[0038] 1、本发明意外地发现，平菇多糖硒苷‑Ⅲ不仅具有良好的抗癌活性，还能够解决现有抗癌活性成分对正常细胞的损伤现象，不仅不会对正常细胞带来伤害，相反，还能够出人意料地有助于促进正常细胞的新陈代谢，有助于促进正常细胞的修复和增殖生长。

[0039] 2、本发明通过所述的制备方法，可以获得具有良好抗癌活性，且能够出人意料地有助于促进正常细胞的新陈代谢，有助于促进正常细胞的修复和增殖生长的平菇多糖硒苷‑Ⅲ。

[0040] 3、本发明制备了一种由种植的含硒平菇粉中提取、具有高硒含量、且对卵巢癌细胞有高灵敏抑制作用的平菇多糖硒苷‑Ⅲ，并为治疗卵巢癌提供了一种新的可能方案——通过平菇多糖硒苷发挥自身机体调节保健功能，且能在低剂量情况下即对卵巢癌细胞进行有效抑制，对正常细胞无毒副作用，从而有望实现卵巢癌高效低毒地治疗或辅助治疗。

附图说明

[0041] 图1为平菇多糖硒苷‑Ⅲ的红外光谱图(758cm‑1处的峰为Se＝O特征峰,660cm‑1的峰为Se‑C‑O键)

[0042] 图2为平菇多糖硒苷‑Ⅲ的GPC图

[0043] 图3为平菇粗多糖的纤维柱洗脱曲线(三个组分分别由浓度为0，0.1，0.3mol/L的氯化钠水溶液洗脱下来，分别命名为糖硒苷Ⅰ，组分Ⅱ，组分Ⅲ)

[0044] 图4为平菇多糖硒苷‑Ⅲ的水解物及参照单糖的洗脱曲线(HPLC)

[0045] 图5为平菇多糖硒苷‑Ⅲ的硒含量测定工作曲线

[0046] 图6多糖硒苷‑Ⅲ的透射电镜图(TEM)

[0047] 图7为平菇多糖硒苷‑Ⅲ对SKOV3细胞的抑制效果图

[0048] 图8为平菇多糖硒苷‑Ⅲ对SKOV3细胞的AO/EB共染色图像

[0049] 图9为平菇多糖硒苷‑Ⅲ对SKOV3细胞流式图(膜联蛋白V‑FITC/PI凋亡检测试剂盒染色)

[0050] 图10为多糖硒苷‑Ⅱ孵育后，SKOV3细胞的划痕实验

[0051] 图11为平菇粗多糖孵育后SKOV3细胞的抑制效果图

[0052] 图12为平菇多糖硒苷‑Ⅲ对IOSE细胞的抑制效果图

[0053] 图13为平菇多糖硒苷‑Ⅲ对IOSE细胞的AO/EB共染色图像

[0054] 图14为平菇多糖硒苷‑Ⅲ对IOSE细胞流式图(膜联蛋白V‑FITC/PI凋亡检测试剂盒染色)

[0055] 图15为平菇粗多糖孵育后IOSE细胞的抑制效果图

具体实施方式

[0056] 下面对本发明通过优选的具体实施方例进行详细说明。

[0057] 含硒平菇粉为筛选得的平菇品种经含亚硒酸钠基料培育、采集、干燥、粉碎得到。

[0058] DEAE纤维素固定相经传统的常规碱酸预处理，并装在色谱柱内，避免气泡。

[0059] G系列葡聚糖按传统的常规方法室温溶胀，并装在色谱柱内，避免气泡。

[0060] 通过硫酸‑苯酚法(依照NY/T 1676‑2008)监测柱色谱过程中是否有平菇多糖衍生物洗出。

[0061] 含硒量测试：依照GB 5009.93‑2017方法制作硒工作曲线，后测试样品中的硒含量。

[0062] AO/EB共染色：以5000cells/well的密度将细胞种在96孔板并再细胞培养箱(37℃、5％CO2浓度)中培养24h，后换无血清培基再培养24h。接着换一次无血清培基并加入不同浓度的平菇多糖硒苷使平菇多糖硒苷终浓度为0、300、600μg/mL，孵育24h。最后先用PBS(1×，pH＝7.4)洗两遍，加入AO、EB染色剂，5min后再用PBS(1×，pH＝7.4)洗两遍，使用高内涵成像仪成像(AO激发488nm，发射515nm，EB激发518nm,发射605nm)。

[0063] 实施例1

[0064] (一)粗硒多糖的制备

[0065] 取富硒平菇粉(湖南万臻生物科技有限公司提供)15g于圆底烧瓶中，加入80％的乙醇‑水溶液120mL，65℃下搅拌回流3h，抽滤，得滤饼，干燥。

[0066] 水提：取滤饼10g于烧瓶中，添加300mL超纯水，85℃下搅拌3h，离心，取上清液浓缩，得到粘稠液体。

[0067] 醇沉：将粘稠液体中滴入4倍量无水乙醇，置于4℃下24h，离心，得沉淀物。

[0068] 脱蛋白：将沉淀物溶于100mL的水中，加入四分之一体积的sevage试剂，离心取上清液，重复6次后用透析袋透析，冻干得到粗多糖。

[0069] (二)精制硒多糖

[0070] (2.1)离子交换柱纯化过程：选用DEAE‑52纤维素离子交换柱纯化多糖，将300mg的样品溶于10mL水中，湿法上样。之后依次用蒸馏水、0.1、0.3、0.5mol/L的氯化钠溶液梯度洗脱。用苯酚‑硫酸法，在490nm下隔管检测多糖含量，绘制洗脱曲线图，收集主要组分。共分离出三个组分，本发明取自0.3mol/L的氯化钠水溶液洗脱下来的组分，即组分3。

[0071] (2.2)透析：将样品‑水溶液用旋转蒸发仪浓缩至10‑15mL，之后用盐酸溶液调节pH至7，用去离子水透析36h，之后浓缩至5mL。

[0072] (2.3)葡聚糖柱纯化过程：选用G‑100葡聚糖纯化组分3(2.2成分)，将5mL的样品湿法上样，之后用去离子水洗脱，用苯酚‑硫酸法隔管检测，浓缩，冻干，得到精制平菇多糖硒苷‑Ⅲ。

[0073] 平菇多糖硒苷的水解及单糖组分分析：精密称取样品至5mL安培瓶中，加入2mL(2.0mol/L)三氟乙酸于5mL安瓿中，封管，110℃酸解8h。取出挥干三氟乙酸，加2mL水复溶，完成水解。后精确吸取250μL水解后溶液到5mL EP管中，加入250μL(0.6mol/L)氢氧化钠，500μL(0.4mol/L)1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮的甲醇溶液，70℃反应1h。冷水中冷却10min；
加入500μL 0.3mol/L盐酸中和，再加入1mL氯仿漩涡1min，3000r/min离心10min，小心取上清，萃取3次。取上清液，完成衍生化。参照试样为含50μg/m各对比糖的糖混合溶液，以同样条件进行衍生化。最后样品和参照品经过Xtimate C18高效液相设备在洗脱，记录洗脱曲线，通过样品与参照品的峰面积比即可计算得单糖组分(洗脱液为：0.05mol/LpH＝6.7磷酸二氢钾溶液‑乙腈＝83‑17)。其单糖组分分析结果见表1和图4。

[0074] 表1平菇多糖硒苷‑Ⅲ组成单糖含量

[0075]

[0076] 采用实施例1获得的平菇多糖硒苷‑Ⅲ进行以下抗癌和正常细胞毒性的研究，具体为：

[0077] 实施例2

[0078] 多糖硒苷‑Ⅲ(实施例1获得)对SKOV3细胞的药效实验

[0079] 以8000细胞/孔细胞密度将SKOV3细胞种在96孔细胞培养板上，待贴壁后，依次加入不同浓度的平菇多糖硒苷‑Ⅲ(实施例1获得，设置终浓度0、50、100、200、400和600μg/mL六组)，继续孵育24h后以传统的常规CCK‑8法测试细胞活力。

[0080] 通过AO/EB共染色考查平菇多糖硒苷对SKOV3的杀伤作用

[0081] 之后通过流式细胞术来量化细胞凋亡的情况，以每孔5x105的密度中板(6孔板)，孵育24h。用含有不同浓度多糖硒苷‑Ⅲ药物的细胞培养液(0μg/mL，300μg/mL，600μg/mL)更新培基，孵育24h。之后以膜联蛋白V‑FITC/PI凋亡检测试剂盒染色，消化收集细胞，并且在流式细胞仪上进行检测。

[0082] 划痕实验用来验证药物对细胞迁移能力的影响，以每孔1x106的细胞密度接种细胞，培育24h以贴壁，之后用200μL的枪头划痕，之后以含药物的无血清培养基培养0，12h，24h，48h后，在荧光倒置显微镜下观察。

[0083] 得到的平菇多糖硒苷呈白色絮状固体，略偏淡黄色。重均分子量为15306(见图2)，含硒量为28.38μg/g。其对SKOV3细胞抑制效果如图7和图8所示，图7表明即使在对SKOV3细胞的抑制作用是有浓度依赖性的，当给药浓度为600μg/mL时，肿瘤抑制率可达46％；图7EB通道信号随加入平菇多糖硒苷而明显增强，表明细胞凋亡明显增多。综上展现出了平菇多糖硒苷对卵巢癌细胞的高灵敏、高效率的杀伤作用。细胞流式细胞术结果表明(如图9所示)，在给药浓度为600μg/mL时，细胞凋亡率可达31.84％。如图10所示，划痕实验表明，平菇多糖硒苷‑Ⅲ可以显著抑制肿瘤细胞的迁移。

[0084] 对比例1

[0085] 平菇粗多糖(未进行过柱纯化，实施例1步骤(一)产物)对SKOV3的药效实验[0086] 以8000细胞/孔细胞密度将SKOV3细胞种在96孔细胞培养板上，待贴壁后，依次加入不同浓度的平菇粗多糖(实施例1获得，设置终浓度0、50、100、200、400和600μg/mL六组)，继续孵育24h后以传统的常规CCK‑8法测试细胞活力。

[0087] 如图11所示，在用平菇粗多糖孵育SKOV3细胞24h后，随着给药浓度的增大，细胞存活率无明显降低，这在一定程度上证明该平菇粗多糖对SKOV3细胞无明显抑制作用。

[0088] 实施例3

[0089] 采用实施例1获得的平菇多糖硒苷‑Ⅲ进行IOSE细胞抑制实验。

[0090] 以8000细胞/孔细胞密度将IOSE细胞种在96孔细胞培养板上，待贴壁后，依次加入不同浓度的平菇多糖硒苷‑Ⅲ(设置终浓度0、50、100、200、400和600μg/mL六组)，继续孵育24h后以传统的常规CCK‑8法测试细胞活力；

[0091] 通过AO/EB共染色考查平菇多糖硒苷对IOSE的抑制作用。之后通过流式细胞术来5
量化细胞凋亡的情况，以每孔5x10的密度中板(6孔板)，孵育24h。用含有不同浓度多糖硒苷‑Ⅲ药物的细胞培养液(0μg/mL，300μg/mL，600μg/mL)更新培基，孵育24h。之后以膜联蛋白V‑FITC/PI凋亡检测试剂盒染色，消化收集细胞，并且在流式细胞仪上进行检测。

[0092] 其对IOSE细胞抑制效果如图12所示，明显看出，所制备的平菇多糖硒苷在高浓度下对IOSE正常细胞无抑制作用。此外AO/EB共染色结果如图13所示，表明即便加入高浓度的平菇多糖硒苷，EB通道信号仍变化不大，再次印证了平菇多糖硒苷的安全性。如图14所示，细胞流式结果表明，所制备的平菇多糖硒苷在高浓度下对IOSE正常细胞无诱导凋亡作用。

[0093] 对比例2

[0094] 平菇粗多糖(未进行过柱纯化，实施例1步骤(一)产物)对IOSE细胞的药效实验[0095] 以8000细胞/孔细胞密度将IOSE细胞种在96孔细胞培养板上，待贴壁后，依次加入不同浓度的平菇粗多糖(设置终浓度0、50、100、200、400和600μg/mL六组)，继续孵育24h后以传统的常规CCK‑8法测试细胞活力；

[0096] 如图15所示，在用平菇粗多糖孵育IOSE细胞24h后，随着给药浓度的增大，细胞存活率无明显降低，这在一定程度上证明该平菇粗多糖对正常细胞无明显抑制作用。