羟基苯甲酸乙酯类化合物在作为杀线虫制剂的应用

摘要

本发明属于农药领域，具体涉及一种羟基苯甲酸乙酯类化合物在作为杀线虫剂的应用。通式Ⅰ所示羟基苯甲酸乙酯类化合物中的一种或几种在作为杀线虫剂的应用；通式Ⅰ如下所示；所述化合物适于用作杀线虫剂，尤其是活性较好的3‑羟基苯甲酸乙酯、4‑羟基苯甲酸乙酯是目前广泛应用的抗氧化剂，毒性小、价格低廉，易获得。

权利要求

1.一种羟基苯甲酸乙酯类化合物在作为杀松材线虫制剂的应用，其特征在于：所述羟基苯甲酸乙酯类化合物为4‑羟基苯甲酸乙酯。

2.按权利要求1所述的应用，其特征在于：4‑羟基苯甲酸乙酯在作为保护植物或植物繁殖材料抵抗由松材线虫导致的损害、运输造成的再传播或再危害的杀松材线虫制剂的应用。

3.按权利要求1所述的应用，其特征在于：杀松材线虫制剂中活性成分含权利要求1所述4‑羟基苯甲酸乙酯；杀松材线虫制剂为活性成分与农业上可接受的载体混合；其中，活性成分占杀松材线虫剂重量的0.01‑99%。

4.一种羟基苯甲酸乙酯类化合物在作为杀松材线虫组合物制剂的应用，其特征在于，组合物为A、B两种活性成分组成，其中，活性组分A与活性组分B按重量份数比为1:100‑100:

1混合；所述活性组分A为4‑羟基苯甲酸乙酯；活性组分B为其他杀线虫剂、杀虫剂、杀螨剂、杀菌剂中的一种或几种。

5.按权利要求1或4所述的应用，其特征在于：所述制剂为注射剂、喷洒剂、熏蒸剂、包衣剂或纳米化制剂。

6.一种保护植物或其繁殖材抵抗由松材线虫导致的损害的方法，其特征在于：所述方法包括将所述权利要求1的4‑羟基苯甲酸乙酯、权利要求3所述的制剂或权利要求4所述组合物制剂作用于植物或其场所。

7.一种防止松材线虫随侵染植物运输造成再传播、再危害的方法，其特征在于：所述方法包括将所述权利要求1的4‑羟基苯甲酸乙酯、权利要求3所述的制剂或权利要求4所述组合物制剂处理松材线虫侵染后的植物材料。

说明书

羟基苯甲酸乙酯类化合物在作为杀线虫制剂的应用

技术领域

[0001] 本发明属于农药领域，具体涉及一种羟基苯甲酸乙酯类化合在作为线虫(特别是松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus))制剂的应用。

背景技术

[0002] 线虫，属于线虫门,是一类两侧对称原体腔无脊椎动物；普遍生活在陆地、海洋和湖泊中；种类是仅次于昆虫的第二大无脊椎动物群体，占到地球上多细胞生物的4/5，已经
被观察、描述的线虫种类约有2.3万种，已鉴定出256科2271属，还有100万种有待发现，在
1743年英国科学家Needham在小麦的病粒中发现小麦粒线虫后，世界各个地区相继报道各
类土壤线虫。1993年Yeates等学者按照土壤线虫的取食特征、食道的结构和捕食方法等，将
土壤线虫的营养类群分成8个类群，其中植物寄生线虫、食真菌线虫、食细菌线虫和杂食性
线虫为土壤生态系统中的重要营养类群。如植物寄生线虫松材线虫、南方根结线虫，以及自
由生活线虫秀丽隐杆线虫，它们分类地位、形态特征、繁殖方式等多个方面存在非常大差
异。

[0003] 化学防治是目前防控线虫的主要措施。截至2019年12月，我国登记的杀线虫产品有312个，有效成分主要集中在阿维菌素、噻唑磷、甲基异柳磷、灭线磷、溴甲烷、涕灭威、氨
基寡糖素、棉隆、杀螟丹、威百亩、克百威、丁硫克百威等，大部分产品为有机磷类产品，毒性
很高，且从研发至推广这类农药的靶向生物主要针对危害草本植物的线虫(如根结线虫)，
多数药剂对寄生在松科等木本植物中的松材线虫抑制效果一般，如阿维菌素在推荐使用浓
度下对松材线虫的致死率不足30％。松材线虫病在我国危害严重且其蔓延趋势愈发严重，
我国迫切需要新的杀线虫活性物质。目前对松材线虫疫区的松科植物只能进行除治性采
伐，除治性采伐的疫木须在山场就地粉碎或烧毁，烧毁的疫木要全程摄像并存档，粉碎后的
疫木只可在本地区进行利用，禁止跨省级行政区进行利用，禁止山场用疫木加工板材。根据
初略估算每株疫木进行防治性采伐的费用约150‑200元之间。

[0004] 现有文献报道羟基苯甲酸甲酯类化合物具有引诱昆虫和线虫或有益于线虫的作用。例如，有些植物受到虫害后释放含有2‑羟基苯甲酸甲酯挥发物，引诱天敌昆虫(苗进等
2007)。有报道2‑羟基苯甲酸甲酯可用作为松材线虫引诱剂(赵博光等2013)。3,4‑二羟基苯
甲酸甲酯具有神经保护、抗细胞氧化损伤及延长秀丽线虫寿命的作用(米象男等018)。

[0005] 松材线虫病是由松材线虫侵染所引起的一种植物病害，此病是世界上最具危险性的森林病害，主要危害松科植物。植物经由媒介天牛感染松材线虫后发病，最快40天即可死
亡，从发病到整片松林毁灭只需要3‑5年时间。该病传播途径广，蔓延速度快，防治难度大，
被列为国际性检疫病害，是林业首要防控的对象。该疫情自1982年在我国南京中山陵首次
发现后，至今已扩散蔓延至全国18个省588个县(市区)，病死树已达1000万余株，发生面积
已近1000万亩，威胁到我国9亿亩松林的存亡，给我国林业生产和生态安全带来极大的威
胁。截至目前全国因松材线虫病损失的松树累计达数十亿株，造成的直接经济损失和生态
服务价值损失上千亿元。

[0006] 松材线虫与盈自养生活的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)在分类学上分别属于双胃亚纲与小杆亚纲；前者是雌雄异体，后者是雌雄同体；松材线虫是植物寄生线
虫，秀丽隐杆线虫试自由生活线虫；松材线虫是卵生，秀丽隐杆线虫是自体受精。两者在农
药或化合物耐受性上存在巨大差异。现有研究表明，松材线虫对农药或具杀线虫活性的物
质的耐受性远高于秀丽隐杆线虫或者南方根结线虫。例如，利用熏蒸法方法测定2,4‑二叔
3
丁基苯酚对秀丽隐杆线虫的最小致死浓度为0.7g/m ，而使用同样的方法测定2,4‑二叔丁
3
基苯酚对松材线虫的最小致死浓度为230.6g/m ，基本没有活性；松材线虫对2,4‑二叔丁基
苯酚的耐受性是秀丽隐杆线虫的329倍。这表明对秀丽隐杆线虫有毒杀作用的杀线剂可能
对松材线虫无效。因此，由于松材线虫与秀丽隐杆线虫亲缘关系相距甚远(分属不同的亚
纲)，所以它们在生物学特性、致病性、危害程度、对农药的耐受性等方面差异极其显著，进
而使得已报道对秀丽隐杆线虫具有杀虫活性的农药及化合物，并不能有力证明其对松材线
虫的杀虫活性。

发明内容

[0007] 本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种羟基苯甲酸乙酯类化合物在作为线虫抑制剂的应用。

[0008] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

[0009] 一种羟基苯甲酸乙酯类化合物在作为杀线虫剂的应用，通式Ⅰ所示羟基苯甲酸乙酯类化合物中的一种或几种在作为杀线虫的制剂的应用；

[0010] 通式Ⅰ如下所示：

[0011]

[0012] 式中，

[0013] R1、R2、R3可相同或不同的选自氢或羟基，且R1‑R3中有且只有一个选自羟基。

[0014] 所述通式Ⅰ所示羟基苯甲酸乙酯类化合物中的一种或几种在作为保护植物抵抗线虫侵染或危害中的杀线虫剂中的应用。

[0015] 所述通式Ⅰ所示羟基苯甲酸乙酯类化合物中的一种或几种在作为保护植物或植物繁殖材料抵抗由线虫导致的损害、运输造成的再传播或再危害的杀线虫剂的应用。

[0016] 所述线虫为尾感器纲双胃亚纲线虫。

[0017] 所述线虫为尾感器纲双胃亚纲滑刃目滑刃总科滑刃科线虫。

[0018] 所述线虫为松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)。

[0019] 一种杀线虫剂，杀线虫剂中活性成分含所述通式Ⅰ所示的羟基苯甲酸乙酯类化合物中的一种或几种。

[0020] 所述杀线虫剂为活性成分与农业上可接受的载体混合；其中，活性成分占杀线虫剂重量的0.01‑99％。

[0021] 一种杀线虫的组合物制剂，组合物为A、B两种活性成分组成，其中，活性组分A与活性组分B按重量份数比为1:100‑100:1混合；所述活性组分A为通式Ⅰ所示的羟基苯甲酸乙酯
类化合物中的一种或几种；活性组分B为其他杀线虫剂、杀虫剂、杀螨剂、杀菌剂中的一种或
几种。

[0022] 优选所述活性组分B可为如阿维菌素、苦参碱、噻唑膦、乙螨唑、吡唑醚菌酯、氨基寡糖素等。

[0023] 所述制剂为注射剂、喷洒剂、熏蒸剂、包衣剂或纳米化制剂；其中，纳米化制剂可采用湿法介质研磨法制备化合物纳米化制剂，所述纳米化粒径为50‑500nm，优选300‑500nm。

[0024] 一种保护植物或其繁殖材料抵抗由线虫导致的损害的方法，所述方法包括将所述通式Ⅰ所示羟基苯甲酸乙酯类化合物中的一种或几种、所述的制剂或所述组合物制剂作用
于植物或其场所；其中，场所为被线虫污染农业或林业等满足再生产需求，需要处理的场
地。

[0025] 一种防止线虫随侵染植物运输造成再传播、再危害的方法：所述方法包括将所述通式Ⅰ所示羟基苯甲酸乙酯类化合物中的一种或几种、所述的制剂或所述组合物制剂作用
于线虫侵染后的植物材料。

[0026] 本发明所具有的优点

[0027] 本发明化合物作为杀线虫剂，不仅能够有效控制松材线虫危害而且化合物易于获取能够大大降低杀线虫剂成本，同时，本发明化合物还可与杀线虫剂、杀虫剂、杀螨剂、杀菌
剂等组合使用，如阿维菌素、苦参碱、噻唑膦、氨基寡糖素，可显著提高活性；本发明制剂利
于后续市场化推广与应用。

附图说明

[0028] 图1为本发明实施例2提供的经药剂处理24h后线虫死亡率拟合曲线图。

[0029] 图2为本发明实施例3提供的经药剂处理24h后线虫死亡率拟合曲线图。

[0030] 图3为本发明实施例4提供的经药剂处理24h后线虫死亡率拟合曲线图。

具体实施方式

[0031] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分，而不是发明的全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在
没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

[0032] 下述各实施例实验材料中：

[0033] 供试药剂：本发明通式Ⅰ所示羟基苯甲酸乙酯类化合物均为已知化合物，且低廉、易获得。

[0034] 实施例1、待测物生测体系对松材线虫安全性检测

[0035] 药剂配制：用灭菌水配制供试药剂水溶液，其中DMSO含量4％，吐温80含量15％；无药剂添加的灭菌水作为对照。

[0036] 线虫悬浮液的制备：用适量的灭菌水将位于9cm PDA培养皿表面的松材线虫悬浮于水相，后经贝尔曼漏斗法分离得到活的松材线虫悬浮液，将线虫悬浮液2000r/min离心
2min，去上清留沉淀并加适量灭菌水后镜检观察线虫龄期、活性状况并统计线虫数量，最后
用灭菌水将线虫悬浮液定量至1000头线虫/mL，绝大多数线虫处于J3期，有少数为J2期及J4
期，4℃备用。

[0037] 药剂处理：取0.5mL上述制备的线虫悬浮液，2000r/min离心2min，去除上清液，向沉淀中分别加入0.5mL上述不同的供试药剂，用移液枪打吹均匀，将离心管盖盖后置于25
℃、相对湿度60％、无光的人工气候箱内培养，24h后在40倍奥林巴斯CX33光学显微镜下镜
检观察并记录线虫总虫数和死亡虫数。

[0038] 表1待测物生测体系对松材线虫安全性检测

[0039]

[0040] 结论：4％DMSO+15％吐温80水溶液对松材线虫24h的校正死亡率为0.01％，远低于5％，证明4％DMSO+15％吐温80水溶液对松材线虫安全，可以作为松材线虫待测物的生测体
系应用。

[0041] 实施例2、2‑羟基苯甲酸乙酯对松材线虫的毒杀活性及LC50测定

[0042] 药剂配制：将2‑羟基苯甲酸乙酯用生测体系(4％DMSO+15％吐温的水溶液)配制成0、0.1、1、5、和10g/L共5个浓度的药剂。

[0043] 线虫悬浮液的制备：用适量的灭菌水将位于9cm PDA培养皿表面的松材线虫悬浮于水相，后经贝尔曼漏斗法分离得到活的松材线虫悬浮液，将线虫悬浮液2000r/min离心
2min，去上清留沉淀并加适量灭菌水后镜检观察线虫龄期、活性状况并统计线虫数量，最后
用灭菌水将线虫悬浮液定量至1000头线虫/mL，绝大多数线虫处于J3期，有少数为J2期及J4
期，4℃备用。

[0044] 药剂处理：取0.5mL上述制备的线虫悬浮液，2000r/min离心2min，去除上清液，向沉淀中分别加入0.5mL上述不同的供试药剂，用移液枪打吹均匀，将离心管盖盖后置于25
℃、相对湿度60％、无光的人工气候箱内培养，24h后在40倍奥林巴斯CX33光学显微镜下镜
检观察并记录线虫总虫数和死亡虫数。

[0045] 表2 2‑羟基苯甲酸乙酯对松材线虫的毒杀活性测定

[0046]

[0047] 结论：由上述表2和图1可见2‑羟基苯甲酸乙酯处理24h后根据数据获得拟合曲线2
为y＝10.852x+3.5401，R＝0.9032，由此获得2‑羟基苯甲酸乙酯对松材线虫LC50为4.28g/
L；进而可见2‑羟基苯甲酸乙酯具有强杀松材线虫的活性。

[0048] 实施例3、4‑羟基苯甲酸乙酯对松材线虫的毒杀活性及LC50测定

[0049] 药剂配制：将4‑羟基苯甲酸乙酯用生测体系(4％DMSO+15％吐温的水溶液)配制成0、0.1、1、5、和10g/L共5个浓度的药剂。

[0050] 线虫悬浮液的制备：用适量的灭菌水将位于9cm PDA培养皿表面的松材线虫悬浮于水相，后经贝尔曼漏斗法分离得到活的松材线虫悬浮液，将线虫悬浮液2000r/min离心
2min，去上清留沉淀并加适量灭菌水后镜检观察线虫龄期、活性状况并统计线虫数量，最后
用灭菌水将线虫悬浮液定量至1000头线虫/mL，绝大多数线虫处于J3期，有少数为J2期及J4
期，4℃备用。

[0051] 药剂处理：取0.5mL上述制备的线虫悬浮液，2000r/min离心2min，去除上清液，向沉淀中分别加入0.5mL上述不同的供试药剂，用移液枪打吹均匀，将离心管盖盖后置于25
℃、相对湿度60％、无光的人工气候箱内培养，24h后在40倍奥林巴斯CX33光学显微镜下镜
检观察并记录线虫总虫数和死亡虫数。

[0052] 表3 4‑羟基苯甲酸乙酯对松材线虫的毒杀活性测定

[0053]

[0054] 结论：由上述表3和图2可见4‑羟基苯甲酸乙酯处理24h后根据数据获得拟合曲线2
为y＝4.4222x‑2.2334，R ＝0.8847，由此获得4‑羟基苯甲酸乙酯对松材线虫LC50为
11.81g/L；进而可见4‑羟基苯甲酸乙酯具有强杀松材线虫的活性。

[0055] 实施例4、3‑羟基苯甲酸乙酯对松材线虫的毒杀活性及LC50测定

[0056] 药剂配制：将3‑羟基苯甲酸乙酯用生测体系(4％DMSO+15％吐温的水溶液)配制成0、1、10、20、和30g/L共5个浓度的药剂。

[0057] 线虫悬浮液的制备：用适量的灭菌水将位于9cm PDA培养皿表面的松材线虫悬浮于水相，后经贝尔曼漏斗法分离得到活的松材线虫悬浮液，将线虫悬浮液2000r/min离心
2min，去上清留沉淀并加适量灭菌水后镜检观察线虫龄期、活性状况并统计线虫数量，最后
用灭菌水将线虫悬浮液定量至1000头线虫/mL，绝大多数线虫处于J3期，有少数为J2期及J4
期，4℃备用。

[0058] 药剂处理：取0.5mL上述制备的线虫悬浮液，2000r/min离心2min，去除上清液，向沉淀中分别加入0.5mL上述不同的供试药剂，用移液枪打吹均匀，将离心管盖盖后置于25
℃、相对湿度60％、无光的人工气候箱内培养，24h后在40倍奥林巴斯CX33光学显微镜下镜
检观察并记录线虫总虫数和死亡虫数。

[0059] 表4 3‑羟基苯甲酸乙酯对松材线虫的毒杀活性测定

[0060]

[0061] 结论：由上述表4和图3可见3‑羟基苯甲酸乙酯处理24h后根据数据获得拟合曲线2
为y＝2.4638x‑4.7187，R ＝0.9598，由此获得3‑羟基苯甲酸乙酯对松材线虫LC50为
22.21g/L；进而可见3‑羟基苯甲酸乙酯具有强杀松材线虫的活性。

[0062] 实施例5、2‑羟基苯甲酸乙酯复配农药对松材线虫毒杀活性的增效实验

[0063] 药剂配制：

[0064] 1)2‑羟基苯甲酸乙酯用生测体系配制为浓度5g/L的2‑羟基苯甲酸乙酯水溶液；

[0065] 2)苦参碱经灭菌水配制浓度为0.6mg/L的苦参碱水溶液；

[0066] 3)阿维菌素经灭菌水配制浓度为18mg/L的阿维菌素水溶液；

[0067] 4)复配药剂1为生测体系中添加2‑羟基苯甲酸乙酯和苦参碱；其中，2‑羟基苯甲酸乙酯的终浓度为5g/L、苦参碱的终浓度为0.6mg/L；

[0068] 5)复配药剂2为生测体系中添加2‑羟基苯甲酸乙酯和阿维菌素；其中，2‑羟基苯甲酸乙酯的终浓度为5g/L、阿维菌素的终浓度为18mg/L；

[0069] 6)生测体系溶液为空白对照组；

[0070] 线虫悬浮液的制备：用适量的灭菌水将位于9cm PDA培养皿表面的松材线虫悬浮于水相，后经贝尔曼漏斗法分离得到活的松材线虫悬浮液，将线虫悬浮液2000r/min离心
2min，去上清留沉淀并加适量灭菌水后镜检观察线虫龄期、活性状况并统计线虫数量，最后
用灭菌水将线虫悬浮液定量至1000头线虫/mL，绝大多数线虫处于J3期，有少数为J2期及J4
期，4℃备用。

[0071] 药剂处理：取0.5mL上述制备的线虫悬浮液，2000r/min离心2min，去除上清液，向沉淀中分别加入0.5mL上述不同的供试药剂，用移液枪打吹均匀，将离心管盖盖后置于25
℃、相对湿度60％、无光的人工气候箱内培养，24h后在40倍奥林巴斯CX33光学显微镜下镜
检观察并记录线虫总虫数和死亡虫数。

[0072] 表5 2‑羟基苯甲酸乙酯复配农药对松材线虫毒杀活性

[0073]

[0074] 表6 2‑羟基苯甲酸乙酯复配农药对松材线虫毒杀活性的增效

[0075]

[0076] 结论：由表5、表6可知，2‑羟基苯甲酸乙酯分别复配阿维菌素、苦参碱均较未复配2‑羟基苯甲酸乙酯的阿维菌素、苦参碱对松材线虫的毒杀活性得到大幅提升，增效效果分
别为289.11％、235.57％；阿维菌素、苦参碱复配药剂较2‑羟基苯甲酸乙酯增效幅度均为
19.19％。2‑羟基苯甲酸乙酯复配农药可大幅度提高农药的杀线活性。

[0077] 实施例6、4‑羟基苯甲酸乙酯复配农药对松材线虫毒杀活性的增效实验

[0078] 药剂配制：

[0079] 用灭菌水配制以下溶液分别作为供式组别：

[0080] 1)4‑羟基苯甲酸乙酯用生测体系(4％DMSO+15吐温80)配制为浓度14g/L的4‑羟基苯甲酸乙酯水溶液；

[0081] 2)苦参碱经水配制浓度为0.6mg/L的苦参碱水溶液；

[0082] 3)阿维菌素经水配制浓度为18mg/L的阿维菌素水溶液；

[0083] 4)复配药剂1为生测体系中添加4‑羟基苯甲酸乙酯和苦参碱；其中4‑羟基苯甲酸乙酯的终浓度为14g/L、苦参碱的终浓度为0.6mg/L；

[0084] 5)复配药剂2为生测体系中添加4‑羟基苯甲酸乙酯和阿维菌素；其中4‑羟基苯甲酸乙酯的终浓度为14g/L、阿维菌素的终浓度为18mg/L；

[0085] 6)生测体系为空白对照组；

[0086] 线虫悬浮液的制备：用适量的灭菌水将位于9cm PDA培养皿表面的松材线虫悬浮于水相，后经贝尔曼漏斗法分离得到活的松材线虫悬浮液，将线虫悬浮液2000r/min离心
2min，去上清留沉淀并加适量灭菌水后镜检观察线虫龄期、活性状况并统计线虫数量，最后
用灭菌水将线虫悬浮液定量至1000头线虫/mL，绝大多数线虫处于J3期，有少数为J2期及J4
期，4℃备用。

[0087] 药剂处理：取0.5mL上述制备的线虫悬浮液，2000r/min离心2min，去除上清液，向沉淀中分别加入0.5mL上述不同的供试药剂，用移液枪打吹均匀，将离心管盖盖后置于25
℃、相对湿度60％、无光的人工气候箱内培养，24h后在40倍奥林巴斯CX33光学显微镜下镜
检观察并记录线虫总虫数和死亡虫数。

[0088] 表7 4‑羟基苯甲酸乙酯复配农药对松材线虫毒杀活性

[0089]

[0090] 表8 4‑羟基苯甲酸乙酯复配农药对松材线虫毒杀活性的增效

[0091]

[0092] 结论：由表7、表8可知，4‑羟基苯甲酸乙酯分别复配阿维菌素、苦参碱均较未复配2‑羟基苯甲酸乙酯的阿维菌素、苦参碱对松材线虫的毒杀活性得到大幅提升，增效效果分
别为277.55％、162.02％；阿维菌素、苦参碱复配药剂较4‑羟基苯甲酸乙酯分别增效
64.15％、13.92％。4‑羟基苯甲酸乙酯复配农药可大幅度提高农药的杀线活性。

[0093] 实施例7、3‑羟基苯甲酸乙酯复配农药对松材线虫毒杀活性的增效实验

[0094] 药剂配制：

[0095] 用灭菌水配制以下溶液分别作为供式组别：

[0096] 1)3‑羟基苯甲酸乙酯用生测体系配制为浓度25g/L的3‑羟基苯甲酸乙酯水溶液；

[0097] 2)苦参碱经水配制浓度为0.6mg/L的苦参碱水溶液；

[0098] 3)阿维菌素经水配制浓度为18mg/L的阿维菌水溶液；

[0099] 4)复配药剂1为生测体系中添加3‑羟基苯甲酸乙酯和苦参碱；其中，3‑羟基苯甲酸乙酯的终浓度为25g/L、苦参碱的终浓度为0.6mg/L；

[0100] 5)复配药剂1为生测体系中添加3‑羟基苯甲酸乙酯和阿维菌素；其中3‑羟基苯甲酸乙酯的终浓度为25g/L、阿维菌素的终浓度为18mg/L；

[0101] 6)生测体系为空白对照组；

[0102] 线虫悬浮液的制备：用适量的灭菌水将位于9cm PDA培养皿表面的松材线虫悬浮于水相，后经贝尔曼漏斗法分离得到活的松材线虫悬浮液，将线虫悬浮液2000r/min离心
2min，去上清留沉淀并加适量灭菌水后镜检观察线虫龄期、活性状况并统计线虫数量，最后
用灭菌水将线虫悬浮液定量至1000头线虫/mL，绝大多数线虫处于J3期，有少数为J2期及J4
期，4℃备用。

[0103] 药剂处理：取0.5mL上述制备的线虫悬浮液，2000r/min离心2min，去除上清液，向沉淀中分别加入0.5mL上述不同的供试药剂，用移液枪打吹均匀，将离心管盖盖后置于25
℃、相对湿度60％、无光的人工气候箱内培养，24h后在40倍奥林巴斯CX33光学显微镜下镜
检观察并记录线虫总虫数和死亡虫数。

[0104] 表9 3‑羟基苯甲酸乙酯复配农药对松材线虫毒杀活性

[0105]

[0106] 表10 3‑羟基苯甲酸乙酯复配农药对松材线虫毒杀活性的增效

[0107]

[0108] 结论：由表9、表10可知，3‑羟基苯甲酸乙酯分别复配阿维菌素、苦参碱均较未复配3‑羟基苯甲酸乙酯的阿维菌素、苦参碱对松材线虫的毒杀活性得到大幅提升，增效效果分
别为272.26％、289.11％；阿维菌素、苦参碱复配药剂较3‑羟基苯甲酸乙酯分别增效
66.59％、74.13％。4‑羟基苯甲酸乙酯复配农药可大幅度提高农药的杀线活性。

[0109] 实施例8、化合物间复配对松材线虫毒杀活性的增效实验

[0110] 药剂配制：

[0111] 用灭菌水配制以下溶液分别作为供式组别：

[0112] 1)2‑羟基苯甲酸乙酯用生测体系配制为浓度4g/L的2‑羟基苯甲酸乙酯水溶液；

[0113] 2)3‑羟基苯甲酸乙酯用生测体系配制为浓度22g/L的3‑羟基苯甲酸乙酯水溶液；

[0114] 3)4‑羟基苯甲酸乙酯用生测体系配制为浓度11g/L的4‑羟基苯甲酸乙酯水溶液；

[0115] 4)复配药剂1为生测体系中添加2‑羟基苯甲酸乙酯和3‑羟基苯甲酸乙酯；其中，2‑羟基苯甲酸乙酯的终浓度为4g/L、3‑羟基苯甲酸乙酯的终浓度为22g/L；

[0116] 5)复配药剂2为生测体系中添加2‑羟基苯甲酸乙酯和4‑羟基苯甲酸乙酯；其中，2‑羟基苯甲酸乙酯的终浓度为4g/L、4‑羟基苯甲酸乙酯的终浓度为11g/L；

[0117] 6)复配药剂3为生测体系中添加3‑羟基苯甲酸乙酯和4‑羟基苯甲酸乙酯；其中，3‑羟基苯甲酸乙酯的终浓度为22g/L、4‑羟基苯甲酸乙酯的终浓度为11g/L；

[0118] 7)复配药剂4为生测体系中添加2‑羟基苯甲酸乙酯、3‑羟基苯甲酸乙酯和4‑羟基苯甲酸乙酯；其中，2‑羟基苯甲酸乙酯的终浓度为4g/L、3‑羟基苯甲酸乙酯的终浓度为22g/
L、4‑羟基苯甲酸乙酯的终浓度为11g/L；

[0119] 8)生测体系为空白对照组；

[0120] 线虫悬浮液的制备：用适量的灭菌水将位于9cm PDA培养皿表面的松材线虫悬浮于水相，后经贝尔曼漏斗法分离得到活的松材线虫悬浮液，将线虫悬浮液2000r/min离心
2min，去上清留沉淀并加适量灭菌水后镜检观察线虫龄期、活性状况并统计线虫数量，最后
用灭菌水将线虫悬浮液定量至1000头线虫/mL，绝大多数线虫处于J3期，有少数为J2期及J4
期，4℃备用。

[0121] 药剂处理：取0.5mL上述制备的线虫悬浮液，2000r/min离心2min，去除上清液，向沉淀中分别加入0.5mL上述不同的供试药剂，用移液枪打吹均匀，将离心管盖盖后置于25
℃、相对湿度60％、无光的人工气候箱内培养，24h后在40倍奥林巴斯CX33光学显微镜下镜
检观察并记录线虫总虫数和死亡虫数。

[0122] 表11化合物间复配对松材线虫毒杀活性

[0123]

[0124] 表12化合物间复配对松材线虫毒杀活性增效

[0125]

[0126] 结论：由表11、表12可知，2‑羟基苯甲酸乙酯、3‑羟基苯甲酸乙酯、4‑羟基苯甲酸乙酯三种化合物间存在明显的协同增效作用，二元复配较单一化合物杀线活性至少增效
20.78％，三元复配较单一化合物杀线活性至少增效48.74％。

[0127] 实施例9、2‑羟基苯甲酸乙酯纳米化制剂对松材线虫的毒杀活性测定

[0128] 1)2‑羟基苯甲酸乙酯纳米化制剂制备方法

[0129] 分别取3g吐温80及PVP K30依次加入100mL去离子水中，在500r/min磁力搅拌器中溶解，形成水相。称取0.4g 2‑羟基苯甲酸乙酯加入上述水相中，混匀后转移至WG‑0.3L介质
研磨机中，选用直径0.3mm的氧化锆珠为研磨介质，介质填充量为研磨机腔体的75％，
2000r/min研磨20min，研磨好的纳米混悬液等分为4份，分别于52℃下放置0.5h、2d、6d、12d
后测量并统计纳米混悬液的粒径大小、多分散性、2‑羟基苯甲酸乙酯分解率(表13)。

[0130] 表13 2‑羟基苯甲酸乙酯纳米混悬剂各指标

[0131] 52℃放置时间 平均粒径(d.nm) 多分散性 2‑羟基苯甲酸乙酯分解率0.5h 375.2±47.08 0.08±0.05 1.05％
2d 378.4±33.54 0.09±0.08 1.23％
6d 392.5±41.69 0.14±0.04 2.45％
12d 432.1±32.82 0.18±0.08 2.89％

[0132] 2‑羟基苯甲酸乙酯经上述湿法介质研磨后于25℃存放12d内其平均粒径均小于500nm，且其多分散性PDI均小于0.25，表明溶液颗粒不仅达到纳米化级别且2‑羟基苯甲酸
乙酯在纳米化混悬液中分布窄，体系均一性较好。湿法介质研磨过程中由于研磨介质的反
复碰撞有效成分会存在一定的分解比率，经高效液相色谱定量分析得出2‑羟基苯甲酸乙酯
在纳米混悬液中的分解率均小于5％，GB/T 19136‑2003《农药热储稳定性测定方法》规定，
农药经过热储化学稳定性试验，药物有效成分分解率低于5％即为合格。综上，基于介质研
磨法制备的2‑羟基苯甲酸乙酯纳米混悬剂有效成分平均粒径、有效成分在体系内的分散
性、有效成分稳定性等均符合要求，因此可以使用上述方法制备合格的2‑羟基苯甲酸乙酯
纳米化制剂。

[0133] 2)利用上述获得2‑羟基苯甲酸乙酯纳米化制剂对松材线虫的毒杀活性测定

[0134] 药剂配制：取制备好的有效成分浓度为4g/L的2‑羟基苯甲酸乙酯纳米混悬液、配制浓度为4g/L的无纳米化处理的2‑羟基苯甲酸乙酯溶液、配制3％吐温80+PVP K30水溶液
为对照药剂。

[0135] 线虫悬浮液的制备：用适量的灭菌水将位于9cm PDA培养皿表面的松材线虫悬浮于水相，后经贝尔曼漏斗法分离得到活的松材线虫悬浮液，将线虫悬浮液2000r/min离心
2min，去上清留沉淀并加适量灭菌水后镜检观察线虫龄期、活性状况并统计线虫数量，最后
用灭菌水将线虫悬浮液定量至1000头线虫/mL，绝大多数线虫处于J3期，有少数为J2期及J4
期，4℃备用。

[0136] 药剂处理：取0.5mL上述制备的线虫悬浮液，2000r/min离心2min，去除上清液，向沉淀中分别加入0.5mL上述不同的供试药剂，用移液枪打吹均匀，将离心管盖盖后置于25
℃、相对湿度60％、无光的人工气候箱内培养，24h后在40倍奥林巴斯CX33光学显微镜下镜
检观察并记录线虫总虫数和死亡虫数。

[0137] 表14 2‑羟基苯甲酸乙酯纳米化前后杀线虫活性

[0138]

[0139] 结论：2‑羟基苯甲酸乙酯经纳米化处理后其对松材线虫的杀虫活性大幅提升，提升幅度为98.72％。

[0140] 实施例10、3‑羟基苯甲酸乙酯纳米化制剂对松材线虫的毒杀活性测定

[0141] 1)3‑羟基苯甲酸乙酯纳米化制剂制备方法

[0142] 分别取3.5g吐温80及PVP K30分别加入100mL去离子水中，在600r/min磁力搅拌器中溶解，形成水相。称取2.2g3‑羟基苯甲酸乙酯加入上述水相中，混匀后转移至WG‑0.3L介
质研磨机中，选用直径0.3mm的氧化锆珠为研磨介质，介质填充量为研磨机腔体的75％，
2000r/min研磨20min，研磨好的纳米混悬液等分为4份，分别于52℃下放置0.5h、2d、6d、12d
后测量并统计纳米混悬液的粒径大小、多分散性、3‑羟基苯甲酸乙酯分解率(表15)。

[0143] 表15 3‑羟基苯甲酸乙酯纳米混悬剂各指标

[0144]52℃放置时间 平均粒径(d.nm) 多分散性 3‑羟基苯甲酸乙酯分解率
0.5h 400.2±45.08 0.07±0.04 1.15％
2d 402.4±36.54 0.08±0.09 1.32％
6d 410.5±41.75 0.15±0.05 2.15％
12d 412.1±30.82 0.18±0.10 2.69％

[0145] 3‑羟基苯甲酸乙酯经上述湿法介质研磨后于25℃存放12d内其平均粒径均小于500nm，且其多分散性PDI均小于0.25，表明溶液颗粒不仅达到纳米化级别且3‑羟基苯甲酸
乙酯在纳米化混悬液中分布窄，体系均一性较好。湿法介质研磨过程中由于研磨介质的反
复碰撞有效成分会存在一定的分解比率，经高效液相色谱定量分析得出3‑羟基苯甲酸乙酯
在纳米混悬液中的分解率均小于5％，GB/T 19136‑2003《农药热储稳定性测定方法》规定，
农药经过热储化学稳定性试验，药物有效成分分解率低于5％即为合格。综上，基于介质研
磨法制备的3‑羟基苯甲酸乙酯纳米混悬剂有效成分平均粒径、有效成分在体系内的分散
性、有效成分稳定性等均符合要求，因此可以使用上述方法制备合格的3‑羟基苯甲酸乙酯
纳米化制剂。

[0146] 2)利用上述获得3‑羟基苯甲酸乙酯纳米化制剂对松材线虫的毒杀活性测定

[0147] 药剂配制：取制备好的有效成分浓度为22g/L的3‑羟基苯甲酸乙酯纳米混悬液、配制浓度为22g/L的无纳米化处理的3‑羟基苯甲酸乙酯溶液、配制3％吐温80+PVP K30水溶液
为对照药剂。

[0148] 线虫悬浮液的制备：用适量的灭菌水将位于9cm PDA培养皿表面的松材线虫悬浮于水相，后经贝尔曼漏斗法分离得到活的松材线虫悬浮液，将线虫悬浮液2000r/min离心
2min，去上清留沉淀并加适量灭菌水后镜检观察线虫龄期、活性状况并统计线虫数量，最后
用灭菌水将线虫悬浮液定量至1000头线虫/mL，绝大多数线虫处于J3期，有少数为J2期及J4
期，4℃备用。

[0149] 药剂处理：取0.5mL上述制备的线虫悬浮液，2000r/min离心2min，去除上清液，向沉淀中分别加入0.5mL上述不同的供试药剂，用移液枪打吹均匀，将离心管盖盖后置于25
℃、相对湿度60％、无光的人工气候箱内培养，24h后在40倍奥林巴斯CX33光学显微镜下镜
检观察并记录线虫总虫数和死亡虫数。

[0150] 表16 3‑羟基苯甲酸乙酯纳米化前后杀线虫活性

[0151]

[0152] 结论：3‑羟基苯甲酸乙酯经纳米化处理后其对松材线虫的杀虫活性大幅提升，提升幅度为98.48％。

[0153] 实施例11、4‑羟基苯甲酸乙酯纳米化制剂对松材线虫的毒杀活性测定

[0154] 1)4‑羟基苯甲酸乙酯纳米化制剂制备方法

[0155] 分别取4g吐温80及PVP K30分别加入100mL去离子水中，在650r/min磁力搅拌器中溶解，形成水相。称取1.2g 4‑羟基苯甲酸乙酯加入上述水相中，混匀后转移至WG‑0.3L介质
研磨机中，选用直径0.3mm的氧化锆珠为研磨介质，介质填充量为研磨机腔体的75％，
2000r/min研磨30min，研磨好的纳米混悬液等分为4份，分别于52℃下放置0.5h、2d、6d、12d
后测量并统计纳米混悬液的粒径大小、多分散性、4‑羟基苯甲酸乙酯分解率(表17)。

[0156] 表17 4‑羟基苯甲酸乙酯纳米混悬剂各指标

[0157]52℃放置时间 平均粒径(d.nm) 多分散性 4‑羟基苯甲酸乙酯分解率
0.5h 405.2±40.08 0.04±0.02 1.10％
2d 407.4±40.54 0.08±0.05 1.29％
6d 410.5±39.75 0.12±0.06 2.23％
12d 412.1±35.82 0.19±0.11 2.71％

[0158] 4‑羟基苯甲酸乙酯经上述湿法介质研磨后于25℃存放12d内其平均粒径均小于500nm，且其多分散性PDI均小于0.25，表明溶液颗粒不仅达到纳米化级别且4‑羟基苯甲酸
乙酯在纳米化混悬液中分布窄，体系均一性较好。湿法介质研磨过程中由于研磨介质的反
复碰撞有效成分会存在一定的分解比率，经高效液相色谱定量分析得出4‑羟基苯甲酸乙酯
在纳米混悬液中的分解率均小于5％，GB/T 19136‑2003《农药热储稳定性测定方法》规定，
农药经过热储化学稳定性试验，药物有效成分分解率低于5％即为合格。综上，基于介质研
磨法制备的4‑羟基苯甲酸乙酯纳米混悬剂有效成分平均粒径、有效成分在体系内的分散
性、有效成分稳定性等均符合要求，因此可以使用上述方法制备合格的4‑羟基苯甲酸乙酯
纳米化制剂。

[0159] 2)利用上述获得4‑羟基苯甲酸乙酯纳米化制剂对松材线虫的毒杀活性测定：

[0160] 药剂配制：取制备好的有效成分浓度为12g/L的4‑羟基苯甲酸乙酯纳米混悬液、配制浓度为12g/L的无纳米化处理的4‑羟基苯甲酸乙酯溶液、配制3％吐温80+PVP K30水溶液
为对照药剂。

[0161] 线虫悬浮液的制备：用适量的灭菌水将位于9cm PDA培养皿表面的松材线虫悬浮于水相，后经贝尔曼漏斗法分离得到活的松材线虫悬浮液，将线虫悬浮液2000r/min离心
2min，去上清留沉淀并加适量灭菌水后镜检观察线虫龄期、活性状况并统计线虫数量，最后
用灭菌水将线虫悬浮液定量至1000头线虫/mL，绝大多数线虫处于J3期，有少数为J2期及J4
期，4℃备用。

[0162] 药剂处理：取0.5mL上述制备的线虫悬浮液，2000r/min离心2min，去除上清液，向沉淀中分别加入0.5mL上述不同的供试药剂，用移液枪打吹均匀，将离心管盖盖后置于25
℃、相对湿度60％、无光的人工气候箱内培养，24h后在40倍奥林巴斯CX33光学显微镜下镜
检观察并记录线虫总虫数和死亡虫数。

[0163] 表18 4‑羟基苯甲酸乙酯纳米化前后杀线虫活性

[0164]

[0165] 结论：4‑羟基苯甲酸乙酯经纳米化处理后其对松材线虫的杀虫活性大幅提升，提升幅度为109.91％。