一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法、细胞和应用转让专利
申请号 : CN202011102574.1
文献号 : CN112251413B
文献日 : 2021-05-14
发明人 : 焦顺昌 , 张嵘 , 袁翰 , 张艳玲 , 李斯慧 , 冯向辉 , 宋文静 , 吕鹏敏 , 钟宏东 , 胡坤
申请人 : 焦顺昌 , 北京鼎成肽源生物技术有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)将序列通过Bsu36I和BmgBI双酶切位点整合到质粒中,得到PB‑S‑RBD‑NGFR质粒;所述序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;
2)将所述步骤1)得到的PB‑S‑RBD‑NGFR质粒电转化到K562细胞中,经嘌呤霉素筛选,当活细胞比例持续大于80%时,得到跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤2)嘌呤霉素筛选时的使用浓度为5μg/ml。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤2)电转化的条件包括:560V、
30ms。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤2)PB‑S‑RBD‑NGFR质粒的质7
量与K562细胞的数量比为10μg:1×10cells。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤2)筛选的时间在7d以上。
6.一种基于权利要求1~5任一项所述的制备方法制备得到的跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞,所述细胞的细胞膜上表达信号肽、新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域和跨膜蛋白结构域;
所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示,所述新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示,所述跨膜蛋白结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
7.根据权利要求6所述的细胞,其特征在于,编码信号肽的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
8.据权利要求6所述的细胞,其特征在于,编码新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
9.据权利要求6所述的细胞,其特征在于,编码跨膜蛋白结构域的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
10.权利要求6~9任一项所述的细胞在制备新型冠状病毒抗体中的应用。
说明书 :
一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法、细胞和
应用
技术领域
背景技术
窘迫综合征、脓毒症休克、出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等,甚至死亡。SARS‑CoV‑2病
毒通过其表面的囊膜蛋白吸附和进入宿主细胞,从而感染人的呼吸道上皮细胞及肺泡细
胞。SARS‑CoV‑2的囊膜蛋白即刺突蛋白(Spike protein,S)是一种糖蛋白,主要作用于细胞
粘附和细胞膜融合。
素转换酶2(Angiotensin‑converting enzyme 2,ACE2)结合,是病毒和受体相互作用以及
病毒入侵细胞的关键因素。RBD是宿主中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点。
由于目前没有效果非常好的药物、治疗性抗体、疫苗等用于SARS‑CoV‑2病毒感染的治疗和
预防,因此开发针对SARS‑CoV‑2病毒的疫苗对于健康人的保护及应对病毒的再次爆发是至
关重要的。然而,将病毒的全长蛋白作为临床使用的抗原可以引起部分的对于病毒的预防
作用,但也常见到临床报道有抗体依赖性增强(Antibody‑dependent enhancement,简称
ADE)作用,从而产生比未用疫苗者更加严重的病毒感染。
发明内容
细胞表达,避免了其它S蛋白表位导致的抗体依赖性增强的风险,再将新型冠状病毒刺突糖
蛋白的受体结合结构域与跨膜蛋白结构域融合后,在动物体内诱发出更佳的中和滴度。
10cells。
体结合结构域和跨膜蛋白结构域;
SEQ ID No.4所示。
效果突出,故细胞疫苗选择RBD进一步优化和表达。
白中RBD结构和有SEQ ID No.4氨基酸序列的跨膜蛋白结构域融合表达时,跨膜表达RBD效
率更高。
抗体。
附图说明
具体实施方式
酸序列如SEQ ID No.1所示,具体如下:
序列为编码新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域的核苷酸序列,波浪线的序列为编
码跨膜蛋白结构域的核苷酸序列。在本发明中,编码信号肽的核苷酸序列引导细胞表达出
的嵌合蛋白(即新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域融合跨膜蛋白结构域)移动到
细胞膜上,S蛋白的RBD区域是抗原(缩写为S‑RBD),诱导中和抗体产生,编码跨膜蛋白结构
域的核苷酸序列为去除胞内区的蛋白片段,让嵌合蛋白可以附着在细胞膜上。
人员依据常规技术操作即可。在本发明中,制备得到的PB‑S‑RBD‑NGFR质粒优选进行大量抽
提和去除内毒素后再进行后续操作。在本发明中,所述PB‑S‑RBD‑NGFR质粒的结构图如图9
所示。
7
的数量比优选为10μg:1×10 cells。在本发明中,所述嘌呤霉素筛选时的使用浓度优选为5
μg/ml,所述筛选的时间优选在7d以上。本发明对电转化的其它条件如使用的培养基等没有
特殊限定,本领域技术人员依据常规操作即可。
体结合结构域和跨膜蛋白结构域;所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示,所述新型
冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域的氨基酸序列如SRQ ID No.3所示,所述跨膜蛋白
结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
PFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKC
VNFDYKDDDDK。
EDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRG
TTDNLIPVYCSILAAVVVGLVAYIAFKR。
RBD),诱导中和抗体产生,跨膜蛋白结构域去除胞内区的蛋白片段,让嵌合蛋白可以附着在
细胞膜上。在本发明中,所述嵌合蛋白的结构如图10所示。
ccggctctccacgctttgcctgaccctgcttgctcaactctacgtctttgtttcgttttctgttctgcgccgttac
agatccaagctgtgaccggcgcctac。
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tgtgggccttgtggcctacatagccttcaagagg。
方法即可。本发明对所述细胞疫苗的使用方法没有特殊限定。
进行大量抽提和去除内毒素。
维持细胞浓度在1×10 ~1×10/ml,每2~3天离心去除旧培养基,按密度将细胞悬浮于新
鲜培养基。
K562细胞,分4个120μl电击管,也就是说1×10cells/管,各加10μg的PB‑S‑RBD‑NGFR质粒,
电转条件为:560V、30ms。随后取出细胞继续按原条件养。
K562‑S‑RBD‑NGFR(即跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞)。
细胞的阳性率应为50%以上。
Pierce RIPABuffer蛋白裂解液,旋涡振荡器上充分混匀后备用;
37℃放置30min进行静置;
2 K562‑对照 3.4
3 K562‑S‑RBD‑NGFR‑变性 4.1
4 1×Lane Marker Loading Buffer 5.0
5 K562‑S‑RBD‑NGFR‑非变性 4.3
6 S1‑RBD蛋白(40ng) 10.0
11min),进行转印;
K562‑S‑RBD‑NGFR 6.150
NGFR存在三聚体。
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cacccaggagcctgaggcacctccagaacaagacctcatagccagcacggtggcaggtgtggtgaccacagtgatg
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tggttgtgggccttgtggcctacatagccttcaagaggctcgaggagggcagaggaagtcttctaacatgcggtga
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列如下:
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atgacctgtgcttcaccaatgtgtatgctgacagctttgtgatcagaggggatgaggtgagacagattgcccctgg
gcagactggcaagattgctgactacaactacaagctgcctgatgacttcactggctgtgtgattgcctggaacagc
aacaacctggacagcaaggtggggggcaactacaactacctctatagactgttcagaaagagcaacctgaagccct
ttgagagagacatcagcacagagatctaccaagctggcagcaccccctgcaatggggtggagggcttcaactgcta
cttccccctgcagagctatggctttcagcccaccaatggggtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgagc
tttgagctgctgcatgcccctgccacagtgtgtggccccaagaagagcaccaacctggtgaagaacaagtgtgtga
actttgactacaaggatgatgatgacaagacgcgtaaggaggcatgccccacaggcctgtaca。
STAR Master Mix(宝生物)试剂说明书,按照下表配置PCR扩增体系。
Primer F 5μl
Primer R 5μl
Primer STAR Master Mix 50μl
ddH2O To 100μl
心1min,弃掉下层废液;
骤如下:
气泡;
24h后,于生物安全柜中取出1*10K562(野生型)、NGFR‑K562、RBD‑NGFR‑K562细胞,400*g离
心5min,弃上清;用1ml PBS溶液洗一次,400*g离心5min,弃上清;
离心5min,弃上清;用1ml PBS溶液洗一次,400*g离心5min,弃上清;
FSC 82
SSC 257
PE 353
基本没有改变。
NGFR 2383ng/μl 2.38
RBD‑NGFR 3144ng/μl 2.44
24h后的K562NGFR的表达率为97.6%。
RBD‑NGFR 97.6%
NGFR 99.6%
的K562 RBD的表达率为59.7%。
K562 5.04%
NGFR 5.46%
RBD‑NGFR 59.7%
cgt。
gcggagagggcttcctcctccaagtcttggatcacctttgacctgaagaacaaggaagtgtctgtaaaacgggtta
cccaggaccctaagctccagatgggcaagaagctcccgctccacctcaccctgccccaggccttgcctcagtatgc
tggctctggaaacctcaccctggcccttgaagcgaaaacaggaaagttgcatcaggaagtgaacctggtggtgatg
agagccactcagctccagaaaaatttgacctgtgaggtgtggggacccacctcccctaagctgatgctgagcttga
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gcagtgtctgctgagtgactcgggacaggtcctgctggaatccaacatcaaggttctgcccacatggtcgaccccg
gtgcagccaatggccctgattgtgctggggggcgtcgccggcctcctgcttttcattgggctaggcatcttcttct
gtgtcaggtgccggcac。
ttcacctacgagcagctggacgtcctaaagcataaactggatgagctctacccacaaggttaccccgagtctgtga
tccagcacctgggctacctcttcctcaagatgagccctgaggacattcgcaagtggaatgtgacgtccctggagac
cctgaaggctttgcttgaagtcaacaaagggcacgaaatgagtcctcaggtggccaccctgatcgaccgctttgtg
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gccccgaggagctgagctccgtgccccccagcagcatctgggcggtcaggccccaggacctggacacgtgtgaccc
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cgtggagggcctgaaggcggaggagcggcaccgcccggtgcgggactggatcctacggcagcggcaggacgacctg
gacacgctggggctggggctacagggcggcatccccaacggctacctggtcctagacctcagcatgcaagaggccc
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tgcaccgagtgcgtggggctccagagcatgtcggcgccgtgcgtggaggccgacgacgccgtgtgccgctgcgcct
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ttgtgggccttgtggcctacatagccttcaagagg。
RBD‑MSLN四种质粒,电转条件为:1×10cells/管、120μl电击管、560V、30ms。
K562‑S‑RBD‑CD4、K562‑S‑RBD‑MSLN四种细胞膜上S‑RBD的表达量。
药筛一周后K562‑S‑RBD‑NGFR细胞S‑RBD表达量高达98.4%,远远超过嘌呤霉素的跨膜表达
量。
和K562‑PZX‑K‑S‑Hygro五种细胞各取1×10,然后用1ml的PBS重悬细胞。
毒穿梭质粒(序列如SEQ ID No.20所示)与慢病毒包装辅助质粒(如SBI公司的pPACK
Packaging System,参考其说明书进行转染)后待细胞表达慢病毒并分泌于细胞培养上清
中。浓缩收获的病毒上清,沉淀获得高滴度病毒后感染K562细胞,经过含有潮霉素的抗性培
养基筛选高表达细胞,构建得到K562‑PZX‑K‑S‑Hygro细胞。
tacgatcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaattgccgcattgca
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cagacatccaatttcagggtgcagccaaccgagtctatcgtgcgctttcctaatatcacaaacctgtgcccatttg
gcgaggtgttcaacgcaacccgcttcgccagcgtgtacgcctggaataggaagcggatcagcaactgcgtggccga
ctatagcgtgctgtacaactccgcctctttcagcacctttaagtgctatggcgtgtcccccacaaagctgaatgac
ctgtgctttaccaacgtctacgccgattctttcgtgatcaggggcgacgaggtgcgccagatcgcccccggccaga
caggcaagatcgcagactacaattataagctgccagacgatttcaccggctgcgtgatcgcctggaacagcaacaa
tctggattccaaagtgggcggcaactacaattatctgtaccggctgtttagaaagagcaatctgaagcccttcgag
agggacatctctacagaaatctaccaggccggcagcaccccttgcaatggcgtggagggctttaactgttatttcc
cactccagtcctacggcttccagcccacaaacggcgtgggctatcagccttaccgcgtggtggtgctgagctttga
gctgctgcacgccccagcaacagtgtgcggccccaagaagtccaccaatctggtgaagaacaagtgcgtgaacttc
aacttcaacggcctgaccggcacaggcgtgctgaccgagtccaacaagaagttcctgccatttcagcagttcggca
gggacatcgcagataccacagacgccgtgcgcgacccacagaccctggagatcctggacatcacaccctgctcttt
cggcggcgtgagcgtgatcacacccggcaccaatacaagcaaccaggtggccgtgctgtatcaggacgtgaattgt
accgaggtgcccgtggctatccacgccgatcagctgaccccaacatggcgggtgtacagcaccggctccaacgtct
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cggcatctgtgcctcttaccagacccagacaaactctcccagaagagcccggagcgtggcctcccagtctatcatc
gcctataccatgtccctgggcgccgagaacagcgtggcctactctaacaatagcatcgccatcccaaccaacttca
caatctctgtgaccacagagatcctgcccgtgtccatgaccaagacatctgtggactgcacaatgtatatctgtgg
cgattctaccgagtgcagcaacctgctgctccagtacggcagcttttgtacccagctgaatagagccctgacaggc
atcgccgtggagcaggataagaacacacaggaggtgttcgcccaggtgaagcaaatctacaagaccccccctatca
aggactttggcggcttcaatttttcccagatcctgcctgatccatccaagccttctaagcggagctttatcgagga
cctgctgttcaacaaggtgaccctggccgatgccggcttcatcaagcagtatggcgattgcctgggcgacatcgca
gccagggacctgatctgcgcccagaagtttaatggcctgaccgtgctgccacccctgctgacagatgagatgatcg
cacagtacacaagcgccctgctggccggcaccatcacatccggatggaccttcggcgcaggagccgccctccagat
cccctttgccatgcagatggcctataggttcaacggcatcggcgtgacccagaatgtgctgtacgagaaccagaag
ctgatcgccaatcagtttaactccgccatcggcaagatccaggacagcctgtcctctacagccagcgccctgggca
agctccaggatgtggtgaatcagaacgcccaggccctgaataccctggtgaagcagctgagcagcaacttcggcgc
catctctagcgtgctgaatgacatcctgagccggctggacaaggtggaggcagaggtgcagatcgaccggctgatc
accggccggctccagagcctccagacctatgtgacacagcagctgatcagggccgccgagatcagggccagcgcca
atctggcagcaaccaagatgtccgagtgcgtgctgggccagtctaagagagtggacttttgtggcaagggctatca
cctgatgtccttccctcagtctgccccacacggcgtggtgtttctgcacgtgacctacgtgcccgcccaggagaag
aacttcaccacagcccctgccatctgccacgatggcaaggcccactttccaagggagggcgtgttcgtgtccaacg
gcacccactggtttgtgacacagcgcaatttctacgagccccagatcatcaccacagacaacaccttcgtgagcgg
caactgtgacgtggtcatcggcatcgtgaacaataccgtgtatgatccactccagcccgagctggacagctttaag
gaggagctggataagtatttcaagaatcacacctcccctgacgtggatctgggcgacatcagcggcatcaatgcct
ccgtggtgaacatccagaaggagatcgaccgcctgaacgaggtggctaagaatctgaacgagagcctgatcgacct
ccaggagctgggcaagtatgagcagtacatcaagtggccctggtacatctggctgggcttcatcgccggcctgatc
gccatcgtgatggtgaccatcatgctgtgctgtatgacatcctgctgttcttgcctgaagggctgctgtagctgtg
gctcctgctgtaagtttgacgaggatgactctgaacctgtgctgaagggcgtgaagctgcattacaccggatccat
ggaaggtagaggttctctcctcacttgtggtgatgttgaagaaaaccctggtccaatgtctagaaaaaagcctgaa
ctcaccgcgacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcgacagcgtctccgacctgatgcagctctcggagg
gcgaagaatctcgtgctttcagcttcgatgtaggagggcgtggatatgtcctgcgggtaaatagctgcgccgatgg
tttctacaaagatcgttatgtttatcggcactttgcatcggccgcgctcccgattccggaagtgcttgacattggg
gaattcagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaaccg
aactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgg
gttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacatggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccc
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7
支只小鼠注射2×10cells。
检测。
度分别为1:906,1:3218和1:165),在血清稀释比例为1:10000的条件下依然可以在K562‑S‑
RBD‑NGFR组的个别小鼠体内检测到S‑RBD抗体,并且其表达量最高。
视为本发明的保护范围。