马尔尼菲篮状菌病诊断的特征物及其筛选方法和应用转让专利
申请号 : CN202010952586.7
文献号 : CN112255354B
文献日 : 2021-09-10
发明人 : 叶枫 , 张志娟 , 李征途 , 李雪 , 王彤 , 严秀英 , 周振 , 高伟
申请人 : 广州医科大学附属第一医院 , 暨南大学 , 广州呼吸健康研究院
摘要 :
权利要求 :
1.检测马尔尼菲篮状菌病诊断特征物的试剂在制备马尔尼菲篮状菌病诊断试剂盒中的应用;
所述马尔尼菲篮状菌病诊断特征物包括甲醛、乙醛、2,5‑二甲基苯甲醛和环己酮中的一种或几种;
所述马尔尼菲篮状菌病诊断特征物的筛选方法,包括以下步骤:
1)分别采集马尔尼菲篮状菌病患者和健康人的呼出气体,分别采用2,4‑二硝基苯肼衍生小柱对所述呼出气体进行富集、洗脱,得到患病富集样品和健康富集样品,采用超高液相色谱‑质谱联用分析所述患病富集样品和健康富集样品中含氧挥发性有机物的种类及含量,得到患病文库和健康文库;
2)采用主成分分析和正交偏最小二乘法模型分析所述患病文库和健康文库,通过变量投影重要性值筛选对患病文库和健康文库之间含氧挥发性有机物差异贡献较大的含氧挥发性有机物,其中变量投影重要性值>1.5的含氧挥发性有机物为马尔尼菲篮状菌病诊断特征物。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤1)中采集马尔尼菲篮状菌病患者和健康人的呼出气体的装置包括连接有吹嘴的Tedlar采样袋。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,步骤1)中所述富集采用的装置包括以下顺次连通的组件:脱臭氧小柱、2,4‑二硝基苯肼衍生小柱和空气采样泵;所述Tedlar采样袋的出口与脱臭氧小柱的入口连通。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤1)中,样品泵入所述2,4‑二硝基苯肼衍生小柱内的流速为100mL/min。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤1)中所述超高液相色谱‑质谱联用分析中超高液相色谱的条件包括:使用超高效液相色谱系统;
色谱柱为C18柱,规格为:100mm×2.1mm,1.7μm particle size;
所述C18柱达到平衡的温度为30℃;
流动相A为乙腈,流动相B为体积百分含量为0.01%的甲酸水溶液,流速为0.4mL/min;
梯度淋洗程序:洗脱液B从体积百分含量为50%开始5min内升至70%,再2min升至
100%,平衡3min后0.2min内降至50%,平衡时间为3.8min,总运行时间为14min;
进样量为2μL。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤1)中所述超高液相色谱‑质谱联用分析的质谱条件包括:
毛细管电压为3.0kV;
萃取器电压为2V;
源温度为120℃;
脱溶剂温度为350℃;
氮气流速为80L/h、脱氮气体流量为600L/h;
在碰撞单元中,以氩气作为碰撞气体,碰撞诱导离解的压力为4~103mbar。
说明书 :
马尔尼菲篮状菌病诊断的特征物及其筛选方法和应用
技术领域
背景技术
疫缺陷或免疫功能抑制者。近年来伴随着人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者的增加,以及免疫
抑制宿主的增多,马尔尼菲篮状菌病的发病率也逐年增长。马尔尼菲篮状菌病是可治疗的,
但发病隐匿,早期不易察觉,极易误诊而延误治疗,导致死亡率高达80%。目前,马尔尼菲篮
状菌病的诊断仍依靠传统的真菌培养和形态学鉴定,不能满足高效的大规模疾病普查。因
此需要开发一种简单、高效、无损的早期诊断技术‑呼气诊断。
发明内容
液相色谱‑质谱联用分析所述患病富集样品和健康富集样品中含氧挥发性有机物的种类及
含量,得到患病文库和健康文库;
氧挥发性有机物,其中变量投影重要性值>1.5的含氧挥发性有机物为马尔尼菲篮状菌病诊
断特征物。
通。
尼菲篮状菌病诊断特征物进行检测,能够准确诊断患者患马尔尼菲篮状菌病的情况,实现
马尔尼菲篮状菌病的早期诊断。本发明的马尔尼菲篮状菌病诊断特征物能够简单、高灵敏
度并且无损的用于马尔尼菲篮状菌病患者诊断。
附图说明
C11,2,5‑二甲基苯甲醛;C12,癸醛;C13,丙烯醛;C14,邻甲基苯甲醛;C15,异戊醛;C17,辛
醛;C17,丁酮;C18,丙酮;C19,对甲基苯甲醛。
具体实施方式
液相色谱‑质谱联用分析所述患病富集样品和健康富集样品中含氧挥发性有机物的种类及
含量,得到患病文库和健康文库;
氧挥发性有机物,其中变量投影重要性值>1.5的含氧挥发性有机物为马尔尼菲篮状菌病诊
断特征物。
超高液相色谱‑质谱联用分析所述患病富集样品和健康富集样品中含氧挥发性有机物的种
类及含量,得到患病文库和健康文库。
组件:脱臭氧小柱、2,4‑二硝基苯肼(DNPH)衍生小柱和空气采样泵。本发明具体实施过程
中,所述2,4‑二硝基苯肼衍生小柱购自于天津博纳艾杰尔科技有限公司;所述脱臭氧小柱
优选为购自于上海安谱实验科技股份有限公司的SEP‑PAK脱臭氧小柱;在本发明的一个实
施例中,为了防止的管穿透现象,优选采用两根DNPH衍生小柱串联。在本发明中,所述
Tedlar采样袋依次和脱臭氧小柱、2,4‑二硝基苯肼衍生小柱、空气采样泵连接;样品泵入
DNPH衍生小柱内的流速优选为100mL/min。所述DNPH衍生小柱的作用是对Tedlar采样袋内
的呼出气样品进行富集稳定;所述脱臭氧小柱的作用是脱除呼气中臭氧,以避免DNPH衍生
物被臭氧分解。
乙腈的用量优选为5mL/DNPH小柱;所述洗脱液的流向与采样时气流方向相反。本发明优选
用0.22μm滤膜对淋洗液过滤、浓缩,得到浓缩液,即为进样样品;所述浓缩的方式优选为使
用氮吹仪以20mL/min的高纯氮气流速将5mL淋洗液浓缩至1mL;所述浓缩液存放于优选的
1.5mL棕色进样瓶中;所述存放的温度优选为‑20℃,30天内进行UPLC‑MS分析。
达到平衡的温度为30℃,流动相A为乙腈,流动相B为体积百分含量为0.01%的甲酸水溶液,
流速为0.4mL/min;
μL。
四级杆轨道肼傅里叶转换高分辨质谱仪;采用电喷雾源以负模式运行;ESI参数为:毛细管
电压为3.0kV、萃取器电压为2v、源温度为120℃、脱溶剂温度为350℃、氮气流速为80L/h、脱
氮气体流量为600L/h;在碰撞单元中,以氩气作为碰撞气体,碰撞诱导离解的压力优选为为
4~103mbar。
和健康文库。
醛、异戊醛、对甲基苯甲醛、间甲基苯甲醛、邻甲基苯甲醛、2,5‑二甲基苯甲醛、庚醛、辛醛、
壬醛和癸醛。混合标准试剂中各成分的质量浓度分别优选为15μg/mL;所述混合标准试剂的
溶剂优选为乙腈,配置质量浓度分别为0.006、0.024、0.12、0.6、1、3、5μg/mL的混合OVOCs‑
2,4‑二硝基苯腙标准溶液系列;OVOCs与2,4‑二硝基苯肼反应生成2,4‑二硝基苯腙,按色谱
条件进行测定,以OVOCs‑2,4‑二硝基苯腙的色谱峰面积为横坐标,与OVOCs‑2,4‑二硝基苯
2
腙相对应OVOCs的质量浓度为纵坐标,绘制标准曲线,并计算线性相关系数R。
吹入苏玛罐或采样气袋,由采样者把控开关,停止吹气后患者可示意采样者关闭苏玛罐/气
袋开关,然后患者可将一次性吹嘴从口中拿出。每个样品采集三个平行样,同时采集室内环
境样;所述马尔尼菲篮状菌病患者的数量优选为3名;所述健康人的数量优选为4名;每名马
尔尼菲篮状菌病患者或者健康人在治疗前进行两次连续取样,每次取样持续的时间为3d;
取样的频率优选为1次/天;两次连续取样的间隔时间优选为4d。
间含氧挥发性有机物差异贡献较大的含氧挥发性有机物,其中变量投影重要性值>1.5的含
氧挥发性有机物为马尔尼菲篮状菌病诊断特征物。
OPLS‑DA模型的变量投影重要性值(VIP)判别分析马尔尼菲篮状菌病患者与健康对照组之
间含氧挥发性有机物的对其差异的贡献大小,变量投影重要性值>1.5的含氧挥发性有机物
为马尔尼菲篮状菌病诊断特征物。
对马尔尼菲篮状菌病患者和健康对照组进行赋值,患病为1,未患病为0,判别模型的灵敏度
和特异性。后进行受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve,
ROC)分析,评估特征性OVOCs筛查的准确性。
发生感染。
施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属
于本发明保护的范围。
析,共得到19种OVOCs的浓度特征,如图1所示。
析。采用经过清洗后的Tedlar采样袋(1L)采集马尔尼菲篮状菌病者呼气样品,采用商业化
的DNPH(2,4‑二硝基苯肼)衍生小柱对采集在气袋内的呼气样品进行现场富集。衍生实验采
用了两根DNPH小柱串联。采样时应在DNPH吸附管前串联一只SEP‑PAK脱臭氧小柱,以脱除呼
气中臭氧,前端连接气体样品,后端连接空气采样泵,采样流速为100mL/min。采集后的小柱
密封存放于4℃恒温箱内运回实验室24h内洗脱,洗脱实验采用5mL乙腈淋洗,洗脱液的流向
应与采样时气流方向相反,并用0.22μm滤膜对洗脱液过滤,并使用氮吹仪以20mL/min的高
纯氮气流速将淋洗液浓缩至1mL,然后将样品存放于1.5mL棕色进样瓶中‑20℃冷冻保存,30
天内进行UPLC‑MS分析。
停止吹气后患者可示意采样者关闭苏玛罐/气袋开关,然后患者可将一次性吹嘴从口中拿
出。每个样品采集三个平行样,同时采集室内环境样。共采集两名马尔尼菲篮状菌病患者呼
气样品,每名患者在治疗前连续同一时间采集三天,即周一至周三,每天采集一次,然后再
于次周周三采集,重复两次采样。并采集护士及健康学生志愿者呼气作为对照组。
3;5μg/mL的混合OVOCs‑2,4‑二硝基苯腙标准溶液系列;按色谱条件进行测定,以OVOCs‑2,
4‑二硝基苯腙的色谱峰面积为横坐标,与OVOCs‑2,4‑二硝基苯腙相对应OVOCs的质量浓度
2
为纵坐标,绘制标准曲线,并计算线性相关系数R ,如表1所示。从表中可以看出,各标准物
质的检测限均较低,在1~100ppt范围内,满足本实施例测试需求。
洗脱液B从50%开始5min内升至70%,再2min升至100%,平衡3min后0.2min内降至50%,平
衡时间为3.8min,总运行时间为14min。进样量为2μL。
为:毛细管电压3.0kV、萃取器电压2v、源温度120℃、脱溶剂温度350℃、氮气流速80L/h、脱
氮气体流量600L/h。在碰撞单元中,以氩气作为碰撞气体,在4~103mbar的压力下进行碰撞
诱导离解。
醛含量也相对较高。
对照组的OVOCs浓度特征图,如图3所示。从图中可以看出,对照组中浓度较高的OVOCs含有
丙酮,壬醛,环己酮,苯甲醛,辛醛和庚醛。此外,也含有一定量的庚醛和丙醛。
人还是对照组,其呼出气中都含有大量的丙酮。其次,对照组中还含有大量的壬醛。
OVOCs很好的区分开。
法(OPLS‑DA)模型得到的变量投影重要性值(VIP值)图,其中,C1,甲醛;C2,乙醛;C3,丙醛;
C4,丁醛;C5,戊醛;C6,庚醛;C7,辛醛;C8,壬醛;C9,环己酮;C10,苯甲醛;C11,2,5‑二甲基苯
甲醛;C12,癸醛;C13,丙烯醛;C14,邻甲基苯甲醛;C15,异戊醛;C17,辛醛;C17,丁酮;C18,丙
酮;C19,对甲基苯甲醛。VIP值越大,表明该物质对模型区分肺癌患者和健康对照组的贡献
越大。从图6中可以看出,其中权重值大于1.5的物质有甲醛,乙醛,2,5‑二甲基苯甲醛和环
己酮。这也与之前对马尔尼菲篮状菌患者呼出气中OVOCs质量浓度占比分析相吻合,本实施
例认为马尔尼菲篮状菌患者呼出气中的OVOCs特征物为甲醛,乙醛,2,5‑二甲基苯甲醛和环
己酮。
视为本发明的保护范围。