一种检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的试剂盒及其制备方法

摘要

本发明提供一种同时检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的试剂盒及其制备方法，属于试剂盒领域。该试剂盒包括实时检测自吸阀分隔式芯片；所述的实时检测自吸阀分隔式芯片包括：自吸阀分隔式芯片、单核细胞增多性李斯特菌的FAM染料修饰特异性适配体、副溶血性弧菌的FAM染料修饰特异性适配体、鼠伤寒沙门菌的FAM染料修饰特异性适配体、空白对照FAM染料修饰适配体、HNB染料和氧化石墨烯。本发明对单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的最低检测浓度分别为46.8、22.9和32.3CFU/mL，加标回收率达到97.11～10.40％，灵敏度高，稳定性好。

权利要求

1.一种检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括实时检测自吸阀分隔式芯片；

所述的实时检测自吸阀分隔式芯片包括：自吸阀分隔式芯片、单核细胞增多性李斯特菌的FAM染料修饰特异性适配体、副溶血性弧菌的FAM染料修饰特异性适配体、鼠伤寒沙门菌的FAM染料修饰特异性适配体、空白对照FAM染料修饰适配体、HNB染料和氧化石墨烯。

2.根据权利要求1所述的一种检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：步骤一：自吸阀分隔式芯片的制备

1)模具的制备

使用CorelDRAW X8设计自吸阀区隔式芯片的通道和腔室图案，然后将其印刷到一块透明膜上作为掩模，使用旋涂机，将负性光刻胶涂布于硅晶片上，共计涂布两层，随后将硅晶片放在掩模下方的单面光刻机上，调整掩模的位置，以使图案位于晶片的中间，曝光后对硅晶片进行烘烤，最后，用显影剂冲洗处理过的硅晶片，直至模具图形完全出现为止，再次对模具进行烘烤，得到模具；

2)自吸阀区隔式芯片的制作

使用三甲基氯硅烷处理模具，将聚二甲基硅氧烷组分预固剂A和交联剂B混合去除气泡，倒入模具中，将螺栓和螺母拧到一端齐平，然后将齐平端向下放置在模具的阀门位置，经加热板烘烤固化后，将聚二甲基硅氧烷从模具表面揭除，使用打孔器对加样孔进行打孔，最后，对聚二甲基硅氧烷的通道面及玻璃片的表面同时使用等离子体处理，将被处理的平面相互贴合后烘烤固化形成自吸阀区隔式芯片；

步骤二：氧化石墨烯的制备

将石墨粉加入H2SO4和硝酸钠的混合物中，于冰浴中搅拌，剧烈搅拌下，将高锰酸钾缓慢加入上述混合物，继续在30～40℃搅拌，然后加热至140～150℃搅拌，加入去离子水终止反应体系，在冰浴中用氢氧化钠中和H2SO4，将PH调至5.5～6，得到的浅黄色溶液经过离子过滤膜过滤去除大颗粒，然后在透析袋中透析2‑3天去除盐分，得到氧化石墨烯；

步骤三：实时检测自吸阀区隔式芯片的制备

将阀门关闭，使用透明胶带覆盖芯片顶部，置于真空泵中进行脱气处理，将步骤二得到氧化石墨烯分别与单核细胞增多性李斯特菌的FAM染料修饰特异性适配体、副溶血性弧菌的FAM染料修饰特异性适配体、鼠伤寒沙门菌的FAM染料修饰特异性适配体或空白对照FAM染料修饰适配体和HNB混合，分别通过四个底物进样孔在负压条件下使混合物均匀分布到样品孔中，将上述芯片顶部的胶带揭除，置于65℃加热板上干燥，待底物完全干燥后将芯片取下，打开阀门，于芯片顶部用胶带重新贴附，并置于真空泵中抽真空，获得实时检测自吸阀区隔式芯片。

3.根据权利要求2所述的一种检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤一中硅晶片烘烤条件是60～70℃烘烤1～3min，随后是85～95℃下烘烤10min。

4.根据权利要求2所述的一种检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤一中三甲基氯硅烷处理时间是10～

20min。

5.根据权利要求2所述的一种检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤一中聚二甲基硅氧烷组分预固剂A和交联剂B的质量比10：1。

6.根据权利要求2所述的一种检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤一中混合聚二甲基硅氧烷组分去除气泡的条件是1500～2000rpm旋转1～2min。

7.根据权利要求2所述的一种检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤一中烘烤固化的温度是70～90℃，时间是30～40min。

8.根据权利要求2所述的一种检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤二制备得到的氧化石墨烯尺寸为550～

600nm。

9.根据权利要求2所述的一种检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤三中脱气处理时间为40～50min。

10.根据权利要求2所述的一种检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤三中氧化石墨烯浓度为0.4～0.5mg·‑1mL ，四种FAM修饰的特异性适配体浓度均为1～1.2μM，HNB的浓度为0.16～0.25μM。

说明书

一种检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒

沙门菌的试剂盒及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于试剂盒领域，具体涉及一种检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的试剂盒及其制备方法。

背景技术

[0002] 随着经济的发展及人民生活水平的提高，人口增长速度不断加快，造成了流动人口的增加和饮食习惯的变化，随之带来的是消费者对新鲜和低加工食品的需求提高，加之食源性病原菌对环境的高度适应性，使得食源性病原菌一直是各国的主要公共卫生问题之一，每年都造成巨大的经济损失。对美国的一项调查数据的评估显示，每年约有940万人感染食源性疾病，其中三分之一以上是由食源性病原菌感染引起。以单核细胞增多性李斯特菌为例，该病原菌可引起肠胃炎和发烧等症状，但因为常规粪便培养无法检测到该病原菌，使得有时临床诊断不会将这种病原菌感染作为诊断结果，从而导致延误病情，与之相关的早期自然流产或流产也可能被忽略。因此，建立快速有效的食源性病原菌检测方法至关重要。

[0003] 传统的分离鉴定方法简单、稳定，但长达一周的检测时间使得其无法满足快速检测的需要。此外比较常用的的免疫学方法则通常利用抗原和抗体结合，辅以不同的技术以检测不同的靶标物质，例如酶联免疫法，免疫荧光法，免疫胶体金法等。但抗体的制备通常需要很长时间，使用前需要对其效价进行表征，对于其在长期储存状态下的活性维持也是需要考虑的问题。与之相比，适配体的优点自然体现，不仅易于合成，其在低成本和高稳定性方面表现出的性能也同样优异，并且在特异性方面可与抗体媲美的属性使得它们在近年来的实际应用中被广泛使用。

[0004] 与此同时，PDMS材料凭借其良好的透光率，低成本，光学透明性，出色的可塑性和弹性以及从模具中获得的高保真度等优势被广泛认知和应用，例如微流控芯片与成熟的PCR技术的结合在扩增速度，检测限，样品需求和检测精度等方面显示出许多出色的性能。因此，如何紧跟研究趋势借助现有高优势材料实现对目标病原菌的检测，又能简化操作，在短时间内获得精准的检测结果就成为我们下一步检测技术的目标，对于传染源及病患的确定也显得至关重要。

发明内容

[0005] 本发明目的是提供一种检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的试剂盒及其制备方法，该试剂盒基于目标菌与其FAM修饰的特异性适配体结合恢复荧光，结合HNB荧光染料实现荧光信号双重检测，能够快速、灵敏、简便地检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌。

[0006] 本发明首先提供一种检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的试剂盒，该试剂盒包括实时检测自吸阀分隔式芯片；

[0007] 所述的实时检测自吸阀分隔式芯片包括：自吸阀分隔式芯片、单核细胞增多性李斯特菌的FAM染料修饰特异性适配体、副溶血性弧菌的FAM染料修饰特异性适配体、鼠伤寒沙门菌的FAM染料修饰特异性适配体、空白对照FAM染料修饰适配体、HNB染料和氧化石墨烯。

[0008] 本发明还提供一种检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的试剂盒的制备方法，包括：

[0009] 步骤一：自吸阀分隔式芯片的制备

[0010] 1)模具的制备

[0011] 使用CorelDRAW X8设计自吸阀区隔式芯片的通道和腔室图案，然后将其印刷到一块透明膜上作为掩模，使用旋涂机，将负性光刻胶涂布于硅晶片上，共计涂布两层，随后将硅晶片放在掩模下方的单面光刻机上，调整掩模的位置，以使图案位于晶片的中间，曝光后对硅晶片进行烘烤，最后，用显影剂冲洗处理过的硅晶片，直至模具图形完全出现为止，再次对模具进行烘烤，得到模具；

[0012] 2)自吸阀区隔式芯片的制作

[0013] 使用三甲基氯硅烷处理模具，将聚二甲基硅氧烷组分预固剂A和交联剂B混合去除气泡，倒入模具中，将螺栓和螺母拧到一端齐平，然后将齐平端向下放置在模具的阀门位置，经加热板烘烤固化后，将聚二甲基硅氧烷从模具表面揭除，使用打孔器对加样孔进行打孔，最后，对聚二甲基硅氧烷的通道面及玻璃片的表面同时使用等离子体处理，将被处理的平面相互贴合后烘烤固化形成自吸阀区隔式芯片；

[0014] 步骤二：氧化石墨烯的制备

[0015] 将石墨粉加入H2SO4和硝酸钠的混合物中，于冰浴中搅拌，剧烈搅拌下，将高锰酸钾缓慢加入上述混合物，继续在30～40℃搅拌，然后加热至140～150℃搅拌，加入去离子水终止反应体系，在冰浴中用氢氧化钠中和H2SO4，将PH调至5.5～6，得到的浅黄色溶液经过离子过滤膜过滤去除大颗粒，然后在透析袋中透析2‑3天去除盐分，得到氧化石墨烯；

[0016] 步骤三：实时检测自吸阀区隔式芯片的制备

[0017] 将阀门关闭，使用透明胶带覆盖芯片顶部，置于真空泵中进行脱气处理，将步骤二得到氧化石墨烯分别与单核细胞增多性李斯特菌的FAM染料修饰特异性适配体、副溶血性弧菌的FAM染料修饰特异性适配体、鼠伤寒沙门菌的FAM染料修饰特异性适配体或空白对照FAM染料修饰适配体和HNB混合，分别通过四个底物进样孔在负压条件下使混合物均匀分布到样品孔中，将上述芯片顶部的胶带揭除，置于65℃加热板上干燥，待底物完全干燥后将芯片取下，打开阀门，于芯片顶部用胶带重新贴附，并置于真空泵中抽真空，获得实时检测自吸阀区隔式芯片。

[0018] 优选的是，所述步骤一中硅晶片烘烤条件是60～70℃烘烤1～3min，随后是85～95℃下烘烤10min。

[0019] 优选的是，所述步骤一中三甲基氯硅烷处理时间是10～20min。

[0020] 优选的是，所述步骤一中聚二甲基硅氧烷组分预固剂A和交联剂B的质量比10：1。

[0021] 优选的是，所述步骤一中混合聚二甲基硅氧烷组分去除气泡的条件是1500～2000rpm旋转1～2min。

[0022] 优选的是，所述步骤一中烘烤固化的温度是70～90℃，时间是30～40min。

[0023] 优选的是，所述步骤二制备得到的氧化石墨烯尺寸为550～600nm。

[0024] 优选的是，所述步骤三中脱气处理时间为40～50min。

[0025] 优选的是，所述步骤三中氧化石墨烯浓度为0.4～0.5mg·mL‑1，四种FAM修饰的特异性适配体浓度均为1～1.2μM，HNB的浓度为0.16～0.25μM。

[0026] 本发明的有益效果

[0027] 本发明提供一种检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的试剂盒及其制备方法，该试剂盒是先制备自吸阀分隔式芯片，将氧化石墨烯、FAM染料修饰的特异性适配体以及HNB染料混合，在负压条件下将上述混合物注入芯片的样本室内，待干燥后将待测液体于负压条件下注入芯片中，若有目标菌存在，则会与其对应检测区域的特异性适配体结合并远离氧化石墨烯表面，使FAM荧光恢复，呈现绿色荧光，若无目标菌存在，则FAM荧光淬灭，体系呈现红色荧光，以此实现阳性与阴性的区分，并可根据荧光强度的强弱对三种目标菌进行定量。该发明提出利用病原菌与FAM修饰特异性适配体特异性结合并引入HNB染料的方式，实现双重荧光信号区分阴性阳性，并可根据荧光强度对目标菌进行定量，缩短了检测时间,定量检测时变异系数小，对单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的最低检测浓度分别为46.8、22.9和32.3CFU/mL，加标回收率达到97.11～10.40％，灵敏度高，稳定性好。

附图说明

[0028] 图1为实施例5中单核细胞增多性李斯特菌检测标准曲线图。

[0029] 图2为实施例5中副溶血性弧菌检测标准曲线图。

[0030] 图3为实施例5中鼠伤寒沙门菌检测标准曲线图。

[0031] 图4为实施例5中单核细胞增多性李斯特菌特异性检测荧光图像。

[0032] 图5为实施例5中副溶血性弧菌特异性检测荧光图像。

[0033] 图6为实施例5中鼠伤寒沙门菌特异性检测荧光图像。

[0034] 图7为实施例6中单核细胞增多性李斯特菌检测标准曲线图。

[0035] 图8为实施例6中副溶血性弧菌检测标准曲线图。

[0036] 图9为实施例6中鼠伤寒沙门菌检测标准曲线图。

[0037] 图10为本发明实时检测自吸阀分隔式芯片检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌流程图。

具体实施方式

[0038] 本发明首先提供一种检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的试剂盒，该试剂盒包括实时检测自吸阀分隔式芯片；

[0039] 所述的实时检测自吸阀分隔式芯片包括：单核细胞增多性李斯特菌的FAM染料修饰特异性适配体、副溶血性弧菌的FAM染料修饰特异性适配体、鼠伤寒沙门菌的FAM染料修饰特异性适配体、空白对照FAM染料修饰适配体、HNB染料和氧化石墨烯。

[0040] 按照本发明，所述的单核细胞增多性李斯特菌的FAM染料修饰特异性适配体、副溶血性弧菌的FAM染料修饰特异性适配体、鼠伤寒沙门菌的FAM染料修饰特异性适配体、空白对照FAM染料修饰适配体均由上海生工生物公司合成；

[0041] 本发明的抗单核细胞增多性李斯特菌适配体序列为：5’‑6‑FAM‑TTTTTTTTTTATCCATGGGGCGGAGATGAGGGGGAGGAGGGCGGGTACCCGGTTGAT‑3’；

[0042] 本发明的抗副溶血性弧菌适配体序列为：5’‑6‑FAM‑ATAGG AGTCA CGACG ACCAG AATCT AAAAA TGGGC AAAGA AACAG TGACT CGTTG AGATA CTTAT GTGCG TCTAC CTCTT GACTA AT‑3’；

[0043] 本发明的抗鼠伤寒沙门菌适配体序列为：5’‑6‑FAM‑AAAAAAGGTTGATTTCCTGATCG‑3’；

[0044] 本发明的空白对照的FAM染料修饰适配体序列为：5’‑6‑FAM‑GGG CTG GCC AGA TCA GAC CCC GGA TGA TCA TCC TTG TGA GAA CCA‑3’。

[0045] 本发明还提供一种检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的试剂盒的制备方法，包括：

[0046] 步骤一：自吸阀分隔式芯片的制备

[0047] 1)模具的制备

[0048] 使用CorelDRAW X8设计自吸阀区隔式芯片的通道和腔室图案，然后将其印刷到一块透明膜上作为掩模，考虑到腔室的高度，优选于硅晶片上涂覆两层负性光刻胶，使用Spincoat G3P‑8旋涂机，将负性光刻胶涂布于干净的干燥硅晶片上，旋涂机的使用条件优选为2000～3000rpm，时间为30s‑1min，然后再次重复此步骤以形成第二层，随后将硅晶片放在掩模下方的“h49‑25c 4型”单面光刻机上，在曝光之前，调整掩模的位置，以使图案位于晶片的中间，以便后续的芯片制作，所述的曝光时间优选为25s～40s，将硅晶片优选在60～70℃烘烤1～3min，随后在85～95℃下烘烤10min，最后，用显影剂冲洗处理过的硅晶片，直至模具图形完全出现为止；所述的显影剂优选为SU‑8，为了使模具具有更佳的机械性能，优选在300℃下烘烤20‑40min，至此模具制备完成；

[0049] 2)自吸阀区隔式芯片的制作

[0050] 使用三甲基氯硅烷(MACKLIN，中国)处理模具，优选处理时间为10‑20min，以防聚二甲基硅氧烷粘附，然后将聚二甲基硅氧烷组分预固剂A和交联剂B混合，优选混合质量比为10：1，优选1500～2000rpm旋转1～2min去除混合时产生的气泡并倒入模具中，待芯片静止约1min后，除去聚二甲基硅氧烷中的气泡，将螺栓和螺母拧到一端齐平，然后将齐平端向下放置在模具的阀门位置，注意避免将气泡引入聚二甲基硅氧烷中，以免影响芯片性能，随后优选于70～90℃加热板上烘烤30～40min，待聚二甲基硅氧烷层完全固化后小心从模具上剥离，优选1.0/1.2mm打孔器对加样孔进行打孔；最后，对聚二甲基硅氧烷的通道面及玻璃片的表面同时使用等离子预处理，所述的等离子预处理的条件优选为200V处理1min，将被处理的平面相互贴合后优选90℃烘烤30min形成牢固稳定的芯片；随后使用透明胶带覆盖芯片顶部，获得自吸阀区隔式芯片。

[0051] 步骤二：氧化石墨烯的制备

[0052] 将石墨粉加入H2SO4和硝酸钠的混合物中，于冰浴中搅拌25～30min，剧烈搅拌下，将3.0～4.0g高锰酸钾缓慢加入上述混合物(将温度保持0℃，但是在10min内完成)，搅拌1.5～2h，继续在30～40℃搅拌1.5～2h，然后加热至140～150℃搅拌2～3h，加入去离子水终止反应体系，然后在冰浴中用氢氧化钠中和H2SO4，将PH调至5.5～6，得到的浅黄色溶液经过0.22μm的离子过滤膜过滤去除大颗粒，然后在透析袋(MWCO 1000da)中透析2～3天去除盐分，获得氧化石墨烯；所述石墨粉和硝酸钠质量比优选为1.0～1.5：40～46，H2SO4体积mL：
硝酸钠的质量g优选为80～100:40～46；所述制备得到的氧化石墨烯尺寸为550～600nm。

[0053] 步骤三：实时检测自吸阀区隔式芯片的制备

[0054] 将阀门关闭，使用透明胶带覆盖芯片顶部，置于真空泵中进行脱气处理，脱气时间优选40～50min，而后将步骤二得到氧化石墨烯分别与上述四种FAM修饰的适配体和HNB混‑1合，所述氧化石墨烯优选浓度优选为0.4～0.5mg·mL ，四种FAM修饰的特异性适配体浓度均为1～1.2μM，HNB的浓度为0.16～0.25μM，四种混合物的体积优选为6.5‑7μL，分别通过四个底物进样孔在负压条件下使混合物均匀分布到样品检测小室中，将上述芯片顶部的胶带揭除，置于65℃加热板上干燥，优选时间为2‑2.5h。待底物完全干燥后将芯片取下，打开阀门，于芯片顶部用胶带重新贴附，并置于真空泵中抽真空，优选抽真空时间为40min，获得实时检测自吸阀区隔式芯片。

[0055] 将上述试剂盒对单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌进行检测，具体步骤为：

[0056] 取一针头人为刺穿负压状态下的实时检测自吸阀区隔式芯片的进样口处的胶带，随之迅速注入待测样品26μL，使之在负压条件下迅速分布到实时检测自吸阀区隔式芯片的各检测小室中，10min后置于小动物成像仪中，455nm蓝光激发条件下采集荧光图像。

[0057] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，实施例中涉及到的原料均为商购获得

[0058] 实施例1自吸阀分隔式芯片的制备

[0059] 取模具用三甲基氯硅烷(MACKLIN，中国)处理10min以防聚二甲基硅氧烷粘附。然后将聚二甲基硅氧烷组分预固剂A和交联剂B(#RTV 615，美国Momentive，美国)以10：1的质量比例混合，去除气泡并倒入模具中。待芯片静止约1min后，除去倾倒时PDMS中产生的气泡。将螺栓和螺母拧到一端齐平，然后将齐平端向下放置在模具的阀门位置，注意避免将气泡引入聚二甲基硅氧烷中，以免影响芯片性能。随后置于加热板上于90℃烘烤30min，待聚二甲基硅氧烷层完全固化后小心从模具上剥离，使用1.2mm打孔器对加样孔进行打孔。最后，对聚二甲基硅氧烷的通道面及玻璃片的表面同时使用铭恒等离子清洗机(PDC－MG)进行等离子体预处理，将被处理的平面相互贴合后再次于90℃烘烤固化30min，获得自吸阀分隔式芯片。

[0060] 实施例2氧化石墨烯的制备

[0061] 将1.0g石墨粉加入100mL H2SO4和46g硝酸钠的混合物中，于冰浴中搅拌30min。剧烈搅拌下，将3.0g高锰酸钾缓慢加入上述混合物(将温度保持0℃，但是在10min内完成)搅拌2h。继续在40℃搅拌2h，然后加热至150℃搅拌3h。加入200mL去离子水终止反应体系。然后在冰浴中用氢氧化钠中和H2SO4，将PH调至6。得到的浅黄色溶液经过0.22μm的离子过滤膜过滤去除大颗粒，然后在透析袋(MWCO 1000da)中透析3天去除盐分，获得氧化石墨烯。

[0062] 实施例3实时检测自吸阀区隔式芯片的制备

[0063] 将阀门关闭，使用透明胶带覆盖芯片顶部，置于真空泵中进行脱气处理40min。而后将0.4mg/mL氧化石墨烯分别与1μM上述四种FAM修饰的适配体和0.25μM HNB混合，四种混合物的体积为7μL，分别通过四个底物进样孔在负压条件下使混合物均匀分布到样品检测小室中。将上述芯片顶部的胶带揭除，置于65℃加热板上干燥2h。待底物完全干燥后将芯片取下，打开阀门，于芯片顶部用胶带重新贴附，并置于真空泵中抽真空40min，获得实时检测自吸阀区隔式芯片。

[0064] 实施例4菌液标准品的制备

[0065] 取‑80℃保存菌种，进行菌株活化，将活化后的菌株在3％氯化钠胰蛋白脉琼脂平板上划线分纯，37℃培养18‑24h后，挑取单个菌落，接种3％氯化钠胰蛋白胨液体培养基，37℃振荡培养12‑18h。取1mL菌液10倍倍比稀释平板倾注法进行活菌计数。剩余的菌液用1％甲醛在室温下灭活10min，将灭活的菌液3000rpm离心3min，收集菌体，然后用PBS溶液充分9
混匀，制成菌悬液并用PBS溶液调节菌悬液浓度为10CFU/mL，存于4℃冰箱中备用。

[0066] 实施例5基于实时检测自吸阀区隔式芯片检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的方法

[0067] 检测流程如图10，取一针头人为刺穿负压状态下的实时检测自吸阀区隔式芯片的进样口处的胶带，随之迅速注入待测样品26μL，使之在负压条件下迅速分布到实时检测自吸阀区隔式芯片的各检测小室中，10min后置于小动物成像仪中，455nm蓝光激发条件下采集荧光图像及荧光信号。参考所作的标准曲线图1‑图3，分别确定样品中单核细胞增多性李7
斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的数量。定量检测该菌的浓度范围在10‑10CFU/mL。

[0068] 图1为实施例6中单核细胞增多性李斯特菌检测标准曲线图，其中横坐标为单核细7
胞增多性李斯特菌的浓度对数值，纵坐标为灰度值。检测浓度范围：10‑10CFU/mL。

[0069] 图2为实施例6中副溶血性弧菌检测标准曲线图，其中横坐标为副溶血性弧菌的浓7
度对数值，纵坐标为灰度值。检测浓度范围：10‑10CFU/mL。

[0070] 图3为实施例6中鼠伤寒沙门菌检测标准曲线图，其中横坐标为鼠伤寒沙门菌的浓7
度对数值，纵坐标为灰度值。检测浓度范围：10‑10CFU/mL。

[0071] 本发明方法检测稳定，对单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的检测限分别为46.8、22.9和32.3CFU/mL，检测时间短，操作简单，检测效果好。对待测样品进行检测，特异性适配体对应检测的目标菌存在时才会呈绿色荧光的阳性反应，其余均为阴性，(注：绿色表示对应区域病原菌阳性，红色表示对应区域病原菌阴性。)该方法特异性强，未见假阳性和假阴性结果，结果如图4‑图6所示。

[0072] 实施例6模拟样品的检测

[0073] 制备猪肉模拟样品：取5g新鲜猪肉切成肉末，加入15mL无菌生理盐水于4℃浸泡过2 6
夜。第二天用0.22μm滤膜对滤出液进行抽滤，分别取5*10和5*10CFU/mL的单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌接种于上述浸出液中，用本发明检测方法对其进行检测。

[0074] 取一针头人为刺穿负压状态下的实时检测自吸阀区隔式芯片的进样口处的胶带，随之迅速注入待测猪肉样品28μL，使之在负压条件下迅速分布到实时检测自吸阀区隔式芯片的各检测小室中，10min后置于小动物成像仪中，455nm蓝光激发条件下采集荧光图像及荧光信号。

[0075] 参考所做的标准曲线图7‑图9，确定样品中单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧7
菌和鼠伤寒沙门菌的数量，定量检测细菌的浓度范围在10‑10CFU/mL。本发明方法检测稳定，加标回收率达97.11～10.40％。

[0076] 图7本发明实施例7中单核细胞增多性李斯特菌检测标准曲线图。横坐标为猪肉中7
单核细胞增多性李斯特菌的浓度对数值，纵坐标为灰度值。检测浓度范围：10‑10CFU/mL。

[0077] 图8本发明实施例7中副溶血性弧菌检测标准曲线图。横坐标为猪肉中副溶血性弧7
菌的浓度对数值，纵坐标为灰度值。检测浓度范围：10‑10CFU/mL。

[0078] 图9本发明实施例7中鼠伤寒沙门菌检测标准曲线图。横坐标为猪肉中鼠伤寒沙门7
菌的浓度对数值，纵坐标为灰度值。检测浓度范围：10‑10CFU/mL。