LncRNA-266在制备诱导棕色脂肪细胞分化药物中的应用转让专利
申请号 : CN201911124258.1
文献号 : CN112294835B
文献日 : 2021-09-17
发明人 : 孙诚 , 汤欣 , 马谨瑜 , 刘晓宇
申请人 : 南通大学
摘要 :
本发明涉及一种长链非编码RNA(LncRNA‑266)的医药用途，即LncRNA‑266在制备诱导棕色脂肪细胞分化药物中的应用，能够促进机体能量消耗、抵抗肥胖。本发明通过LncRNA‑266处理肥胖小鼠，结果表明LncRNA‑266可促进肥胖小鼠米色脂肪细胞向棕色脂肪细胞分化，消耗机体能量，从而抑制体重增长。本发明进一步发现，LncRNA‑266可降低肥胖小鼠血糖水平、提高胰岛素敏感性。
权利要求 :
1.LncRNA‑266 在制备诱导棕色脂肪细胞分化药物中的应用，LncRNA‑266的cDNA序列如 SEQ ID No：1所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述 LncRNA‑266诱导米色脂肪细胞向棕色脂肪细胞分化，进而促进机体能量代谢。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述 LncRNA‑266抑制体重增长。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述 LncRNA‑266降低机体血糖水平、提高胰岛素敏感性。
5.一种诱导棕色脂肪细胞分化药物，其特征在于包含 LncRNA‑266 或表达LncRNA‑266的载体，LncRNA‑266的cDNA序列如 SEQ ID No：1所示。
6.如权利要求 5 所述的药物，其特征在于所述载体选自质粒、表达框、病毒、细胞中的一种或几种。
说明书 :
LncRNA‑266在制备诱导棕色脂肪细胞分化药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于医药领域，具体涉及LncRNA‑266在制备诱导棕色脂肪细胞分化、促进机体能量代谢药物中的应用。
背景技术
[0002] 肥胖是机体能量代谢失调的一种生理状态，表现为多余能量以脂肪的形式在体内大量积累。肥胖严重威胁着人类健康，它会诱发多种代谢性疾病，如脂肪肝、2型糖尿病、心
血管疾病、特定类型的癌症等。机体的脂肪组织主要分为两类，即白色脂肪组织和棕色脂肪
组织。在能量代谢方面，白色脂肪细胞内含有大量甘油三酯，因此白色脂肪组织主要作为储
存机体能量的器官；与此相反，棕色脂肪细胞内含有大量线粒体，并高表达解偶联蛋白
UCP1，可通过解偶联作用将储存的能量转化成热能散发出去，因此BAT被认为是消耗能量的
器官。因此可以合理推测，若通过某种方法使人体BAT产热增加，无疑将可延缓体重增加，减
轻肥胖症的发展。
血管疾病、特定类型的癌症等。机体的脂肪组织主要分为两类，即白色脂肪组织和棕色脂肪
组织。在能量代谢方面，白色脂肪细胞内含有大量甘油三酯，因此白色脂肪组织主要作为储
存机体能量的器官；与此相反，棕色脂肪细胞内含有大量线粒体，并高表达解偶联蛋白
UCP1，可通过解偶联作用将储存的能量转化成热能散发出去，因此BAT被认为是消耗能量的
器官。因此可以合理推测，若通过某种方法使人体BAT产热增加，无疑将可延缓体重增加，减
轻肥胖症的发展。
[0003] 长链非编码RNA(long noncoding RNAs,LncRNAs)是指一类长度大于200bp，没有编码蛋白功能的RNA分子。早期认为这些LncRNAs只是基因转录的副产物，没有特定的生理
功能。但是，最近研究发现，很多LncRNAs具有非常重要的生理功能，其水平异常可导致发育
缺陷及多种疾病的发生与发展。
功能。但是，最近研究发现，很多LncRNAs具有非常重要的生理功能，其水平异常可导致发育
缺陷及多种疾病的发生与发展。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供长链非编码RNA(LncRNA‑266)的医药用途，具体技术方案如下：
[0005] LncRNA‑266在制备诱导棕色脂肪细胞分化药物中的应用，LncRNA‑266的cDNA序列如SEQ ID No：1所示。
[0006] LncRNA‑266能够诱导米色脂肪细胞向棕色脂肪细胞分化，进而促进机体能量代谢、抑制体重增长。
[0007] 进一步的，LncRNA‑266能够降低机体血糖水平、提高胰岛素敏感性。
[0008] 本发明另一目的在于提供一种诱导脂肪细胞分化药物，包含LncRNA‑266或表达LncRNA‑266的载体。
[0009] 所述载体选自质粒、表达框、病毒、细胞中的一种或几种。
[0010] 所述药物能够通过诱导米色脂肪细胞向棕色脂肪细胞分化，消耗机体能量，抑制机体体重增长。
[0011] 所述药物能够降低机体血糖水平、提高胰岛素敏感性。
[0012] 本发明研究了LncRNA‑266对米色脂肪棕色化的诱导作用。通过构建表达LncRNA‑266的腺病毒(Ad‑LncRNA‑266)，用所构建好的表达LncRNA的腺病毒转导前体脂肪细胞，然
后进行棕色脂肪细胞定向诱导，油红染色及qRT‑PCR结果表明LncRNA‑266可显著诱导前体
脂肪细胞向棕色脂肪细胞分化，并且棕色脂肪细胞特异性基因UCP1也呈高表达趋势。进一
步的，本发明构建了其干扰病毒(Ad‑LncRNA‑266shRNA)，用构建好的干扰病毒转导前体脂
肪细胞，结果发现下调LncRNA‑266的表达可抑制前体脂肪细胞向棕色脂肪细胞的分化，并
且UCP1基因表达也呈下降趋势，证实LncRNA‑266在诱导前体脂肪细胞向棕色脂肪细胞分化
过程中的促进作用。本发明在活体动物水平上，将表达LncRNA‑266的腺病毒(Ad‑LncRNA‑
266)直接注射于肥胖小鼠(Ⅱ型糖尿病模型小鼠)腹股沟米色脂肪组织。病毒注射3周后，发
现腹股沟米色脂肪组织向棕色脂肪组织转变，UCP1的表达也显著升高。另外，LncRNA‑266可
以显著降低Ⅱ型糖尿病模型小鼠血糖及血清胰岛素水平，显著提高肥胖小鼠的葡萄糖耐受
和胰岛素耐受能力，说明LncRNA‑266可提高Ⅱ型糖尿病模型小鼠体内葡萄糖清除能力，并
能提高其胰岛素敏感性。
后进行棕色脂肪细胞定向诱导，油红染色及qRT‑PCR结果表明LncRNA‑266可显著诱导前体
脂肪细胞向棕色脂肪细胞分化，并且棕色脂肪细胞特异性基因UCP1也呈高表达趋势。进一
步的，本发明构建了其干扰病毒(Ad‑LncRNA‑266shRNA)，用构建好的干扰病毒转导前体脂
肪细胞，结果发现下调LncRNA‑266的表达可抑制前体脂肪细胞向棕色脂肪细胞的分化，并
且UCP1基因表达也呈下降趋势，证实LncRNA‑266在诱导前体脂肪细胞向棕色脂肪细胞分化
过程中的促进作用。本发明在活体动物水平上，将表达LncRNA‑266的腺病毒(Ad‑LncRNA‑
266)直接注射于肥胖小鼠(Ⅱ型糖尿病模型小鼠)腹股沟米色脂肪组织。病毒注射3周后，发
现腹股沟米色脂肪组织向棕色脂肪组织转变，UCP1的表达也显著升高。另外，LncRNA‑266可
以显著降低Ⅱ型糖尿病模型小鼠血糖及血清胰岛素水平，显著提高肥胖小鼠的葡萄糖耐受
和胰岛素耐受能力，说明LncRNA‑266可提高Ⅱ型糖尿病模型小鼠体内葡萄糖清除能力，并
能提高其胰岛素敏感性。
附图说明
[0013] 图1为LncRNA‑266诱导前体脂肪细胞向棕色脂肪分化。图1A为脂肪细胞油红染色***
结果；图1B为定量PCR检测UCP1基因表达水平。 p<0.001，Student's t test分析。
结果；图1B为定量PCR检测UCP1基因表达水平。 p<0.001，Student's t test分析。
[0014] 图2为干扰LncRNA‑266表达抑制前体脂肪细胞向棕色脂肪细胞分化。图2A为脂肪**
细胞油红染色；图2B为定量PCR检测UCP1基因表达水平。p<0.01，Student's t test分析。
细胞油红染色；图2B为定量PCR检测UCP1基因表达水平。p<0.01，Student's t test分析。
[0015] 图3为LncRNA‑266对Ⅱ型糖尿病小鼠血糖水平的影响。**p<0.01，Student's t test分析。
[0016] 图4为LncRNA‑266对型糖尿病小鼠血清胰岛素水平的影响。*p<0.05，Student's t test分析。
[0017] 图5为LncRNA‑266对Ⅱ型糖尿病小鼠葡萄糖耐受能力的影响。**p<0.01，***p<0.001，Student's t test分析。
[0018] 图6为LncRNA‑266对Ⅱ型糖尿病小鼠胰岛素耐受能力的影响。*p<0.05，***p<0.001，Student's t test分析。
[0019] 图7为LncRNA‑266处理促进小鼠腹股沟米色脂肪组织向棕色脂肪组织转变。图7A***
为脂肪形态图；图7B为定量PCR检测UCP1基因表达水平。 p<0.001，Student's t test分
析。
为脂肪形态图；图7B为定量PCR检测UCP1基因表达水平。 p<0.001，Student's t test分
析。
具体实施方式
[0020] 以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
[0021] 在本发明中使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
[0022] 下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明，应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0023] 在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
[0024] 实施例1 LncRNA‑266过表达及干扰病毒构建
[0025] 过表达病毒制备：本研究中过表达病毒采用Invitrogen公司的Gateway系列试剂盒进行构建。首先用PCR扩增出LncRNA的完整序列，然后连入中间载体pENTR3C‑Entry
Vector后送往公司测序，测序正确的载体通过重组的方法(LR)连入到目标载体(pAd‑CMV‑
DEST Vector)中，测序检测正确后，将阳性质粒中抽，并经核酸内切酶Pac I单切后用
Invitrogen公司的Lipofectamine 2000脂质体转染293A细胞。一周左右观察病毒斑形成情
况，待绝大部分病毒斑出现后收集293A细胞并进行‑80℃和37℃的反复冻融使细胞破碎，离
心收集上清即获得第一代病毒，将第一代病毒继续感染293A细胞后同样方法获得第二代病
毒，第二代病毒进行病毒滴度检测后可保存于‑80℃低温冰箱用于后续实验。对照病毒为表
达LacZ的腺病毒(Ad‑LacZ)。构建该病毒的质粒为pAd/CMV/V5‑GW/LacZ由Invitrogen公司
提供，经Pac I单切后转染293A细胞，转染及病毒制备过程与上述相同。
Vector后送往公司测序，测序正确的载体通过重组的方法(LR)连入到目标载体(pAd‑CMV‑
DEST Vector)中，测序检测正确后，将阳性质粒中抽，并经核酸内切酶Pac I单切后用
Invitrogen公司的Lipofectamine 2000脂质体转染293A细胞。一周左右观察病毒斑形成情
况，待绝大部分病毒斑出现后收集293A细胞并进行‑80℃和37℃的反复冻融使细胞破碎，离
心收集上清即获得第一代病毒，将第一代病毒继续感染293A细胞后同样方法获得第二代病
毒，第二代病毒进行病毒滴度检测后可保存于‑80℃低温冰箱用于后续实验。对照病毒为表
达LacZ的腺病毒(Ad‑LacZ)。构建该病毒的质粒为pAd/CMV/V5‑GW/LacZ由Invitrogen公司
提供，经Pac I单切后转染293A细胞，转染及病毒制备过程与上述相同。
[0026] 干扰病毒制备：采用Invitrogen公司的Gateway系列试剂盒，首先运用Invitrogen公司在线软件设计shRNA，送往Life公司合成单链的DNA，然后退火形成双链DNA，连入中间
载体BLOCK‑it U6 RNAi Entry Vector后送往公司测序，测序正确的载体通过重组的方法
(LR)连入到目标载体(pAd/BLOCK‑iT‑DEST Vector)中，测序检测正确后，制备阳性质粒，并
经核酸内切酶Pac I单切后用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000脂质体转染293A细
胞。病毒收集与扩增如前所述。对照病毒为Ad‑NC shRNA，其构建方法与上述相同。
载体BLOCK‑it U6 RNAi Entry Vector后送往公司测序，测序正确的载体通过重组的方法
(LR)连入到目标载体(pAd/BLOCK‑iT‑DEST Vector)中，测序检测正确后，制备阳性质粒，并
经核酸内切酶Pac I单切后用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000脂质体转染293A细
胞。病毒收集与扩增如前所述。对照病毒为Ad‑NC shRNA，其构建方法与上述相同。
[0027] 实施例2 LncRNA‑266诱导前体脂肪细胞分化
[0028] 原代前体脂肪细胞培养：8周龄雄性C57BL/6J小鼠，取腹股沟白色脂肪组织于离心管中，胶原酶消化液(胶原酶1mg/ml溶于分离缓冲液‑‑‑‑‑包括0.123M NaCl,5mM KCl,
1.3mM CaCl2,5nM葡萄糖,100mM Hepes,4％BSA)37℃水浴锅消化30min，间隔5min振荡一
次，100μm尼龙筛网过滤，离心，200g×5min。去上清液，加入2ml分离缓冲液充分悬浮细胞，
离心，200g×5min。去上清液，加入2ml培养液(DMEM高糖培养基，20％胎牛血清，20mM
Hepes,100U/ml青霉素/链霉素)充分悬浮细胞，种于培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中
培养。
1.3mM CaCl2,5nM葡萄糖,100mM Hepes,4％BSA)37℃水浴锅消化30min，间隔5min振荡一
次，100μm尼龙筛网过滤，离心，200g×5min。去上清液，加入2ml分离缓冲液充分悬浮细胞，
离心，200g×5min。去上清液，加入2ml培养液(DMEM高糖培养基，20％胎牛血清，20mM
Hepes,100U/ml青霉素/链霉素)充分悬浮细胞，种于培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中
培养。
[0029] 棕色脂肪细胞定向诱导分化：为检测LncRNA‑266对脂肪前体细胞向棕色脂肪细胞8
的转化，在加诱导培养基之前，前体脂肪细胞分别加入1×10 PFU过表达病毒(Ad‑LncRNA‑
266)或干扰病毒(Ad‑LncRNA‑266shRNA)处理，24小时后吸取培养基，换棕色脂肪细胞诱导
培养基。诱导培养基组成包括DMEM高糖培养基，10％胎牛血清，20mM胰岛素，1nM T3，0.5mM
IBMX，125μM吲哚美辛，1μM地塞米松。诱导2天后加入罗格列酮。2天后换用基础诱导培养基
(DMEM高糖培养基，10％胎牛血清，20mM胰岛素，1nM T3)诱导3‑4天，其间隔天换新鲜培养
基。
的转化，在加诱导培养基之前，前体脂肪细胞分别加入1×10 PFU过表达病毒(Ad‑LncRNA‑
266)或干扰病毒(Ad‑LncRNA‑266shRNA)处理，24小时后吸取培养基，换棕色脂肪细胞诱导
培养基。诱导培养基组成包括DMEM高糖培养基，10％胎牛血清，20mM胰岛素，1nM T3，0.5mM
IBMX，125μM吲哚美辛，1μM地塞米松。诱导2天后加入罗格列酮。2天后换用基础诱导培养基
(DMEM高糖培养基，10％胎牛血清，20mM胰岛素，1nM T3)诱导3‑4天，其间隔天换新鲜培养
基。
[0030] (1)油红染色
[0031] 细胞处理结束后，去除上清培养基，加PBS清洗一次，移除PBS，加4％多聚甲醛固定，室温20‑30min。随后，用PBS清洗1‑2次，彻底移除PBS，加入油红工作液，将细胞置于低速
摇床上孵育50‑60min(室温)，移除油红工作液，加下PBS清洗3次，倒置显微镜拍照，结果如
图1A和2A所示，图1A结果表明LncRNA‑266可显著增加脂滴在细胞中的积累，说明前体脂肪
细胞向棕色脂肪细胞的诱导分化。图2A显示下调LncRNA‑266的表达则减少脂滴在细胞中的
积累，说明抑制了前体脂肪细胞向棕色脂肪细胞的诱导分化。
摇床上孵育50‑60min(室温)，移除油红工作液，加下PBS清洗3次，倒置显微镜拍照，结果如
图1A和2A所示，图1A结果表明LncRNA‑266可显著增加脂滴在细胞中的积累，说明前体脂肪
细胞向棕色脂肪细胞的诱导分化。图2A显示下调LncRNA‑266的表达则减少脂滴在细胞中的
积累，说明抑制了前体脂肪细胞向棕色脂肪细胞的诱导分化。
[0032] (2)定量PCR检测基因表达水平
[0033] 使用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取细胞总RNA，再经cDNA合成试剂盒(Bio‑Rad公司产品)转录成cDNA。以此cDNA为模板，用SYBR Green Supermix(Bio‑Rad公司
产品)分析基因表达水平。检测仪器为iQ5Multicolor Real‑Time PCR Detection System
(Bio‑Rad公司产品)。结果2‑ΔCt方法计算mRNA水平。以18S持家基因来校准mRNA的水平。所
使用的引物序列如下：
产品)分析基因表达水平。检测仪器为iQ5Multicolor Real‑Time PCR Detection System
(Bio‑Rad公司产品)。结果2‑ΔCt方法计算mRNA水平。以18S持家基因来校准mRNA的水平。所
使用的引物序列如下：
[0034] 18S rRNA正向引物:5’‑AGTCCCTGCCCTTTGTACACA‑3’(SEQ ID No：2)；
[0035] 18S rRNA负向引物:5’‑CGTTCCGAGGGCCTCACT‑3’(SEQ ID No：3)；
[0036] UCP1正向引物:5’‑AGGCTTCCAGTACCATTAGGT‑3’(SEQ ID No：4)；
[0037] UCP1负向引物:5’‑CTGAGTGAGGCAAAGCTGATTT‑3’(SEQ ID No：5)。
[0038] qRT‑PCR结果如图1B和2B所示，图1B结果表明LncRNA‑266可显著诱导棕色脂肪细胞特异性基因UCP1表达增高，图2B结果表明下调LncRNA‑266的表达可显著下调UCP1基因表
达。这些结果提示LncRNA‑266可显著诱导前体脂肪细胞向棕色脂肪细胞分化。
达。这些结果提示LncRNA‑266可显著诱导前体脂肪细胞向棕色脂肪细胞分化。
[0039] 实施例3 LncRNA‑266对Ⅱ型糖尿病小鼠的糖代谢的影响
[0040] 6周龄雄性C57BL/6J小鼠，用高脂饮食(Research Diet,45％calories from fat)饲喂90天，诱导成肥胖模型小鼠(即Ⅱ型糖尿病模型小鼠)。将表达LncRNA‑266的腺病毒
(Ad‑LncRNA‑266)直接注射于Ⅱ型糖尿病模型小鼠腹股沟米色脂肪组织，使用剂量为每只
12
小鼠单侧腹股沟处注射40μl病毒(1×10 PFU)。对照组小鼠注射同等剂量的对照病毒(Ad‑
LacZ)。病毒注射3周后，检测各项生理指标检测。
(Ad‑LncRNA‑266)直接注射于Ⅱ型糖尿病模型小鼠腹股沟米色脂肪组织，使用剂量为每只
12
小鼠单侧腹股沟处注射40μl病毒(1×10 PFU)。对照组小鼠注射同等剂量的对照病毒(Ad‑
LacZ)。病毒注射3周后，检测各项生理指标检测。
[0041] 小鼠禁食12小时后，采用尾静脉取血，血糖水平用血糖仪(Bayer,Mishawaka,IN)定量检测血糖水平，结果如图3所示。图3结果表明，LncRNA‑266处理可降低Ⅱ型糖尿病模型
小鼠的血糖水平。
小鼠的血糖水平。
[0042] 小鼠禁食12小时后，采用尾静脉取血，使用小鼠血清胰岛素水平用试剂盒(Rat/mouse insulin ELISA kit,Mercodia,2758702)测定血清胰岛素水平，结果如图4所示。图4
结果表明，LncRNA‑266可降低血清胰岛素水平，改善型糖尿病模Ⅱ型小鼠的高胰岛素血症。
结果表明，LncRNA‑266可降低血清胰岛素水平，改善型糖尿病模Ⅱ型小鼠的高胰岛素血症。
[0043] 小鼠过夜禁食(从8pm到次日8am)，给小鼠腹腔注射D‑葡萄糖(0.5g/kg)。分别在注射葡萄糖后的0，15，30，60，90min取尾静脉血用血糖仪(Bayer)测定各时间点的血糖，考察
葡萄糖耐受能力，结果如图5所示。图5结果表明，LncRNA‑266处理可显著促进Ⅱ型糖尿病模
型小鼠对外周血中葡萄糖的清除能力。
葡萄糖耐受能力，结果如图5所示。图5结果表明，LncRNA‑266处理可显著促进Ⅱ型糖尿病模
型小鼠对外周血中葡萄糖的清除能力。
[0044] 小鼠禁食6小时(从8am到2pm)，给小鼠腹腔注射重组人胰岛素(0.75IU/kg)(购于Eli Lilly，Indianapolis，IN)。分别在注射葡萄糖后的0，15，30，60，90min取尾静脉血用血
糖仪(Bayer)测定各时间点的血糖，考察胰岛素耐受能力检测，结果如图6所示。图6结果表
明，LncRNA‑266处理可增强Ⅱ型糖尿病模型小鼠对胰岛素的响应能力，提高胰岛素敏感性。
糖仪(Bayer)测定各时间点的血糖，考察胰岛素耐受能力检测，结果如图6所示。图6结果表
明，LncRNA‑266处理可增强Ⅱ型糖尿病模型小鼠对胰岛素的响应能力，提高胰岛素敏感性。
[0045] 实验结束，小鼠经麻醉后处死，快速解剖小鼠，提取腹股沟脂肪用于下述检测。腹股脂肪组织的大体形态图如图7A所示。图7A结果表明LncRNA‑266处理使腹股沟脂肪组织的
颜色明显加深；图7B为定量PCR检测，结果表明LncRNA‑266显著提高了腹股脂肪组织中UCP1
基因表达水平。综上，图7结果显示LncRNA‑266处理促进小鼠腹股沟米色脂肪组织向棕色脂
肪组织转变。
颜色明显加深；图7B为定量PCR检测，结果表明LncRNA‑266显著提高了腹股脂肪组织中UCP1
基因表达水平。综上，图7结果显示LncRNA‑266处理促进小鼠腹股沟米色脂肪组织向棕色脂
肪组织转变。