一种抑制毛囊干细胞衰老的基因抑制剂

摘要

本发明提供了一种抑制毛囊干细胞衰老的基因抑制剂，属于干细胞技术领域。本发明证明在毛囊干细胞中，抑制长链非编码RNA lncRNA‑AC012322.1能够有效的降低毛囊干细胞的衰老，从而为进一步制备抑制毛囊干细胞衰老的药物提供基础，也可以为治疗衰老性脱发提供新的靶点。

权利要求

1.一种抑制毛囊干细胞衰老的基因抑制剂，其特征在于，所述基因抑制剂为lncRNA‑AC012322.1的siRNA，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所述siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.7所示。

2.根据权利要求1所述的基因抑制剂，其特征在于，所述基因抑制剂通过抑制毛囊干细胞中lncRNA‑AC012322.1的表达来抑制毛囊干细胞的衰老。

3.根据权利要求1所示的基因抑制剂，其特征在于，所述基因抑制剂能够抑制毛囊干细胞中衰老相关基因P21和P16的蛋白和基因表达。

4.一种抑制毛囊干细胞衰老的药物，其特征在于，所述药物的有效成分包括lncRNA‑AC012322.1的siRNA，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所述siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.7所示。

说明书

一种抑制毛囊干细胞衰老的基因抑制剂

技术领域

[0001] 本发明属于干细胞技术领域，尤其涉及一种抑制毛囊干细胞衰老的基因抑制剂。

背景技术

[0002] 毛囊干细胞是位于毛囊中的一种成体干细胞，毛囊干细胞具有一般干细胞的基本特性，即，毛囊干细胞具有自我更新能力和多向分化能力，能够分化为毛囊、皮脂腺和表皮
等。不同于胚胎干细胞，毛囊干细胞一般处于静息状态，只有在毛囊生长期早期才会被激
活，毛囊干细胞不仅维持正常皮肤中毛囊的再生，在皮肤损伤时，其还参与毛囊、表皮和皮
脂腺的重建。

[0003] 衰老性脱发也被称为非雄激素依赖性毛发稀疏，多发生于50岁以上的人群。一些研究表明，衰老性脱发可能与毛囊干细胞衰老有关。细胞衰老是一种细胞逐渐永久地失去
增殖能力、同时保持存活的细胞过程。在衰老状态下，间充质干细胞的增殖和分化能力明显
下降。因此，明确毛囊干细胞衰老过程中发挥调控作用的基因及其作用机理对于开发脱发
的治疗性药物和毛囊衰老的预防性药物具有重要的意义。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种能够有效抑制毛囊干细胞衰老的基因抑制剂。

[0005] 为实现上述目的，本发明提供了一种抑制毛囊干细胞衰老的基因抑制剂，所述基因抑制剂为lncRNA‑AC012322.1的siRNA，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所
述siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.7所示。

[0006] 优选地，所述基因抑制剂通过抑制毛囊干细胞中lncRNA‑AC012322.1的表达来抑制毛囊干细胞的衰老。

[0007] 优选地，所述基因抑制剂能够抑制毛囊干细胞中衰老相关基因P21和P16的蛋白和基因表达。

[0008] 此外，本发明提供了一种抑制毛囊干细胞衰老的药物，所述药物的有效成分包括lncRNA‑AC012322.1的siRNA，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.6所示，所述siRNA的反
义链序列如SEQ ID NO.7所示。

[0009] 此外，本发明提供了lncRNA‑AC012322.1基因抑制剂在制备抑制毛囊干细胞衰老药物中的应用此外，所述基因抑制剂为siRNA，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.6所
示，所述siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.7所示。

[0010] 除此之外，本发明提供了一种长链非编码RNA lncRNA‑AC012322.1，其特征在于，所述lncRNA‑AC012322.1的基因抑制剂能够抑制毛囊干细胞的衰老，所述lncRNA‑
AC012322.1的转录本序列如SEQ ID NO.1所示，所述lncRNA‑AC012322.1位于16号染色体，
所述lncRNA‑AC012322.1的External Transcript ID: ENST00000561657.1。

[0011] 本发明的有益效果在于，本发明首次证明，毛囊干细胞细胞衰老的过程中，lncRNA‑AC012322.1的表达量上调；而且，本发明首次证明，通过lncRNA‑AC012322.1的
siRNA抑制lncRNA‑AC012322.1后能够有效的抑制毛囊干细胞的衰老，减轻衰老导致的细胞
增殖速率下降，降低衰老导致的衰老相关基因P21和P16的mRNA和蛋白表达。

附图说明

[0012] 图1 lncRNA‑AC012322.1在P3代，P6代和P12代毛囊干细胞中的表达差异

[0013] 图2β‑半乳糖苷酶染色检测抑制lncRNA‑AC012322.1对于细胞衰老的影响

[0014] 图3 CCK‑8检测抑制lncRNA‑AC012322.1对于衰老导致的细胞增殖的影响

[0015] 图4 荧光定量PCR检测抑制lncRNA‑AC012322.1对于衰老相关基因P21和P16mRNA表达的影响

[0016] 图5 Western Blot检测抑制lncRNA‑AC012322.1对于衰老相关基因P21和P16蛋白表达的影响。

具体实施方式

[0017] 实施例1

[0018] （1）使用消毒剪刀和镊子拔取包含完整毛囊的毛发数根，使用含有双抗的无菌PBS冲洗毛发3次；

[0019] （2）保留完整毛囊，剪去其余的部分，在24孔板中分别放置2根毛囊；

[0020] （3）加入50μL DMEM/F‑12培养基浸泡毛囊，确保贴壁良好，置于细胞培养箱中；

[0021] （4）培养24h后，缓慢加入200μL 培养基，每3天更换新鲜培养基并观察细胞爬出情况。

[0022] （5）培养10‑14天后，观察到长梭形细胞从毛囊爬出后，更换含10%FBS的DMEM/F‑12培养基继续培养；

[0023] （6）当细胞融合度达到80‑90%的时候，去除培养基，用PBS进行清洗，加入0.25%胰酶置于细胞培养箱中；

[0024] （7）1‑2min之后，轻轻拍打细胞培养板，待80%细胞飘起之后，终止消化，收集细胞，离心，培养基重悬后铺板，常规培养并检测。

[0025] 实施例2

[0026] 检测P3代，P6代和P12代毛囊干细胞中lncRNA‑AC012322.1的表达情况

[0027] 1.RNA提取

[0028] （1）收集第三代，第六代和第十二代毛囊干细胞，进行RNA提取；

[0029] （2）加入1ml Trizol后轻轻吹打细胞，将细胞转移至2ml离心管中，室温放置10min；

[0030] （3）将离心管置于低温高速离心机中，12000转离心5min，取上清；

[0031] （4）将200μl氯仿加入到上清中，混匀后，室温放置15min；

[0032] （5）将离心管置于低温高速离心机中，12000转离心5min，取750μl上清至新的离心管中；

[0033] （6）加入750μl的预冷异丙醇混匀，放置10min；

[0034] （7）将离心管置于低温高速离心机中，12000转离心10min，小心去除上清；

[0035] （8）将1ml 75%乙醇加入到沉淀中，颠倒混匀后，将离心管置于低温高速离心机中，8000转，4℃，离心5min；

[0036] （9）小心去除上清，静置5‑10min至乙醇完全蒸发；

[0037] （10）加入DEPC水溶解沉淀，测定RNA浓度和纯度用于后续实验。

[0038] 2.逆转录反应

[0039] 逆转录反应参照TAKARA反转录试剂盒。

[0040] 逆转录反应体系：5×PrimeScript RT master mix 2μl；RNA模板 0.5μg；RNase Free水 to 10μl。

[0041] 逆转录反应条件：37℃ 15min；85℃ 5s；4℃ 冷却。

[0042] 3.实时荧光定量PCR

[0043] 引物序列

[0044] lncRNA‑AC012322.1

[0045] Forward primer 5'‑TCATGCTGTCACCTCTCACCTG‑3'（SEQ ID NO.2）

[0046] Reverse primer 5'‑GCTGCTGAGAAGAAACTGGCTG‑3'（SEQ ID NO.3）

[0047] GAPDH

[0048] Forward primer 5'‑ GAAGGTGAAGGTCGGAGTC‑3'（SEQ ID NO.4）

[0049] Reverse primer 5'‑GAAGATGGTGATGGGATTTC‑3'（SEQ ID NO.5）

[0050] 实时荧光定量PCR按照TAKARA qPCR（SYBR）试剂盒进行扩增，实验条件 95 ℃ 120 s；95 ℃ 30 s，62 ℃ 40 s 35 个循环。

[0051] 实验结果

[0052] 按照2‑△△Ct方法处理实时定量PCR数据，计算lncRNA‑AC012322.1的表达变化，实验结果如图1所示。

[0053] P6代毛囊间充质干细胞中，lncRNA‑AC012322.1的相对表达量为2.194±0.094（差异具有统计学意义），在P12代毛囊间充质干细胞中，lncRNA‑AC012322.1的相对表达量为
3.633±0.051（差异具有统计学意义），从上述结果可以看出，随着毛囊间充质干细胞传代
次数的增加，lncRNA‑AC012322.1的相对表达量不断升高。

[0054] 实施例3

[0055] 设计lncRNA‑AC012322.1 siRNA设计并进行检测

[0056] （1）si‑ lncRNA‑AC012322.1的序列如下

[0057] 5′‑UGGUAAUGUAUUUAAGAUGCC‑ 3′（SEQ ID NO.6）

[0058] 5′‑CAUCUUAAAUACAUUACCAGC‑ 3′（SEQ ID NO.7）

[0059] （2）将P3代毛囊干细胞接种于6孔板中，按照lipo2000说明书将si‑RNA和si‑NC转染至细胞中；

[0060] （3）转染48h后，提取RNA，检测lncRNA‑AC012322.1表达量，RNA提取，逆转录反应，荧光定量RCR反应同实施例2。

[0061] 实验结果

[0062] siRNA抑制后，lncRNA‑AC012322.1的相对表达量为0.104±0.014，抑制率为89.6%，说明siRNA能够有效的抑制lncRNA‑AC012322.1的基因表达且具有较好的抑制效果。

[0063] 实施例4

[0064] β‑半乳糖苷酶染色检测细胞衰老

[0065] （1）实验分组：对照组（P3毛囊干细胞），si‑NC组（P12毛囊干细胞转染si‑NC），si‑lncRNA‑AC012322.1组（P12毛囊干细胞转染si‑ lncRNA‑AC012322.1），每组设置3个重复，
实验重复3次；

[0066] （2）按照分组将细胞接种到6孔板中并使用lip2000进行转染，转染48h后，将细胞从细胞培养箱中取出，去除培养基，加PBS清洗细胞；

[0067] （3）加入1ml β‑半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15min；

[0068] （4）去除细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3min，加入1ml染色工作液；

[0069] （5）用保鲜膜封住6孔板，置于37℃孵育过夜；

[0070] （6）去除染色液，光学显微镜下，进行染色技术；

[0071] 实验结果如图2所示，从图中可以看出，抑制lncRNA‑AC012322.1后，可以显著的降低β‑半乳糖苷酶阳性细胞的数量（对照组阳性率为22.00±1.155，si‑NC组为79.67±
1.153，si‑lncRNA‑AC012322.1组为34.67±2.404）。

[0072] 实施例5

[0073] CCK‑8检测毛囊干细胞增殖能力检测

[0074] （1）实验分组：对照组（P3毛囊干细胞），si‑NC组（P12毛囊干细胞转染si‑NC），si‑lncRNA‑AC012322.1组（P12毛囊干细胞转染si‑ lncRNA‑AC012322.1），每组设置3个重复，
实验重复3次；

[0075] （2）按照分组，将1000个/孔的细胞接种于96孔板中，每孔培养基100μl；

[0076] （3）分别在第1,2,3,4,5天，加入10μl CCK‑8试剂，孵箱中孵育2h，450nm酶标仪中检测0D值。

[0077] 实验结果如图3所示，可以看出，抑制lncRNA‑AC012322.1后能够显著的逆转细胞衰老所导致的细胞增殖能力下降（第5天时对照组的OD值为0.887±0.03，si‑NC组为0.451
±0.024，si‑ lncRNA‑AC012322.1组为0.723±0.028，差异具有统计学意义）。

[0078] 实施例6

[0079] 检测衰老相关基因P21和P16的mRNA表达

[0080] （1）实验分组：对照组（P3毛囊干细胞），si‑NC组（P12毛囊干细胞转染si‑NC），si‑lncRNA‑AC012322.1组（P12毛囊干细胞转染si‑ lncRNA‑AC012322.1），每组设置3个重复，
实验重复3次；

[0081] （2）按照分组将细胞接种于6孔板中，并转染相应的基因；

[0082] （3）48h后提取RNA，检测P21和P16基因的mRNA表达，RNA提取，逆转录反应，荧光定量PCR反应步骤同实施例2。

[0083] P21引物序列为

[0084] Forward primer 5′‑TGGAGACTCTCAGGGTCGAAA‑3'（SEQ ID NO.8）

[0085] Reverse primer 5′‑GGCGTTTGGAGTAGAAATC‑3'（SEQ ID NO.9）

[0086] P16引物序列为

[0087] Forward primer 5′‑GTGGACCTGGCTGAGGAG‑3'（SEQ ID N0.10）

[0088] Reverse primer 5′‑CTTTCAATCGGGGATGTCTG‑3'（SEQ ID NO.11）

[0089] 实验条件 95 ℃ 120 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s 35 个循环。

[0090] 实验结果

[0091] 实验结果如图4所示

[0092] 从图中可以看出，抑制lncRNA‑AC012322.1可以显著的降低毛囊干细胞衰老所导致的衰老基因P21和P16基因mRNA上调（si‑ NC组的P21基因相对表达量为3.236±0.220，
si‑ lncRNA‑AC012322.1组的P21基因相对表达量为1.453±0.043；si‑ NC组的P16基因相
对表达量2.307±0.117，si‑ lncRNA‑AC012322.1组的P16基因相对表达量为1.294±
0.058）。
实施例

[0093] 检测衰老相关基因P21和P16基因蛋白表达

[0094] （1）实验分组：对照组（P3毛囊干细胞），si‑NC组（P12毛囊干细胞转染si‑NC），si‑lncRNA‑AC012322.1组（P12毛囊干细胞转染si‑ lncRNA‑AC012322.1），每组设置3个重复，
实验重复3次；

[0095] （2）按照实验分组，转染前24h将毛囊干细胞接种于6孔板中，之后按照lip2000说明书进行转染；

[0096] （3）培养48h后，每孔加入100μL PIPA裂解液，细胞充分裂解后，使用细胞刮刀将细胞刮下，并将细胞收集至离心管中；

[0097] （4）冰上放置30min，使细胞完全裂解；

[0098] （5）4℃，12000g离心20分钟，吸取上清，使用BCA法检测蛋白浓度，调整蛋白浓度为2μg/ml，100℃煮5min，即得到蛋白样品；

[0099] （6）配置10% SDS‑PAGR胶，每孔加入10μL蛋白样品；

[0100] （7）恒压90V电泳，待电泳条带完全的跑出浓缩胶时，将电压调整至130V，直至溴酚蓝部分跑出分离胶时，停止电泳，防止相应蛋白跑出浓缩胶；

[0101] （8）按照海绵‑滤纸‑分离胶‑NC膜‑滤纸‑海绵的模型放置转膜夹，250mA电转1.5h；

[0102] （9）电转结束后，将NC膜取出置于5%的脱脂奶粉中，摇床封闭1h；

[0103] （10）按照蛋白大小，将P21和P16蛋白条带剪下，孵育相应的一抗，4℃，摇床封闭过夜；

[0104] （11）使用TBST洗膜3次，每次10min，孵育二抗，室温摇床孵育60min；

[0105] （12）使用TBST洗膜3次，每次10min，洗好后，进行曝光，得到的结果如图5所示。

[0106] 从图5可以看出，抑制lncRNA‑AC012322.1可以显著的降低毛囊干细胞衰老所导致的衰老基因P21和P16基因蛋白上调，从而可以有效的降低毛囊干细胞的衰老。因此，本发明
所提供的lncRNA‑AC012322.1的siRNA能够用于制备用于抑制毛囊干细胞衰老的药物。