一种远红光溶酶体荧光探针及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN202011175030.8
文献号 : CN112321549B
文献日 : 2022-07-08
发明人 : 陈杜刚 , 冯杨振 , 党耶城 , 陈莉 , 余响林
申请人 : 武汉工程大学
摘要 :
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种远红光溶酶体荧光探针及其制备方法和应用。本发明以强供电子型的二烷基苯胺为给体、以强缺电子型的TCF为受体构筑D‑π‑A型的共轭化合物，分子内强的电荷转移作用使得发射波长红移，达到远红光区域，同时具有大的Stokes位移；在化合物中引入了增强水溶性的烷氧基链，且控制化合物的分子量大小，使得其在水中溶解度较好，应用时在工作浓度范围内，不至于在细胞中发生聚集淬灭现象；分子中引入了二甲氨基，在细胞中应用时可以定位到溶酶体。综合来看，从荧光基团、识别基团和水溶性三个方面构建探针分子，将其用于溶酶体的靶向标记成像时，灵敏度高、自吸收少、背景干扰小。
权利要求 :
1.一种远红光溶酶体荧光探针，其特征在于，分子结构式如下述式Ⅰ：
2.一种根据权利要求1所述的远红光溶酶体荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将式II化合物、用于缩合反应的催化剂I和添加剂I溶于有机溶剂I中，冰水浴下加入式III化合物，加入完毕后在室温下反应，分离得到式IV化合物，具体反应式如下：
2)将式IV化合物和式V化合物溶解于有机溶剂II中，加入用于缩合反应的催化剂II，室温下反应，分离得到式I化合物，具体反应式如下：其中，n＝1。
3.根据权利要求2所述的远红光溶酶体荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤1)中：所述有机溶剂I选自二氯甲烷、三氯甲烷、1，2‑二氯乙烷、四氢呋喃、甲苯、乙腈或1，4‑二氧六环中的任意一种或多种的混合物；
所述催化剂I为二环己基碳二亚胺或者1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐；
所述添加剂I为4‑二甲氨基吡啶、三乙胺或者二异丙基乙基胺中的任意一种或多种的混合物；
反应时间为4～24小时。
4.根据权利要求2所述的远红光溶酶体荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤2)中：所述有机溶剂II为四氢呋喃、1，4‑二氧六环、乙腈、甲醇、乙醇或丙醇中的任意一种或多种的混合物；
所述催化剂II为乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵、三乙胺、哌啶或四氢吡咯中的任意一种或多种的混合物；
反应时间为6～16小时。
5.根据权利要求2至4任一所述的远红光溶酶体荧光探针的制备方法，其特征在于:步骤1)中，将室温后的反应产物加入到水中萃取分液，收集有机相用无水硫酸钠干燥，然后用硅胶柱层析分离，得到式Ⅳ化合物；
步骤2)中，将室温下反应后得到的混合产物通过硅胶柱层析分离提纯，得到式Ⅰ化合物。
6.一种根据权利要求1所述的远红光溶酶体荧光探针的应用，其特征在于：用于制备溶酶体的靶向荧光成像试剂。
说明书 :
一种远红光溶酶体荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种远红光溶酶体荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 基于荧光探针的荧光成像具备操作简便、对细胞损伤性小、可视化等优势，被广泛应用于细胞领域的标记成像。因生物背景在光激发下本身也能发射荧光，为了避免这种背景干扰，提高检测的准确性和灵敏度，选择发射波长更长的荧光材料就显得格外有价值。同时，分子本身需具备较好的水溶性，这样在生物环境中应用时能避免聚集诱导荧光淬灭，从而最大限度地发挥其发光性能。溶酶体作为一种重要的细胞器，内含大量的水解酶，控制着蛋白质、多糖、核酸等大分子的降解，在维持细胞的生命活动中扮演了重要的角色。因此，对溶酶体进行靶向成像，并监测其变化过程意义重大，能为相关疾病的诊断提供有价值的信息。
[0003] 目前市售较成熟的溶酶体标记探针主要是BODIPY的衍生物，合成相对复杂，价格较高，如LysoTracker red DND‑99，其最大发射波长勉强达到红光区域，为590nm，而且Stokes位移非常小，仅仅只有13nm；而LysoTracker Deep Red尽管最大发射波长达到远红光区域，但是Stokes位移也很小，只有21nm。探针的Stokes位移太小，在使用中很容易产生自吸收的背景干扰。针对这些不足，亟需开发一种制备方法相对简单、水溶性好、能发射远红光且Stokes位移较大的荧光材料，以获得成本低、灵敏度高的溶酶体荧光探针。
发明内容
[0004] 为解决现有技术的不足，本发明提供了一种水溶性好、发射远红光的溶酶体荧光探针及其制备方法，可供用于溶酶体的靶向成像。该类化合物在模拟细胞环境下，最大吸收波长556nm，最大发射波长为638nm，Stokes位移较大，达到82nm，水溶性高达12μM，且合成相对简单，用于溶酶体的靶向标记时，最大发射波长位于远红光区域，背景干扰和自吸收影响小、灵敏度高、使用方便简单。
[0005] 本发明所提供的技术方案如下：
[0006] 一种远红光溶酶体荧光探针，分子结构式如下述式Ⅰ：
[0007] 式I中n＝1或者2。
[0008] 本发明以强供电子型的二烷基苯胺为给体、以强缺电子型的TCF为受体构筑D‑π‑A型的共轭化合物，分子内强的电荷转移作用使得发射波长红移，达到远红光区域，同时具有大的Stokes位移；在化合物中引入了增强水溶性的烷氧基链，且控制化合物的分子量较小，使得其在水中溶解度较好，应用时在工作浓度范围内，不至于在细胞中发生聚集淬灭现象；分子中引入了二甲氨基，在细胞中应用时可以定位到溶酶体。综合来看，从荧光基团、识别基团和水溶性三个方面构建探针分子，将其用于溶酶体的靶向标记成像时，灵敏度高、自吸收少、背景干扰小。
[0009] 本发明还提供了一种远红光溶酶体荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0010] 1)将式II化合物、用于缩合反应的催化剂I和添加剂I溶于有机溶剂I中，冰水浴下加入式III化合物，加入完毕后在室温下反应，得到式IV化合物，具体反应式如下：
[0011]
[0012] 2)将式IV化合物和式V化合物溶解于有机溶剂II中，加入用于缩合反应的催化剂II，室温下反应，得到式I化合物，具体反应式如下：
[0013]
[0014] 其中，n＝1或者2。
[0015] 具体的，步骤1)中：
[0016] 所述有机溶剂I选自二氯甲烷、三氯甲烷、1，2‑二氯乙烷、四氢呋喃、甲苯、乙腈或1，4‑二氧六环中的任意一种或多种的混合物；
[0017] 所述催化剂I为二环己基碳二亚胺(DCC)或者1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)；
[0018] 所述添加剂I为4‑二甲氨基吡啶、三乙胺或者二异丙基乙基胺中的任意一种或多种的混合物；
[0019] 反应时间为4～24小时。
[0020] 具体的，步骤2)中：
[0021] 所述有机溶剂II为四氢呋喃、1，4‑二氧六环、乙腈、甲醇、乙醇或丙醇中的任意一种或多种的混合物；
[0022] 所述催化剂II为乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵、三乙胺、哌啶或四氢吡咯中的任意一种或多种的混合物；
[0023] 反应时间为6～16小时。
[0024] 具体的，步骤2)中：将室温下反应后得到的混合产物通过硅胶柱层析分离提纯，得到式Ⅰ化合物。
[0025] 本发明还提供了远红光溶酶体荧光探针的应用，用于溶酶体的靶向荧光成像。
[0026] 具体的，用于细胞内溶酶体的靶向荧光成像。
附图说明
[0027] 图1为实施例1中式I化合物的核磁氢谱图。
[0028] 图2为实施例1中式I化合物的质谱图。
[0029] 图3为实施例1中式I化合物在磷酸盐缓冲溶液中的紫外‑可见吸收光谱图和荧光光谱图。
[0030] 图4为式I对溶酶体的共定位实验染色图。
具体实施方式
[0031] 以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0032] 下列实施例中所用材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033] 下述实施例以式I中n＝1为例，作详细说明。
[0034] 实施例1：式I化合物的合成
[0035]
[0036] (1)中间体M3的合成：氩气保护下，化合物M1(1.93g,0.01mol)、二环己基碳二亚胺(2.47g,0.012mol)(催化剂I)和4‑二甲氨基吡啶(0.06g,0.5mmol)(添加剂I)溶于50mL二氯甲烷(溶剂I)中，缓慢滴加单体M2(1.33g,0.01mol)的二氯甲烷(20mL)溶液。滴加完毕后，于室温反应12h。然后加入水萃取分液，收集有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩后用硅胶柱层析分离，淋洗剂为二氯甲烷/甲醇(30：1)，得中间体M3(2.81g)，收率91％。
[0037] (2)式I的合成：单体M3(2.00g,6.48mmol)和M4(1.55g,7.78mmol)溶于干燥的四氢呋喃/乙醇(30mL，v/v，1/1)(溶剂II)中，加入乙酸钠(53mg，0.65mmol)(催化剂II)，于室温下反应12h。然后加入水和二氯甲烷萃取分液，收集有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩后用硅1
胶柱层析分离，淋洗剂为二氯甲烷/甲醇(25：1)，得式I化合物(2.73g)，收率86％。HNMR(400MHz,CDCl3)δ[ppm]:7.63‑7.55(m,3H),6.79(d,J＝16Hz,1H),6.72(d,J＝12Hz,2H),
4.33(t,J＝4Hz,2H),4.24(s,2H),3.68(t,J＝4Hz,2H),3.59(t,J＝4Hz,2H),3.20(s,3H),+
2.55(t,J＝4Hz,2H),2.32(s,6H),1.76(s,6H).HRMS m/z：[M+H]Calcd.490.2454；Found
490.2431.
胶柱层析分离，淋洗剂为二氯甲烷/甲醇(25：1)，得式I化合物(2.73g)，收率86％。HNMR(400MHz,CDCl3)δ[ppm]:7.63‑7.55(m,3H),6.79(d,J＝16Hz,1H),6.72(d,J＝12Hz,2H),
4.33(t,J＝4Hz,2H),4.24(s,2H),3.68(t,J＝4Hz,2H),3.59(t,J＝4Hz,2H),3.20(s,3H),+
2.55(t,J＝4Hz,2H),2.32(s,6H),1.76(s,6H).HRMS m/z：[M+H]Calcd.490.2454；Found
490.2431.
[0038] 参考实施例1的步骤，进行实施例2‑7。具体如下述表1所示：
[0039] 表1.实施例2‑7实验参数及收率表
[0040]
[0041] 实施例8，式I化合物的溶酶体共定位实验
[0042] 为了考察式I在细胞中对溶酶体的靶向能力，我们对式I进行了溶酶体共定位实验。将HeLa细胞分别用LysoTraker Green DND‑26(75nM，商业化的溶酶体染色剂)与式I(75nM)进行染色，如附图4所示。图4a是LysoTracker Green DND‑26对细胞中的溶酶体成像图，可观察到绿色点状荧光；图4b是式I的细胞成像图，可观察到明亮的红色点状荧光；将图4a和4b的图叠加后得到图4c，发现二者发光区域重合度高达94％，从而证明式I化合物能够靶向到溶酶体，且发射强烈的红色荧光。
[0043] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。