一种基于EPSP合酶与GFP融合蛋白检测草甘膦的快速检测方法

摘要

本发明公开了一种基于EPSP合酶与GFP融合蛋白检测草甘膦的快速检测方法，包括克隆的草甘膦主要靶点EPSP合酶作为草甘膦的受体蛋白；将受体蛋白与绿色荧光蛋白进行融合，构建了EPSPS‑GFP这一既含有草甘膦结合部位，又带有荧光标记的新蛋白，在大肠杆菌中原核表达纯化，将其用于水中的草甘膦检测。本发明通过构建融合蛋白采用荧光光度计检测荧光响应值的变化，建立标准校正曲线，实现对草甘膦除草剂的定性定量检测。

权利要求

1.一种基于EPSP合酶与GFP融合蛋白检测草甘膦的快速检测方法,其特征在于，包括以下步骤：

A克隆的草甘膦主要靶点EPSP合酶作为草甘膦的受体蛋白；

B将受体蛋白与绿色荧光蛋白进行融合得到融合蛋白；

C将所述融合蛋白在大肠杆菌中原核表达纯化，将其用于水中的草甘膦检测。

2.按照权利要求1所述的一种基于EPSP合酶与GFP融合蛋白检测草甘膦的快速检测方法,其特征在于:所述受体蛋白与绿色荧光蛋白进行融合的融合方法包括a从烟草中克隆烯醇丙酮基莽草酸磷酸合成酶（EPSPS）基因，测序后合成基因的cDNA序列，采用同源重组法连入可表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的原核表达载体pET‑28a‑eGFP中，使EPSPS与eGFP形成融合蛋白，得到新的重组表达载体；

b采用热激转化法将重组表达载体导入大肠杆菌表达菌株BL21中，37℃摇床上180rpm摇菌2h后，加入IPTG诱导表达，摇床上继续摇菌培养16h；

c离心收集菌体，用PBS（50mM，pH7.5）缓冲液重悬后，采用超声波破菌，离心取上清，收集粗蛋白；

d利用融合蛋白上带有的His标签，采用Ni柱进行亲和层析，获得纯化后的融合蛋白。

3.按照权利要求1所述的一种基于EPSP合酶与GFP融合蛋白检测草甘膦的快速检测方法,其特征在于:所述原核表达纯化的条件a 利用融合蛋白上带有的His标签，采用Ni柱进行亲和层析，获得纯化后的融合蛋白；

b 或12000r条件下再次离心30min，收集菌体，使用洗涤液洗涤沉淀3次，用溶解缓冲液，溶解沉淀，4℃放置过夜；室温，15000 rpm离心15min，而后将上述溶液滴加20 mMTris‑HCl，100 mM NaCl ，pH8.0缓冲液中，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于20 mM Tris‑HCl，100 mM NaCl，pH8.0溶液中透析过夜。

4.按照权利要求1所述的一种基于EPSP合酶与GFP融合蛋白检测草甘膦的快速检测方法,其特征在于:所述草甘膦检测的检测条件在室温条件下在96孔黑色酶标板中每孔加入

10μL 20μg/mL的重组蛋白工作液，再分别加入200μL 含有0.2μg/mL   100μg/mL的草甘膦~

标准溶液，在荧光酶标仪下以激发波长480nm，发射波长515nm，进行检测。

说明书

一种基于EPSP合酶与GFP融合蛋白检测草甘膦的快速检测

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及草甘膦检测提取领域，具体地说，是涉及一种基于EPSP合酶与GFP融合蛋白检测草甘膦的快速检测方法。

背景技术

[0002] 草甘膦，英文名称glyphosate，化学名称为N‑磷酸甲基甘氨酸，是一种内吸传导型广谱灭生性除草剂，其作用机理主要是抑制植物体内的烯醇丙酮基莽草酸磷酸合成酶
(EPSP合酶)，从而抑制莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的转化，使蛋白质合成受到干
扰，导致植物死亡。草甘膦是世界上应用最广、产量最大的农药品种，年销售量高居农药之
首。世界各国对饮用水中草甘膦的最大残留限量(MRL)均制定了限量规定，美国环境保护协
会(EPA)制定饮用水中草甘膦的MRL为700μg/L；加拿大规定饮水中草甘膦最大可接受限量
(MAC)为280μg/L；我国在《生活饮用水卫生标准》(GB5749‑2006)规定了饮用水中草甘膦限
量为700μg/L。

[0003] 由于草甘膦极性较大，难溶于有机溶剂，缺乏可用于检测的官能团，采用液相、气相等色谱方法检测均需要衍生化；离子色谱干扰因素较多，对检测结果影响严重；ELISA和
胶体金检测等免疫分析方法受抗体所限，稳定性和灵敏度不高。因此，研发操作简便、成本
低、灵敏度高、特异性好的草甘膦快速检测方法尤为重要。因此需要一种能有效解决上述问
题的一种基于EPSP合酶与GFP融合蛋白检测草甘膦的快速检测方法。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种基于EPSP合酶与GFP融合蛋白检测草甘膦的快速检测方法。

[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

[0006] 本发明包括以下步骤：

[0007] A克隆的草甘膦主要靶点EPSP合酶作为草甘膦的受体蛋白；

[0008] B将受体蛋白与绿色荧光蛋白进行融合得到融合蛋白；

[0009] C将所述融合蛋白在大肠杆菌中原核表达纯化，将其用于水中的草甘膦检测。

[0010] 进一步地，所述受体蛋白与绿色荧光蛋白进行融合的融合方法包括：

[0011] a从烟草中克隆烯醇丙酮基莽草酸磷酸合成酶(EPSPS)基因，测序后合成基因的cDNA序列，采用同源重组法连入可表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的原核表达载体pET‑
28a‑eGFP中，使EPSPS与eGFP形成融合蛋白，得到新的重组表达载体。

[0012] b采用热激转化法将该质粒载体导入大肠杆菌表达菌株BL21中，37℃摇床上180rpm摇菌2h后，加入IPTG诱导表达，摇床上继续摇菌培养16h。

[0013] C 12000r离心2min，弃去上清，收集菌体，用PBS(50mM，pH7.5)缓冲液重悬后，采用工作2s，间歇8s，总时间30min条件下超声波破菌，离心取上清，收集粗蛋白。

[0014] 进一步地，所述原核表达纯化的条件为：

[0015] a利用融合蛋白上带有的His标签，采用Ni柱进行亲和层析，获得纯化后的融合蛋白。

[0016] b或12000r条件下再次离心30min，收集菌体。使用洗涤液(20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X‑100，pH8.0)洗涤沉淀3次。用溶解缓冲液(20mM Tris，5mM 
DTT，8M尿素pH8.0)，按一定比例溶解沉淀，4℃放置过夜；室温，15000rpm离心15min。而后将
上述溶液滴加20mM Tris‑HCl，100mM NaCl，pH8.0缓冲液中，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，
将蛋白溶液装入透析袋于20mM Tris‑HCl，100mM NaCl，pH8.0溶液中透析过夜。

[0017] 进一步地，所述草甘膦检测的检测条件

[0018] 室温条件下(约25℃)在96孔黑色酶标板中每孔加入10μL 20μg/mL的重组蛋白工作液，再分别加入200μL含有0.2μg/mL～100μg/mL的草甘膦标准溶液，在荧光酶标仪下以激
发波长480nm，发射波长515nm，进行检测。以草甘膦浓度为横坐标，荧光响应值为纵坐标，制
作标准定量校正曲线如图2所示。

[0019] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0020] 本发明通过构建融合蛋白采用荧光光度计检测荧光响应值的变化，建立标准校正曲线，实现对草甘膦除草剂的定性定量检测。

附图说明

[0021] 图1收集纯化蛋白电泳鉴定图

[0022] 图2为本发明基于荧光重组蛋白的草甘膦检测校正标准曲线图；

具体实施方式

[0023] 下面根据实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。

[0024] 如图1所示，本发明包括以下步骤：

[0025] A克隆的草甘膦主要靶点EPSP合酶作为草甘膦的受体蛋白；

[0026] B将受体蛋白与绿色荧光蛋白进行融合得到融合蛋白；

[0027] 融合蛋白构建表达：

[0028] 从烟草中克隆烯醇丙酮基莽草酸磷酸合成酶(EPSPS)基因，测序后合成基因的cDNA序列，采用同源重组法连入可表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的原核表达载体pET‑
28a‑eGFP中，使EPSPS与eGFP形成融合蛋白，得到新的重组表达载体。

[0029] 采用热激转化法将该质粒载体导入大肠杆菌表达菌株BL21中，37℃摇床上180rpm摇菌2h后，加入IPTG诱导表达，摇床上继续摇菌培养16h。

[0030] C 12000r离心2min，弃去上清，收集菌体，用PBS(50mM，pH7.5)缓冲液重悬后，采用工作2s，间歇8s，总时间30min条件下超声波破菌，离心取上清，收集粗蛋白。

[0031] 所述原核表达纯化的条件为：

[0032] 利用融合蛋白上带有的His标签，采用Ni柱进行亲和层析，获得纯化后的融合蛋白。

[0033] 或12000r条件下再次离心30min，收集菌体。使用洗涤液(20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X‑100，pH8.0)洗涤沉淀3次。用溶解缓冲液(20mM Tris，5mM 
DTT，8M尿素pH8.0)，按一定比例溶解沉淀，4℃放置过夜；室温，15000rpm离心15min。而后将
上述溶液滴加20mM Tris‑HCl，100mM NaCl，pH8.0缓冲液中，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，
将蛋白溶液装入透析袋于20mM Tris‑HCl，100mM NaCl，pH8.0溶液中透析过夜。

[0034] 所述草甘膦检测的检测条件

[0035] 室温条件下(约25℃)在96孔黑色酶标板中每孔加入10μL 20μg/mL的重组蛋白工作液，再分别加入200μL含有0μg/mL～100μg/mL的草甘膦标准溶液，在荧光酶标仪下以激发
波长480nm，发射波长515nm，进行检测。以草甘膦浓度为横坐标，荧光响应值为纵坐标，制作
标准定量校正曲线如图2所示。

[0036] 融合蛋白用于草甘膦检测：当检测体系中不含有草甘膦时，体现为eGFP的荧光信号特征，蛋白溶液在蓝光激发下呈现绿色荧光(Ex 480nm，Em515nm)；当检测体系中含有草
甘膦时，体现为EPSPS的草甘膦结合特征，EPSPS结合草甘膦后，三维空间构象发生变化，带
动后端串接的eGFP构象改变，继而引发融合蛋白的荧光光谱变化。如图2所示，通过采用荧
光光度计检测荧光响应值的变化，建立标准校正曲线，实现对草甘膦除草剂的定性定量检
测，

[0037] 在另一个实施例子中，以添加0.7μg/mL的蒸馏水作为模拟待测样品，进行检测，得到荧光响应值为3220，作为y值代入校正曲线方程y＝‑30.808x+3242.1，得到检测浓度x＝
0.714(μg/mL)，回收率为102％，满足检测准确度要求。

[0038] 上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决
的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。