一种猴头菌来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的表达和纯化方法

摘要

本发明涉及一种猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶的扩增用引物、表达载体、转化子及表达纯化方法，属于基因工程和蛋白质工程技术领域。本发明提供了一种猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶基因的扩增用引物，所述引物包括上游引物A6180 F和下游引物A6180 R，所述A6180 F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述A6180 R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明能够制备得到大量高纯度且具备生物活性的目的蛋白。

权利要求

1.一种基于转化子的猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶的表达和纯化方法，包括以下步骤：

将转化子接种于培养基中，培养至OD600为0.6～0.8，加入IPTG至浓度为1.0mM，在37℃下诱导培养4h，收获菌体；将菌体与破菌液混合，超声，离心，收集上清液，得到UDP‑葡萄糖‑

4‑差向异构酶；所述超声的功率为300W，时间为30min；

用平衡缓冲液冲洗镍柱5次，进样，用清洗缓冲液冲洗镍柱6次，再用洗脱缓冲液冲洗镍柱2次，收集滤液，得到蛋白洗脱样，将蛋白洗脱样透析至透析缓冲液中，有沉淀产生后过滤去除沉淀并除菌，得到纯化后的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶；

所述清洗缓冲液为含20mM、50mM和80mM咪唑的pH值为7.4的PBS缓冲液，用清洗缓冲液冲洗镍柱时，浓度从低到高，每个浓度连续洗2次；

所述转化子的宿主菌为BL21；所述转化子中含有猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶基因的重组表达载体，所述表达载体的骨架载体为去除了pelB信号肽序列的pET‑22b(+)质粒；所述猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.根据权利要求1所述的表达和纯化方法，其特征在于，所述破菌液包括免疫印迹及免疫沉淀用裂解液。

3.根据权利要求1所述的表达和纯化方法，其特征在于，所述平衡缓冲液为pH值为7.4的PBS缓冲液；所述洗脱缓冲液为含500mM咪唑的pH值为7.4的PBS缓冲液；所述透析缓冲液为含300mM NaCl、10％丙三醇和1mM苯甲基磺酰氟的pH值为7.4的PBS缓冲液。

说明书

一种猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶的表达和纯化

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，具体涉及一种猴头菌321菌株来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶的扩增用引物、表达载体、转化子及表达纯化方法。

背景技术

[0002] UDP‑葡萄糖‑4差向异构酶(UDP‑glucose‑4‑epimerase，GalE)是一种葡萄糖差向异构酶，在催化UDP‑葡萄糖和UDP‑半乳糖之间的转换中起着关键作用。为了实现猴头菌321
菌株来源的UDP‑葡萄糖‑4差向异构酶的表达，现有技术通常使用T4连接酶构建重组载体，
但是步骤较繁琐，容易增加实验误差；此外，目前只能通过实验来验证UDP‑葡萄糖‑4差向异
构酶在不同菌种内的底物亲和力，相对增加了研究的不确定性，现有技术缺乏一种在细菌
中高效表达UDP‑葡萄糖‑4差向异构酶及纯化方法。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于提供一种UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶扩增用引物、表达载体、转化子及表达纯化方法。本发明能够制备得到大量高纯度且具备生物活性的目的蛋白。

[0004] 本发明提供了一种猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶基因的扩增用引物，所述引物包括上游引物A6180 F和下游引物A6180 R，所述A6180 F的核苷酸序列如SEQ ID 
NO.1所示，所述A6180 R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0005] 本发明还提供了一种猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶基因的测序用引物，所述引物包括上游测序引物和下游测序引物，所述上游测序引物的核苷酸序列如SEQ 
ID NO.3所示，所述下游测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0006] 本发明还提供了一种猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶基因的重组表达载体，所述表达载体的骨架载体为去除了pelB信号肽序列的pET‑22b(+)质粒。

[0007] 本发明还提供了一种表达猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶基因的转化子，所述转化子的宿主菌为BL21。

[0008] 优选的是，所述猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

[0009] 本发明还提供了一种基于上述技术方案所述转化子的猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶的表达方法，包括以下步骤：将上述技术方案所述的转化子接种于培养基中，
培养至OD600为0.6～0.8，加入IPTG至浓度为1.0mM，在37℃下诱导培养4h，收获菌体；将菌体
与破菌液混合，超声，离心，收集上清液，得到UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶。

[0010] 优选的是，所述破菌液包括免疫印迹及免疫沉淀用裂解液。

[0011] 优选的是，所述超声的功率为300W，时间为30min。

[0012] 本发明还提供了一种猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶的纯化方法，包括以下步骤：

[0013] 用平衡缓冲液冲洗镍柱5次，进样，用清洗缓冲液冲洗镍柱6次，再用洗脱缓冲液冲洗镍柱2次，收集滤液，得到蛋白洗脱样，将蛋白洗脱样透析至透析缓冲液中，有沉淀产生后
过滤去除沉淀并除菌，得到纯化后的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶；

[0014] 所述清洗缓冲液为含20mM、50mM和80mM咪唑的pH值为7.4的PBS缓冲液，用清洗缓冲液冲洗镍柱时，浓度从低到高，每个浓度连续洗2次。

[0015] 优选的是，所述平衡缓冲液为pH值为7.4的PBS缓冲液；所述洗脱缓冲液为含500mM咪唑的pH值为7.4的PBS缓冲液；所述透析缓冲液为含300mM NaCl、10％丙三醇和1mM苯甲基
磺酰氟的pH值为7.4的PBS缓冲液。

[0016] 本发明提供了一种猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶的扩增用引物。本发明利用所述扩增用引物构建了适于此基因异源表达的重组表达载体pET22b‑A6180；并在
E.coli BL21(DE3)中转化得到了可以正常表达此目的基因的阳性转化子BL21‑A6180，可用
于制备具备生物活性的目的蛋白；通过筛选诱导条件获得了最适培养条件，并通过镍柱进
行菌液中蛋白的分离纯化，通过优化的咪唑洗脱液去除掉绝大部分的杂蛋白，进而透析缓
冲液去除掉咪唑、氯化钠和小分子，冷冻干燥后得到了95％纯度的目的蛋白。

附图说明

[0017] 图1为本发明提供的总RNA提取结果；

[0018] 图2为本发明提供的PCR扩增结果；

[0019] 图3为本发明提供的重组表达载体pET22b‑A6180构建示意图；

[0020] 图4为本发明提供的菌液PCR结果示意图；

[0021] 图5为本发明提供的SDS‑PAGE结果示意图；

[0022] 图6为本发明提供的Western Blot结果示意图；

[0023] 图7为本发明提供的优化和可溶性分析SDS‑PAGE结果；

[0024] 图8为本发明提供的蛋白透析SDS‑PAGE结果；

[0025] 图9为本发明提供的采用其它纯化条件后得到的SDS‑PAGE结果。

具体实施方式

[0026] 本发明提供了一种猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶基因(本发明简称A6180)的扩增用引物，所述引物包括上游引物A6180 F和下游引物A6180 R，所述A6180 F的
核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：5’‑AACTTTAAGGAGATATACATATGGCTGTTGCCGATACCTC‑3’，所
述A6180R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：5’‑TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCTTGGACT
CGGTATCGTAGCC‑3’。在本发明中，所述猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶基因来自猴
头菌321(保藏于中国微生物菌种保藏中心上海食用菌分中心，编号为：Hericium321)，所述
猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示(1187bp)。
本发明所述引物能够特异性扩增猴头菌321菌株来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶(A6180)
基因。

[0027] 本发明还提供了一种猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶基因的测序用引物，所述引物包括上游测序引物和下游测序引物，所述上游测序引物的核苷酸序列如SEQ 
ID NO.3所示：5’‑TGCGTCCGGCGTAGAGGATC‑3’，所述下游测序引物的核苷酸序列如SEQ ID 
NO.4所示：5’‑CCCGTTTAGAGGCCCCAAGG‑3’。在本发明中，所述猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑
差向异构酶基因来自猴头菌321，所述猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶基因的核苷
酸序列如SEQ ID NO.5所示：ATGGCTGTCGCTGATACCTCTCTTAAACGTGTTTTGGTGACGGGTGGTGCTG
GGTACATCGGTTCCCATGTCATTTACGCATTACAGAAGACAAGGCGTTACAAAGTCATCTGTCTTGACAACTACCA
TAATTCGCAGCCGAAGGCCTTGACACGCCTCGAGCAGATCGCCACCGACGCGCTCCCGGAGGGTGCCACCGCCGAC
GAAAAGGCGTCCGCAGTCATAGACGTGCACAAGTGCGATCTTACCCAGCCCGAGCAGATCCGAGCAGTCTTCAAGA
AGTACGGCAAGGGCGGAATATGGGGAATCATCCACGTCGCGGCCTACAAAGCTGTTGGAGAATCAACAGAGATACC
CGTTACCTATTACCACAATAATGTTTCCGCTACCATATTCCTCCTCCAAGTAATGGATGACTTCGACTGCACACGA
TTCGTATATTCCTCCTCCGCCACCGTCTACGGTACCCCGCCAAAAGTACCCATTCCCGAGTCTACTCGTCTTCAGG
CCGACAGCCCTTACGGCAAGAGCAAGGTGATGGCGGAGACGATCATTGATGATTTGACTCACGCCCAACCCACAAG
ATGGCGAGCTATCTCCCTGCGATACTTCAACCCCGCGGGCGCTCACCCCTCTGGTCTCATCGGTGAGGATCCCCTG
GGCCGACCTGGGAATCTGCTGCCCTTGCTGGCCCAGATGGCCGTCGGCCGTGTGAAGGATCCCGTTCTGAAAGTCT
TCGGCAACGACTATCCCACCCCAGACGGAACGTGCGTCCGCGACTATCTGCACGTCCTCGACCTGGCCGAGGGCCA
CCTGCTTGCTCTGGACGCGCTCGCGCCCGAGTCGAAGCTGTTCGACAACTGCCCCACCGAGGCGCGCTACAAGGCG
TACAACCTCGGCAGGGGCCAGGGCTCCAGTGTCCTGCAGATCGTCGAGGCCATGCGCAAGGCGACCGGATTCGACT
ACAAGACCGAGATCGTCGGCAGGAGACGGGGCGATGTCCCAGATCTCACCGCGGACCCGACGCTCGCCGAGAAGGA
GCTGGGCTTCAAGGCGAAGCAGGACCTCGAGACCGCCTGCAGGGACCTGTGGAACTGGCAGACGAAGAACCCGAAT
GGATACGATACCGAGTCGAAGTGA。本发明所述测序用引物能够保证后续测序结果的完整性。

[0028] 本发明还提供了一种猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶基因的重组表达载体，所述表达载体的骨架载体为去除了pelB信号肽序列的pET‑22b(+)质粒。本发明所述质
粒携带6*HIS标签，能够便于后期蛋白的镍柱纯化。因为pET‑22b(+)质粒自身携带了pelB信
号肽序列，使得目的蛋白表达后可以储存在周质空间，后期蛋白提取相对繁琐，本发明通过
去除掉此信号肽序列后进行异源表达蛋白，简化了蛋白提取流程。在本发明中，所述猴头菌
来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶基因来自猴头菌321，所述猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑
差向异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

[0029] 本发明还提供了一种表达猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶基因的转化子，所述转化子的宿主菌为BL21。在本发明中，所述猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构
酶基因来自猴头菌321，所述猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO.5所示。

[0030] 本发明还提供了一种基于上述技术方案所述转化子的猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶的表达方法，包括以下步骤：将上述技术方案所述的转化子接种于培养基中，
培养至OD600为0.6～0.8，加入IPTG至浓度为1.0mM，在37℃下诱导培养4h，收获菌体；将菌体
与破菌液混合，超声，离心，收集上清液，得到UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶。本发明所述诱导
条件的限定可以在短时间内更快速的获得菌株来实现蛋白的提取，可溶性的活性蛋白和包
涵体蛋白产量均很高，为了避免包涵体蛋白复性处理影响蛋白活性，本发明只收集了可溶
性蛋白部分。在本发明中，所述破菌液优选包括免疫印迹及免疫沉淀用裂解液。在本发明
中，所述免疫印迹及免疫沉淀用裂解液优选为购自翊圣公司的WB/IP裂解液。翊圣公司的
WB/IP裂解液能够实现对大部分蛋白的提取。在本发明中，所述超声的功率为300W，时间为
30min。在本发明中，所述离心的条件为10,000rpm离心15min。本发明通过将菌体与破菌液
混合，对超声和离心条件进行限定，不仅操作简单，液量损失少，还能够最大程度的保护蛋
白质的活性不会降低，利于后期蛋白质的性质验证。

[0031] 本发明还提供了一种猴头菌来源的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶的纯化方法，包括以下步骤：

[0032] 用平衡缓冲液冲洗镍柱5次，进样，用清洗缓冲液冲洗镍柱6次，再用洗脱缓冲液冲洗镍柱2次，收集滤液，得到蛋白洗脱样，将蛋白洗脱样透析至透析缓冲液中，有沉淀产生后
过滤去除沉淀并除菌，得到纯化后的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶；所述清洗缓冲液为含
20mM、50mM和80mM咪唑的pH值为7.4的PBS缓冲液，用清洗缓冲液冲洗镍柱时，浓度从低到
高，每个浓度连续洗2次，本发明通过不同咪唑浓度的清洗缓冲液对柱子进行梯度洗脱，从
而能够把杂蛋白去除掉。在本发明中，所述平衡缓冲液为pH值为7.4的PBS缓冲液；所述洗脱
缓冲液为含500mM咪唑的pH值为7.4的PBS缓冲液；所述透析缓冲液为含300mM NaCl、10％丙
三醇和1mM苯甲基磺酰氟的pH值为7.4的PBS缓冲液。本发明所述纯化方法中，通过配置四种
不同的缓冲液来对柱子进行复性、杂蛋白的洗脱和目的蛋白的收集纯化，通过配置不同浓
度的咪唑洗脱液来去除掉绝大部分的杂蛋白，通过透析缓冲液去除掉绝大部分的咪唑、氯
化钠和绝大部分小分子，提高了洗脱缓冲液中目的蛋白的储存条件。本发明用洗脱缓冲液
冲洗镍柱后，优选用平衡缓冲液清洗柱子5次，最后加入平衡缓冲液浸泡柱子进行保存，通
过平衡液可以无影响的重复利用一根镍柱，节省耗材。通过另外三种缓冲液的使用可以更
加高纯度的获得目的蛋白。

[0033] 下面结合具体实施例对本发明所述的一种UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶的扩增用引物、表达载体、转化子及表达纯化方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限
于以下实施例。

[0034] 实施例1

[0035] A6180目的基因的克隆

[0036] (1)菌丝体收集

[0037] 在PDA平板表面覆盖一层灭过菌的玻璃纸，将活化后的猴头菌321平板切块，放置平板中央培养，菌株可以透过玻璃纸靠培养基里的养分存活。培养七天后再用镊子刮下，用
超纯水润洗后液氮速冻，存于‑80℃待用。

[0038] (2)猴头菌总RNA提取

[0039] 丝状真菌RNA提取试剂盒步骤如下(Takara):

[0040] 1.将小于100mg的真菌菌丝放入研钵中，加液氮迅速研磨成糊状。用小药匙刮研钵壁上研磨好的组织并转移到2mL离心管内。

[0041] 2.将研磨好的组织样品按100mg加入1ml Trizol，转移入离心管后充分混匀并静置5min。

[0042] 3.按每毫升Trizol加入200μl的氯仿，振荡混匀15s后静置5min。

[0043] 4.在4℃下12,000rpm离心15min，吸取上层水相，移至另一新的离心管中，按每毫升Trizol加入500μl异戊醇，混匀后静置10min。

[0044] 5.在4℃下12,000rpm离心10min，弃上清液，按每毫升Trizol加入1ml的75％乙醇，温和振荡，悬浮沉淀，重复此操作三次以除净杂质。

[0045] 6.然后，在室温下晾10min，使乙醇挥发完全。

[0046] 7.在离心管中加入用50μl的DDH2O来溶解RNA。

[0047] 8.取2μL RNA在1.0％琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度。总RNA提取结果如图1所示，28S亮度约为18S亮度两倍，说明总RNA提取完成，质量符合下一步实验要求。

[0048] (3)反转录合成cDNA

[0049] 采用翊圣的Hifair TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit将猴头菌321总RNA逆转录合成cDNA，作为PCR扩增的模板。

[0050] 1.去除残留基因组DNA。

[0051]

[0052] 反应程序：移液器吹打混匀后在42℃孵育2min。

[0053] 2.逆转录反应体系

[0054]

[0055] 反应程序：移液器吹打混匀后25℃ 5min，42℃ 30min，85℃ 5min。产物存于‑20℃待用。

[0056] (4)PCR反应扩增目的基因

[0057] 根据猴头菌321 UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶(A6180)基因的序列全长，设计上下游扩增引物：A6180F：5’‑AACTTTAAGGAGATATACATATGGCTGTTGCCGATACCTC‑3’(SEQ ID NO.1，划
线处为Nde I酶切位点)，A6180 R：5’‑TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCTTGGACTCGGTATCGT
AGCC‑3’(SEQ ID NO.2，划线处为Xho I酶切位点)；介于测序结果前80bp的不准确性，故在
上下游引物5’方向的100bp处设计测序引物：测序F：5’‑TGCGTCCGGCGTAGAGGATC‑3’，SEQ ID 
NO.3，测序R：5’‑CCCGTTTAGAGGCCCCAAGG‑3’，SEQ ID NO.4，均由上海生工生物工程有限公
司合成。

[0058] PCR扩增体系

[0059]

[0060] PCR反应程序：

[0061] 94℃预变性5min；

[0062] 94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 75s，30个循环；

[0063] 72℃ 10min；

[0064] 4℃For ever。

[0065] PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增结果如图2所示，目的基因片段扩增长度为1187bp，条带位置准确且亮度清晰，质量符合后续实验要求。

[0066] (5)PCR产物的凝胶回收与纯化

[0067] 利用TIANGEN的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对检测正确的PCR扩增产物进行提取纯化。

[0068] 1.柱平衡步骤：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

[0069] 2.将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中，称取重量。

[0070] 3.向胶块中加入等倍体积溶液PN，50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

[0071] 4.将上一步所得溶液加入到一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

[0072] 5.向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

[0073] 6.重复操作步骤5。

[0074] 7.将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm离心2min，除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底晾干，防止残留的漂洗液影响下一步实验。

[0075] 8.将吸附柱CA2放入新离心管中，向吸附膜中间滴加50μl DDH2O，室温放置2min。12,000rpm离心2min收集溶液，即得到A6180目的基因。

[0076] 实施例2

[0077] pET22b‑A6180重组表达载体的构建

[0078] (1)pET‑22b(+)质粒的双酶切

[0079] 用NdeI和XhoI对pET‑22b(+)质粒进行双酶切。

[0080] 酶切反应体系：

[0081]

[0082] 酶切反应程序：在PCR仪里面37℃酶切1h。

[0083] 酶切结束后，在80℃下热失活20min，并测定酶切后质粒的浓度。

[0084] (2)重组载体构建

[0085] 利用Hieff Plus One Step Cloning Kit试剂盒进行重组表达载体的构建，质粒用量X为(0.02×载体碱基对数)，插入片段用量Y为(0.04×载体碱基对数)。

[0086] 酶连反应体系:

[0087]

[0088] 酶连反应程序：吸打混匀，50℃反应20min，反应结束后，立即冰上冷却5min，进行转化，也可储存‑20℃，待需要时解冻转化。重组表达载体pET22b‑A6180构建示意图如图3所
示。

[0089] (3)重组载体转化

[0090] 1.吸取全量10μl连接产物，加入到100μl感受态细胞悬浮液中，冰浴30min。

[0091] 2.在42℃水浴锅内热激1min，冰上放置2min。

[0092] 3.加入890μl的LB培养基，37℃振荡培养60min。

[0093] 4.吸取100μl已转化的感受态细胞到含Amp的LB平板培养基，过夜培养至形成单菌落。

[0094] (4)重组载体筛选

[0095] 挑取抗性平板中的白色单菌落至含有Amp抗性的LB液体培养基中扩增，37℃，200r/min振荡培养4h左右，挑取白色单菌落进行菌落PCR鉴定。除了模板为菌液及上下游引
物更换为测序F、测序R，菌液PCR反应体系与程序都和实施例1中的(5)一样。菌液PCR结果如
图4所示，扩增的基因片段长度为1387bp，条带位置准确且亮度清晰，质量符合后续实验要
求。

[0096] (5)对阳性菌落进行质粒的提取

[0097] 利用天根的高纯度质粒小提试剂盒对过夜培养的阳性克隆进行质粒的提取。

[0098] 1.柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管。

[0099] 2.取5ml过夜培养的菌液加入离心管，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清。

[0100] 3.向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

[0101] 4.向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6‑8次使菌体充分裂解。

[0102] 5.向离心管中加入350μl溶液P3，温和地上下翻转6‑8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10min，用移液器小心地将上清转移到过滤柱CS(过滤柱放入收
集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。

[0103] 6.12,000rpm离心2min，小心地将离心后收集管中得到的溶液转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)。

[0104] 7.12,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

[0105] 8.向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

[0106] 9.向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

[0107] 10.重复操作步骤9。

[0108] 11.将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

[0109] 12.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl DDH2O，室温放置2min，12,000rpm离心2min收集到离心管中，即得到pET22b‑A6180重组载
体。

[0110] (6)重组载体测序检验

[0111] 将验证成功的质粒送去上海生工生物工程公司测序验证，验证成功的单菌落即为包含重组表达载体的阳性转化子。

[0112] (7)重组载体转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞

[0113] 吸取1ngpET22b‑A6180重组载体转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，具体方法如实施例2中的(3)一样。

[0114] (8)阳性转化子筛选

[0115] 具体方法如实施例2中的(4)一样。

[0116] (9)对阳性菌落进行质粒的提取

[0117] 具体方法如实施例2中的(5)一样。

[0118] (10)重组载体测序检验

[0119] 具体方法如实施例2中的(6)一样，测序结果准确的单菌落即为阳性转化子BL21‑A6180。

[0120] 实施例3

[0121] UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶(HeGalE)的诱导表达和纯化

[0122] (1)目的蛋白的表达

[0123] 选取阳性转化子BL21‑A6180单菌落接种于5ml含50μg/ml Amp的LB液体培养基中，于37℃，220rpm条件下培养12～16h；按照2％(v/v)接种量接种于6瓶含有50μg/ml Amp的LB
培养基中，37℃，220rpm条件下培养菌体OD600为0.6～0.8后向其中5管加入IPTG至终浓度为
0.5mM，以不加IPTG的为对照组。诱导培养4h后离心收集诱导表达后的大肠杆菌E.coli 
BL21(DE3)中，加5ml破菌液，混匀，使用超声破菌，功率300W，30min，然后4℃，10,000rpm离
心15min，收集上清液用于SDS‑PAGE和Western Blot分析验证目的蛋白表达程度。

[0124] (2)目的蛋白的SDS‑PAGE鉴定

[0125] 1.将带玻璃板的SDS聚丙烯酰胺凝胶放入电泳仪，从两胶夹板中导入缓冲液(Precast running Buffer)，使缓冲液没过凝胶。

[0126] 2.分别依次加入Protein marker、与loading buffer 1比1混匀的蛋白样品。

[0127] 3.电泳电压120V，电泳至蓝色指示带迁移到距前沿1～2cm处停止，约1～2h。

[0128] 4.用刀撬除胶板上的玻璃板，将SDS聚丙烯酰胺凝胶取出放入装有0.25％考马斯亮蓝染液的大培养皿中染色2～4h。

[0129] 5.弃去染色液，蒸馏水漂洗3遍，加入脱色液直至蛋白质条带清晰为止。SDS‑PAGE结果如图5所示，M为蛋白质Marker，1泳道为未添加诱导剂的样品，2～6泳道为添加IPTG诱
导剂后的样品。与未添加诱导剂样品相比，45KD位置的蛋白浓度明显增加，表明目的蛋白正
常高效表达。

[0130] (3)目的蛋白的Western Blot鉴定

[0131] 1.将带玻璃板的SDS聚丙烯酰胺凝胶放入电泳仪，从两胶夹板中导入缓冲液(Precast running Buffer)，使缓冲液没过凝胶。

[0132] 2.分别依次加入Protein marker、与loading buffer1比1混匀的蛋白样品。

[0133] 3.电泳电压120V，电泳至蓝色指示带迁移到距前沿1～2cm处停止，约1～2h。

[0134] PVDF膜剪至相应大小，将凝胶从玻璃板中取出，按夹子的黑面‑海绵垫‑滤纸‑胶‑膜‑滤纸‑白面的三明治结构全部浸入转膜液中。将夹子放入转移槽中，要使夹的黑面对槽
的黑面，夹的白面对槽的红面，安装装置。将PVDF全部淹没在转膜液中，且在冰浴条件下，
100V恒压转膜1～2h。

[0135] 4.PVDF膜取出后TBST洗5*5分钟，以洗去膜上的转膜液，将膜浸入10ml5％TBST溶解的脱脂奶粉中，脱色摇床上非常慢速的摇动1h，接触胶的那面膜朝上。

[0136] 5.10ml TBST洗涤5*5min。

[0137] 6.一抗孵育：将膜浸入10ml TBST溶解的脱脂奶粉，加入5μl小鼠抗His‑tag单克隆抗体(上海翊圣生物科技有限公司)，慢慢摇动1h后4℃过夜。

[0138] 7.二抗孵育：从4℃中拿出后，摇动30min，TBST洗涤5*5min。洗涤后将膜浸入10ml TBST溶解的脱脂奶粉，加入5μl过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(上海翊圣生物科
技有限公司)慢慢摇动1h，然后TBST洗5*5min。

[0139] 8.往1ml蒸馏水加入显色剂A，B，C各1滴，混匀后加至标本上。显色10～30min。

[0140] 9.显色后蒸馏水充分洗涤后终止反应，吸水纸吸去水分，保鲜膜保存。Western Blot结果如图6所示，M为蛋白质Marker，3泳道为添加诱导剂的样品。经过Western Blot验
证后，在45KD位置出现了目的蛋白，表明目的蛋白正常高效表达。

[0141] (4)目的蛋白的表达优化与可溶性分析

[0142] 将阳性转化子菌株培养至菌体OD600为0.6‑0.8后，按照2％(v/v)接种量接种于4瓶培养基中，分别在37℃1.0mM IPTG，37℃ 0.2mM IPTG，15℃ 1.0mM IPTG，15℃ 0.2mM IPTG
四种条件下220rpm培养4h，诱导融合蛋白表达，进而运用实施例3中(3)的具体方法对各条
件诱导菌液进行SDS‑PAGE分析。优化和可溶性分析SDS‑PAGE结果如图7所示，泳道M：
Protein Marker，泳道1：15℃ 0.2mM IPTG诱导后样品，泳道2：15℃ 1.0mM IPTG诱导后样
品，泳道3：37℃ 0.2mM IPTG诱导后样品，泳道4：37℃ 1.0mM IPTG诱导后样品，泳道5：未诱
导样品，泳道6：37℃ 1.0mM IPTG诱后沉淀样，泳道7：37℃ 1.0mM IPTG诱后上清样，泳道8：
37℃ 0.2mM IPTG诱后沉淀样，泳道9：37℃ 0.2mM IPTG诱后上清样，泳道10：15℃ 1.0mM 
IPTG诱后沉淀样，泳道11：15℃ 1.0mM IPTG诱后上清样，泳道12：15℃ 0.2mM IPTG诱后沉
淀样，泳道13：15℃ 0.2mM IPTG诱后上清样，结果表明，在37℃ 1.0mM IPTG诱导条件下最
好，获得的目的蛋白含量最高。

[0143] (5)目的蛋白的放大表达与纯化

[0144] 将阳性转化子菌株在2L的放大培养基中培养至OD600＝0.6～0.8，选取蛋白表达最优条件37℃1.0mM IPTG进行诱导4h后离心收集菌体，并运用实施例3中(1)的具体方法获得
粗蛋白。按照Ni－NTA蛋白纯化试剂盒的操作方法纯化上清液液中的猴头菌UDP‑葡萄糖‑4
差向异构酶(Hericium erinaceus GalE，HeGalE)，并配置所需的四种缓冲液：①平衡缓冲
液：“PBS”buffer，pH7.4，②清洗缓冲液：“PBS”buffer，pH7.4with 20mM，50mM and 80mM 
imidazole，③洗脱缓冲液：“PBS”buffer，pH7.4 with 500mM imidazole，制样SDS‑PAGE分
析，④透析缓冲液：“PBS”buffer，pH7.4 with 300mM NaCl，10％Glycerol，1mM PMSF。

[0145] 纯化过程如下：

[0146] 1.用平衡缓冲液冲洗镍柱5次，1ml/次；

[0147] 2.进样，进样体积为4～5ml；

[0148] 3.用清洗缓冲液冲洗镍柱6次，1ml/次，用清洗缓冲液冲洗镍柱时，浓度从低到高，每个浓度连续洗2次；

[0149] 4.再用洗脱缓冲液冲洗镍柱2次，1ml/次，收集滤液即为所需蛋白洗脱样；

[0150] 5.纯化分离后用平衡缓冲液清洗柱子5次，1ml/次；

[0151] 6.最后，加入2ml平衡缓冲液，浸泡柱子，盖好盖子保存。

[0152] 7.将蛋白洗脱样透析至透析缓冲液中，有沉淀产生后过滤除菌。蛋白透析SDS‑PAGE结果如图8所示，泳道M：Protein Marker；泳道S：蛋白透析样。由图可知，在利用透析缓
冲液对蛋白洗脱样进行透析后，杂蛋白条带和浓度明显降低，目的蛋白达到95％纯度。

[0153] 纯化过程其它条件保持与上述条件一致，区别在于使用清洗缓冲液冲洗镍柱2次，清洗缓冲液为：“PBS”buffer，pH7.4 with 20mM imidazole(咪唑)；再用洗脱缓冲液“PBS”
buffer，pH7.4 with 500mM imidazole，冲洗镍柱1次。SDS‑PAGE结果如图9所示，结果显示，
目的蛋白得率及纯度远低于优化后的实验结果。

[0154] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。