一种调控N-乙酰神经氨酸产量提高的重组枯草芽孢杆菌

摘要

本发明公开了一种调控N‑乙酰神经氨酸产量提高的重组枯草芽孢杆菌，属于枯草芽孢杆菌代谢工程和基因工程技术领域。本发明所述重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是以低产N‑乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌菌株作为出发菌株，通过正向响应N‑乙酰神经氨酸的生物传感器调控必需基因表达来偶联生长与合成，构建了一种细胞亚群调控回路，从而赋予高产细胞亚群生长优势，提高其在发酵过程中所占的比例，从而得到的一株高产N‑乙酰神经氨酸的重组菌株，其产量达到2.97g/l，是不进行细胞亚群调控的对照菌株的1.55倍。这为枯草芽孢杆菌代谢工程高效生产N‑乙酰神经氨酸奠定了基础。

权利要求

1.细胞亚群调控回路，其特征在于，为（a）或（b）或（c）：

（a）以pHT01为载体骨架，含有阻遏蛋白lac I表达框、IPTG诱导型启动子Pgrac2、RBS0、转录调控蛋白nanR的编码基因、整合有转录调控蛋白nanR结合序列的组成型启动子Pveg105、RBS1和必需基因folB；所述IPTG诱导型启动子Pgrac2和RBS0调控转录调控蛋白nanR表达；所述启动子Pveg105和RBS1调控必需基因folB表达；所述lac I表达框和启动子Pgrac2转录方向相反，启动子Pgrac2和Pveg105转录方向相对；调控转录调控蛋白nanR的编码基因和必须基因folB之间具有一个双向终止子；

（b）以pHT01为载体骨架，含有阻遏蛋白lac I表达框、IPTG诱导型启动子Pgrac2、RBS0、转录调控蛋白nanR的编码基因、整合有转录调控蛋白nanR结合序列的组成型启动子Pveg105，RBS1和必需基因ftsW；所述IPTG诱导型启动子Pgrac2和RBS0调控转录调控蛋白nanR表达；所述启动子Pveg105和RBS1调控必需基因ftsW表达；所述lac I表达框和启动子Pgrac2转录方向相反，启动子Pgrac2和Pveg105转录方向相对；调控转录调控蛋白nanR的编码基因和必须基因ftsW之间具有一个双向终止子；

（c）以pHT01为载体骨架，含有阻遏蛋白lac I表达框、IPTG诱导型启动子Pgrac2、RBS0、转录调控蛋白nanR的编码基因、整合有转录调控蛋白nanR结合序列的组成型启动子Pveg105、N端编码序列N1和必需基因ftsW；所述IPTG诱导型启动子Pgrac2和RBS0调控转录调控蛋白nanR表达；所述启动子Pveg105和必须基因ftsW之间依次设置RBS0和N端编码序列N1，所述启动子Pveg105、RBS0和N端编码序列N1调控必需基因ftsW表达；所述lac I表达框和启动子Pgrac2转录方向相反，启动子Pgrac2和Pveg105转录方向相对；调控转录调控蛋白nanR的编码基因和必须基因ftsW之间具有一个双向终止子；

所述启动子Pveg105的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示；RBS0的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；RBS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述N端编码序列N1的序列如SEQ ID NO.11所示；所述必需基因folB的核苷酸序列如SEQ NO.9所示；必需基因ftsW的核苷酸序列如SEQ NO.10所示。

2.权利要求1所述的细胞亚群调控回路在提高N‑乙酰神经氨酸产量方面的应用。

3.一种提高枯草芽孢杆菌生产N‑乙酰神经氨酸能力的方法，其特征在于，缺失所述枯草芽孢杆菌基因组的必需基因folB或ftsW，再将权利要求1所述的细胞亚群调控回路转化至枯草芽孢杆菌细胞中。

4.含有权利要求1所述细胞亚群调控回路的重组枯草芽孢杆菌。

5.权利要求1所述细胞亚群调控回路或权利要求4所述的重组枯草芽孢杆菌在N‑乙酰神经氨酸的生产中的应用。

说明书

一种调控N‑乙酰神经氨酸产量提高的重组枯草芽孢杆菌

技术领域

[0001] 本发明涉及一种调控N‑乙酰神经氨酸产量提高的重组枯草芽孢杆菌，属于枯草芽孢杆菌代谢工程和基因工程技术领域。

背景技术

[0002] 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在工业上应用十分广泛，在生产蛋白和高附加值化合物的生产上具有非常重要的地位。同时，它是一种非致病微生物，已经被美国食品和药物管理局(FDA)认可为安全的(GRAS)食品级微生物。此外，枯草芽孢杆菌具有许多优点，包括：细胞生长速率快，发酵培养时间短，培养条件要求低，易于进行代谢工程改造，分泌蛋白质能力强等。N‑乙酰神经氨酸(NeuAc)又名唾液酸，燕窝酸，是一种重要的营养添加剂和药物中间体，在促进婴儿大脑发育，维持大脑健康和增强免疫力方面发挥着关键作用。

[0003] 目前虽然在代谢工程改造中已有很多策略用于改善目标产物的生物合成，比如酶活性和表达水平优化、阻断竞争途径、中心代谢流重构等，但是这些策略都没有考虑到单细胞水平上生物合成能力的差异。随着单细胞检测技术的发展，研究表明由一个单克隆细胞发展而来的群体存在异质性，即在发酵过程中存在生产亚群、非生产亚群等。生产亚群因生产负担常常表现为降低的适应能力，然而，非生产亚群消耗营养物质却不能高效合成目标产物，可能将更多的营养物质用于生长，因此更加具有生长优势。因此，在发酵过程中，生产亚群会非生产细胞亚群所占的比例会逐步增加，从而占据整个生物反应器，降低产物合成的综合效率。目前还未有利用细胞自身的异质性改善枯草芽孢杆菌生物合成的先例。因此，此株高产NeuAc枯草芽孢杆菌菌株的构建不仅为高附加值化合物NeuAc发酵法大规模生产奠定了基础，还为枯草芽孢杆菌的代谢工程改造提供新的有效方法。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种调控重组枯草芽孢杆菌N‑乙酰神经氨酸产量提高的方法。本发明利用可以正向响应N‑乙酰神经氨酸的生物传感器调控必需基因表达，构建一种细胞亚群调控回路，偶联生长与合成，从而赋予高产细胞亚群生长优势，提高其在发酵过程中所占的比例而提高NeuAc的产量。

[0005] 本发明的第一个目的是提供细胞亚群调控回路，含有响应N‑乙酰神经氨酸的生物传感器和必需基因；

[0006] 所述响应N‑乙酰神经氨酸的生物传感器包括：IPTG诱导型启动子Pgrac2、转录调控蛋白nanR的编码基因、整合有转录调控蛋白nanR结合序列的组成型启动子Pveg105、必需基因；所述IPTG诱导型启动子Pgrac2调控转录调控蛋白nanR表达；所述启动子Pveg105调控必需基因表达；所述启动子Pgrac2和Pveg105转录方向相反；

[0007] 所述必需基因包括但不限于二氢蝶呤醛缩酶基因folB和SEDS家族肽聚糖糖基转移酶基因ftsW。

[0008] 在一种实施方式中，所述细胞亚群调控回路还含有阻遏蛋白lac I表达框；所述阻遏蛋白lac I表达框的转录方向与启动子Pgrac2的转录方向相反。

[0009] 在一种实施方式中，所述细胞亚群调控回路以pHT01为载体骨架。

[0010] 在一种实施方式中，所述细胞亚群调控回路以pHT01为载体骨架，含有阻遏蛋白lac I表达框、IPTG诱导型启动子Pgrac2、RBS0、转录调控蛋白nanR的编码基因、整合有转录调控蛋白nanR结合序列的组成型启动子Pveg105、RBS1和必需基因folB；所述IPTG诱导型启动子Pgrac2和RBS0调控转录调控蛋白nanR表达；所述启动子Pveg105和RBS1调控必需基因folB表达；所述lac I表达框和启动子Pgrac2转录方向相反，启动子Pgrac2和Pveg105转录方向相对；调控转录调控蛋白nanR的编码基因和必须基因folB之间具有一个双向终止子。

[0011] 在一种实施方式中，所述细胞亚群调控回路以pHT01为载体骨架，含有阻遏蛋白lac I表达框、IPTG诱导型启动子Pgrac2、RBS0、转录调控蛋白nanR的编码基因、整合有转录调控蛋白nanR结合序列的组成型启动子Pveg105，RBS1和必需基因ftsW；所述IPTG诱导型启动子Pgrac2和RBS0调控转录调控蛋白nanR表达；所述启动子Pveg105和RBS1调控必需基因ftsW表达；所述lac I表达框和启动子Pgrac2转录方向相反，启动子Pgrac2和Pveg105转录方向相对；调控转录调控蛋白nanR的编码基因和必须基因ftsW之间具有一个双向终止子。

[0012] 在一种实施方式中，所述细胞亚群调控回路包括pHT01载体骨架、阻遏蛋白lac I表达框、IPTG诱导型启动子Pgrac2、RBS0、转录调控蛋白nanR的编码基因、整合有转录调控蛋白nanR结合序列的组成型启动子Pveg105、N端编码序列N1和必需基因ftsW；所述IPTG诱导型启动子Pgrac2和RBS0调控转录调控蛋白nanR表达；所述启动子Pveg105和必须基因ftsW之间依次设置RBS0和N端编码序列N1，所述启动子Pveg105、RBS0和N端编码序列N1调控必需基因ftsW表达；所述lac I表达框和启动子Pgrac2转录方向相反，启动子Pgrac2和Pveg105转录方向相对；调控转录调控蛋白nanR的编码基因和必须基因ftsW之间具有一个双向终止子。

[0013] 在一种实施方式中，pHT01载体骨架的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

[0014] 在一种实施方式中，所述lac I表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

[0015] 在一种实施方式中，所述IPTG诱导型启动子Pgrac2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，RBS0的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；编码转录调控蛋白nanR的基因序列如SEQ ID NO.5所示。

[0016] 在一种实施方式中，启动子Pveg105的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；RBS1的碱基序列如SEQ ID NO.8所示。

[0017] 在一种实施方式中，必需基因folB的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

[0018] 在一种实施方式中，必需基因ftsW的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

[0019] 在一种实施方式中，必需基因folB的N端序列N1如SEQ ID NO.11所示

[0020] 本发明的第二个目的是提供一种调控重组枯草芽孢杆菌提高N‑乙酰神经氨酸产量的方法，是通过细胞亚群调控回路将受调控的细胞的生长和产物合成偶联，促进生产细胞亚群，抑制非生产细胞亚群。

[0021] 在一种实施方式中，所述方法通过缺失所述重组枯草芽孢杆菌的必需基因folB或ftsW，再将所述细胞亚群调控回路转化至枯草芽孢杆菌细胞中。

[0022] 在一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以低产N‑乙酰神经氨酸的重组菌株BgG‑N abrB‑30bp作为出发菌株，所述重组菌株BgG‑N abrB‑30bp的构建方法公开于Tian R,Liu Y,Chen J,et al.Synthetic N‑terminal coding sequences for fine‑tuning gene expression and metabolic engineering in Bacillus subtilis.Metab Eng.中。

[0023] 本发明的第三个目的是提供含有所述细胞亚群调控回路的重组枯草芽孢杆菌。

[0024] 本发明还要求保护所述细胞亚群调控回路或所述重组枯草芽孢杆菌在N‑乙酰神经氨酸的生产中的应用。

[0025] 有益效果：本发明构建了一种细胞亚群调控回路，通过正向响应N‑乙酰神经氨酸的生物传感器调控必需基因表达来偶联生长与合成，从而赋予高产细胞亚群生长优势，提高其在发酵过程中所占的比例，从而得到的一株高产N‑乙酰神经氨酸的重组菌株，其产量可达到2.97g/l，是不进行细胞亚群调控的对照菌株的1.55倍。

附图说明

[0026] 图1为细胞亚群调控回路结构示意图。

[0027] 图2为细胞亚群调控回路生长与合成偶联的效果。

具体实施方式

[0028] 重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵：

[0029] 种子液培养基配方为：10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉；发酵培养基配方为：40g/L葡萄糖，12g/L酵母粉，6g/L胰蛋白胨，6g/L硫酸铵，12g/L三水合磷酸氢二钾，2.5g/L磷酸二氢钾，3g/L硫酸镁，6g/L尿素；

[0030] 发酵过程为：挑取单菌落至有1.5ml发酵培养基(含有合适的抗生素，实验组根据需要添加0.1mM的IPTG或者2g/l NeuAc，对照组不添加IPTG)的24孔板中，于37℃、220rpm发酵60小时。

[0031] 样品检测方法：首先，将发酵液离心后取上清，加入两倍体积35mM稀硫酸去除胞外蛋白。之后，使用离心机在1400rpm离心10min后，用0.22μm滤膜过滤后，使用液相色谱column(300×7.8mm)有机酸柱，检测波长为210nm。流动相采用10mM稀硫酸，流速为0.5mL/min柱温为40摄氏度。

[0032] 实施例1细胞亚群调控回路1.1质粒构建

[0033] (1)以质粒pHT01‑grac2序列(如SEQ ID NO.12)作为模板，以fp‑HI2G‑8k‑f和fp‑HI2G‑8k‑r为引物，PCR扩增获得带有lac I表达框和IPTG诱导型启动子Pgrac2的pHT01载体骨架；

[0034] fp‑HI2G‑8k‑r：GTGTACATTTCACCTCCTTTGGGGTTG；

[0035] fp‑HI2G‑8k‑f：TTCACGTCACGCGTCCATGGAGATCTTTG；

[0036] (2)以响应N‑乙酰神经氨酸的生物传感器质粒Bbl‑veg105(如SEQ ID NO.13)作为模板，以HI2Vfol‑0.4k‑2f和HI2Vfol‑0.4k‑2r为引物，PCR扩增获得有nanR结合位点的启动子Pveg105片段；

[0037] HI2Vfol‑0.4k‑1f：AAACGATATACCTTTATACCTGTTATACCATTGTACAACACGAGC；

[0038] HI2Vfol‑0.4k‑1r：

[0039] CAAAGATCTCCATGGACGCGTGACGTGAAGTTTCGTGCCGGTGAACTACTCG；

[0040] (3)以HI2Vfol‑0.4k‑2f和HI2Vfol‑0.4k‑2r为引物，对野生型枯草芽孢杆菌168进行菌落PCR，扩增获得SEQ ID NO.9所示的必需基因folB片段；

[0041] HI2Vfol‑0.4k‑2f：

[0042] CCTCTGCAGGTTTTTTCTGGCTCCATCATGACTTTTTTCTCGTAATTTCAATTGCTACTGAT；

[0043] HI2Vfol‑0.4k‑2r：

[0044] TGGTATAACAGGTATAAAGGTATATCGTTTGGAGAGCTAGCCTATGGATAAAGTTTATGTAGAAGGTATGGAGTTTTACGGA；

[0045] (4)以响应N‑乙酰神经氨酸的生物传感器质粒Bbl‑veg105序列(如SEQ ID NO.11)作为模板，以HI2Vfol‑1k‑3f和HI2Vfol‑1k‑3r为引物，PCR扩增获得SEQ ID NO.5所示的编码nanR蛋白的基因片段；

[0046] HI2Vfol‑1k‑3f：

[0047] CAACCCCAAAGGAGGTGAAATGTACACATGGGCCTTATGAACGCATTTGATTC；

[0048] HI2Vfol‑1k‑3r：TGGAGCCAGAAAAAACCTGCAGAGG；

[0049] 将上述4个片段纯化回收，利用Gibson Assembly Clonging Kit(New England Biolabs)进行连接，构建细胞亚群调控回路1.1，待平板上长出转化子后，通过菌落PCR和测序，确认其构建成功。在构建好的细胞亚群调控回路1.1中，IPTG诱导型启动子Pgrac2和RBS0调控转录调控蛋白nanR表达；启动子Pveg105和RBS1调控必需基因folB表达；lac I表达框和启动子Pgrac2转录方向相反，启动子Pgrac2和Pveg105转录方向相对。

[0050] 实施例2细胞亚群调控回路1.2质粒构建

[0051] (1)以质粒pHT01‑grac2(如SEQ ID NO.12)作为模板，以fp‑HI2G‑8k‑f和fp‑HI2G‑8k‑r为引物，PCR扩增带有lac I表达框和IPTG诱导型启动子Pgrac2的pHT01载体骨架；

[0052] fp‑HI2G‑8k‑r：GTGTACATTTCACCTCCTTTGGGGTTG；

[0053] fp‑HI2G‑8k‑f：TTCACGTCACGCGTCCATGGAGATCTTTG；

[0054] (2)以响应N‑乙酰神经氨酸的生物传感器质粒Bbl‑veg105序列(如SEQ ID NO.13)作为模板，以HI2Vfol‑0.4k‑1f和HI2Vfol‑0.4k‑1fr为引物PCR扩增获得含有nanR结合位点的启动子veg105片段(如SEQ ID NO.7所示)；

[0055] HI2Vfol‑0.4k‑1f：AAACGATATACCTTTATACCTGTTATACCATTGTACAACACGAGC；

[0056] HI2Vfol‑0.4k‑1r：

[0057] CAAAGATCTCCATGGACGCGTGACGTGAAGTTTCGTGCCGGTGAACTACTCG；

[0058] (3)以HI2VftsW‑1.2‑2f和HI2VftsW‑1.2‑2r为引物，对野生型枯草芽孢杆菌168进行菌落PCR，扩增获得SEQ ID NO.10所示的必需基因ftsW片段；

[0059] HI2VftsW‑1.2‑2f：

[0060] CCTCTGCAGGTTTTTTCTGGCTCCATTACAGATAAACAGTTTTTTTGAGCTGTTTCTTTTTCATTCCCT；

[0061] HI2VftsW‑1.2‑2r：

[0062] GGTATAACAGGTATAAAGGTATATCGTTTGGAGAGCTAGCCTATGTTAAAAAAAATGCTAAAATCTTATGATTACTCACTGATATTCGCA；

[0063] (4)以响应N‑乙酰神经氨酸的生物传感器质粒Bbl‑veg105序列(如SEQ ID NO.13)作为模板，以HI2Vfol‑1k‑3f和HI2Vfol‑1k‑3r为引物，PCR扩增获得SEQ ID NO.5所示的编码nanR蛋白的基因片段；

[0064] HI2Vfol‑1k‑3f：

[0065] CAACCCCAAAGGAGGTGAAATGTACACATGGGCCTTATGAACGCATTTGATTC；

[0066] HI2Vfol‑1k‑3r：TGGAGCCAGAAAAAACCTGCAGAGG；

[0067] 将上述4个片段纯化回收，利用Gibson Assembly Clonging Kit(New England Biolabs)进行连接，构建细胞亚群调控回路1.2，待平板上长出转化子后，通过菌落PCR和测序，确认其构建成功。在构建好的细胞亚群调控回路1.1中，IPTG诱导型启动子Pgrac2和RBS0调控转录调控蛋白nanR表达；启动子Pveg105和RBS1调控必需基因ftsW表达；lac I表达框和启动子Pgrac2转录方向相反，启动子Pgrac2和Pveg105转录方向相对。

[0068] 实施例3细胞亚群调控回路1.3质粒构建

[0069] 2HI2VftsW‑N4‑10f：

[0070] ACGAGTTCAATGACAACGCGATCACCTAATGGCTTTAACAAAGGCTAGCCTCCTAAACGATATACCTTTATACCTGTTATACCATTGTAC；

[0071] 2HI2VftsW‑N4‑10r：

[0072] ATCGCGTTGTCATTGAACTCGTAGAATTAAAAAAAATGCTAAAATCTTATGATTACTCACTGATATTCGCA；

[0073] 以实施例2获得的测序正确的质粒作为模板，以2HI2VftsW‑N4‑10f和2HI2VftsW‑N4‑10r为引物，PCR扩增细胞亚群调控回路1.3，纯化后直接转入大肠杆菌JM109，待平板上长出转化子后，通过菌落PCR和测序，确认其构建成功。

[0074] 在构建好的细胞亚群调控回路1.3中，IPTG诱导型启动子Pgrac2和RBS0调控转录调控蛋白nanR表达；启动子Pveg105、RBS0和N端编码序列N1调控必需基因ftsW表达；lac I表达框和启动子Pgrac2转录方向相反，启动子Pgrac2和Pveg105转录方向相对。

[0075] 实施例4构建敲除基因组上必需基因拷贝的敲除框

[0076] 1、构建fol敲除框

[0077] (1)利用引物qc‑folB‑1.2k‑1f和qc‑folB‑1.2k‑1r对野生型枯草芽孢杆菌168进行菌落PCR，扩增获得fol1片段；

[0078] qc‑folB‑1.2k‑1f：AGCTAGAAGCTCTCTTGACAGCT；

[0079] qc‑folB‑1.2k‑1r：

[0080] GTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCTTGCTTAAATCCAGCTCAGCGGT；

[0081] (2)以质粒P7S6为模板，以3p7s6‑1.3f和3p7s6‑1.3r为引物，PCR扩增获得fol2片段

[0082] 3p7s6‑1.3f：GAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAAC；

[0083] 3p7s6‑1.3r：TAACGCCAGGGTTTTCCCAGTC；

[0084] (3)以qc‑folB‑1.2k‑3f和qc‑folB‑1.2k‑3r为引物，对野生型枯草芽孢杆菌进行菌落PCR，扩增获得fol3片段。

[0085] qc‑folB‑1.2k‑3f：

[0086] GACTGGGAAAACCCTGGCGTTAACCTTGAGCAAACGATCAACTATGCT；

[0087] qc‑folB‑1.2k‑3r：CTCCCGCATCGCATTTTGTAATCT；

[0088] (4)纯化fol1、fol2和fol3片段，最后通过融合PCR的方式，将三个片段融合后扩增，构建fol敲除框。

[0089] 2、构建fts敲除框

[0090] (1)以qc‑FtsW‑1k‑1f和qc‑FtsW‑1k‑1r为引物，对野生型枯草芽孢杆菌进行菌落PCR，扩增获得fts1片段；

[0091] qc‑FtsW‑1k‑1f：GGAAGTGGCTGAATCTGAATACAGCACTTCAATGA；

[0092] 2qc‑FtsW‑1k‑1r：CGCTCAACATCCTCTTCCCTGCTTCTAACTTCCATTATCT；

[0093] (2)以质粒P7S6为模板，以qc‑FtsW‑1.3‑2f和qc‑FtsW‑1.3‑2r为引物，PCR扩增获得fts2片段；

[0094] qc‑FtsW‑1.3‑2f：

[0095] AGTTAGAAGCAGGGAAGAGGATGTTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGC；

[0096] qc‑FtsW‑1.3‑2r：

[0097] GGATGGCAATCATGCTTGAAATGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC；

[0098] (3)以2qc‑FtsW‑1.1k‑3f和2qc‑FtsW‑1.1k‑3r为引物，对野生型枯草芽孢杆菌168进行菌落PCR，扩增获得fts3片段。

[0099] 2qc‑FtsW‑1.1k‑3f：CTGGCGTTACATTTCAAGCATGATTGCCATCCAGTCGT；

[0100] qc‑FtsW‑1.1k‑3r：CCTCACAAATTTGGTCCCTTAATTCAGGTGACAG；

[0101] (4)纯化fts1、fts2和fts3片段，最后通过融合PCR的方式，将三个片段融合后扩增，构建fts敲除框。

[0102] 实施例5细胞亚群调控回路对菌株生长与合成的偶联调控

[0103] (1)利用引物cr‑nanT‑1.3k‑1f和cr‑nanT‑1.3k‑1r对枯草芽孢杆菌BgG‑N abrB‑30b(构建方法公开于论文《Synthetic N‑terminal coding sequences for fine‑tuning gene expression and metabolic engineering in Bacillus subtilis》中)进行菌落PCR，扩增获得nanT1片段；

[0104] cr‑nanT‑1.3k‑1f：gagtacttaaacacaaatcgtgacggct；

[0105] cr‑nanT‑1.3k‑1r：tgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcaagctgtccggcaacatcag；

[0106] (2)以质粒P7ZP43(序列如：如SEQ ID NO.14)为模板，以p7ZP43‑1.5f和p7ZP43‑1.5r为引物，PCR扩增获得nanT2片段；

[0107] p7ZP43‑1.5f：gagcggataacaatttcacacaggaaaca；

[0108] p7ZP43‑1.5r：gtgtacattcctctcttacctataatggtaccg；

[0109] (3)以cr‑nanT‑1.5k‑3f和cr‑nanT‑1.5k‑3r为引物，对大肠杆菌进行菌落PCR，扩增获得nanT3片段。

[0110] cr‑nanT‑1.5k‑3f：cggtaccattataggtaagagaggaatgtacacatgagtactacaacccagaatatcccgt；

[0111] cr‑nanT‑1.5k‑3r：

[0112] cgggatttcccggcagtctgacaagttattctgcaatagacacttttccttaacttttggttttgactaaatcgtttttggcg；

[0113] (4)以cr‑nanT‑1.3k‑4f和cr‑nanT‑1.3k‑4r为引物，对枯草芽孢杆菌BgG‑N abrB‑30bp进行菌落PCR，扩增获得nanT4片段。

[0114] cr‑nanT‑1.3k‑4f：gaataacttgtcagactgccgggaaatcccggcagtcttttttccattgcctgcaagcttttccagct；

[0115] cr‑nanT‑1.3k‑4r：acactcgtagccatcctagttatcact；

[0116] (5)纯化nanT1、nanT2、nanT3和nanT4片段，最后通过融合PCR的方式，将四个片段融合后扩增，构建nanT整合框，随后将其转入枯草芽孢杆菌BgG‑N abrB‑30bp，获得重组枯草芽孢杆菌BgG‑N abrB‑30bp‑nanT。

[0117] 将实施例1构建的细胞亚群调控回路1.1质粒转入BgG‑N abrB‑30bp‑nanT中，然后利用fol敲除框将其基因组上的必需基因folB拷贝敲除，构建含有细胞亚群调控回路1.1的重组枯草芽孢杆菌细胞；

[0118] 将细胞亚群调控回路1.2质粒和1.3质粒分别转入异源表达nanT的枯草芽孢杆菌BgG‑N abrB‑30bp，然后利用fts敲除框将其基因组上的必需基因ftsW拷贝敲除，构建含有细胞亚群调控回路1.2或1.3的重组枯草芽孢杆菌细胞。

[0119] 挑取带有细胞亚群调控回路1.1、1.2或1.3的重组枯草芽孢杆菌的单菌落于有1.5ml发酵培养基的24孔板中，于37℃、220rpm发酵48小时，监测菌株生长，检测生长与合成偶联效果。两个实验组：一个实验组在培养基中添加0.1mM IPTG，一个实验组在培养基中添加0.1mM IPTG和2g/l NeuAc；一个对照组：不添加IPTG。因为枯草芽孢杆菌自身不能将胞外的N‑乙酰神经氨酸转运进胞内，所以在验证偶联效果时异源表达了来源于大肠杆菌的转运蛋白nanT。结果如图2所示，添加IPTG后，在不添加N‑乙酰神经氨酸的环境中细胞生长受到抑制，添加N‑乙酰神经氨酸可以使细胞恢复生长，这表明细胞生长与N‑乙酰神经氨酸的合成成功偶联，细胞亚群调控回路可以赋予生产细胞亚群生长优势。

[0120] 实施例6细胞亚群调控对NeuAc合成的影响

[0121] 将实施例1构建的细胞亚群调控回路1.1质粒转入枯草芽孢杆菌BgG‑N abrB‑30bp(构建方法公开于论文《Synthetic N‑terminal coding sequences for fine‑tuning gene expression and metabolic engineering in Bacillus subtilis》中)，然后利用实施例5构建的fol敲除框将其基因组上的必需基因folB拷贝敲除，构建含有细胞亚群调控回路1.1的重组枯草芽孢杆菌；将细胞亚群调控回路1.2质粒和1.3质粒分别转入枯草芽孢杆菌BgG‑N abrB‑30bp，然后利用fts敲除框将其基因组上的必需基因ftsW拷贝敲除，构建含有细胞亚群调控回路1.2或1.3的重组枯草芽孢杆菌。随后挑取带有细胞亚群调控回路1.1、1.2和1.3的单菌落于有1.5ml发酵培养基(添加有终浓度为0.1mM的IPTG)的24孔板中，于37℃、220rpm发酵60小时。以不添加IPTG作为对照。

[0122] 表1细胞亚群调控回路对NeuAc合成的影响

[0123]

[0124] 结果显示，利用生物传感器调控必需基因表达后，不进行细胞亚群调控的对照菌对应的NeuAc的产量约为1.9g/L，经过细胞亚群调控的NeuAc产量可提高至2.70～2.97g/L。

[0125] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。