检测SNP位点的试剂在预测器官移植术后肾功能损伤情况中的应用

摘要

一种检测器官移植术后肾功能损伤情况的试剂盒，本发明涉及SNP领域。本发明提供了一种检测肾功能损伤情况的试剂盒，它包括任选的用于检测MTHFD2L基因rs28588511变异和/或rs1246576变异的相关试剂。本发明还提供了MTHFD2L基因rs28588511变异和/或rs1246576变异在制备预测器官移植术后肾功能损伤情况的试剂盒的应用。本发明首次阐明了MTHFD2L基因rs28588511位点和rs1246576位点多态性与器官移植术后肾功能损伤情况的相关性。使用本发明提供的试剂盒，可以预测器官移植术后患者的肾功能损伤情况，对指导器官移植后患者的恢复有重要作用。

权利要求

1.MTHFD2L基因rs28588511变异在制备用于检测器官移植术后肾功能损伤情况的试剂中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的试剂包括检测MTHFD2L基因rs28588511A→C变异的试剂；所述试剂还包括任选的用于扩增包含MTHFD2L基因rs28588511的基因片段的试剂。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述的检测MTHFD2L基因rs28588511A→C变异的试剂为Snapshot试剂。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述的检测MTHFD2L基因rs28588511A→C变异的试剂为测序用试剂。

5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述的检测MTHFD2L基因rs28588511A→C变异的试剂为限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。

说明书

检测SNP位点的试剂在预测器官移植术后肾功能损伤情况中

的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及检测MTHFD2L基因rs28588511位点及rs1246576位点在制备预测器官移植术后肾功能损伤情况的试剂盒中的应用。

背景技术

[0002] 器官移植(transplantation)是将健康者的器官移植给有器官病变并丧失功能的患者，包括了肾移植、肝移植、心脏移植等。就肾移植而言，人体有左右两个肾脏，通常一个肾脏就可以支持正常的代谢需求，当双侧肾脏功能均丧失时，器官移植是最理想的治疗方法，当慢性肾功能不全发展至终末期，可用器官移植方法治疗。器官移植因其器官来源不同分为自体器官移植、同种异体器官移植和异种器官移植，习惯把同种异体器官移植简称为器官移植。其他两种器官移植则冠以“自体”或“异种”器官移植以资区别。

[0003] 器官移植是治疗终末期器官功能丧失的有效方法之一。据统计，我国2017年年度器官移植数为1.6万例次，为全球第二，但缺口在30万以上。器官移植术后病人的长期存活有赖于长期甚至终生服用免疫抑制剂(如他克莫司)，但即使使用了免疫抑制剂，术后病人的器官功能修复也存在差异，如发生急性和慢性排斥，或者免疫抑制剂导致的不良反应等。其中肾功能损伤是器官移植术后长期用免疫抑制剂可能出现的一种重要的影响患者生存和临床治疗方案调整的个体化反应之一，并且不同个体对其反应不同。如果能够在移植前期对个体进行检测，预测其移植后出现肾功能损伤的风险，对个体治疗会有非常有效的指导。目前未见相关风险预测方法的报道。

[0004] 现有研究发现CXCL6(Ensembl:ENSG00000124875,MIM:138965)是ELR+CXC趋化因子中的重要成员，含有4个外显子和3个内含子，编码77个氨基酸，含1个α螺旋和3个反向平行的β折叠，主要由巨噬细胞、上皮细胞及间质细胞等分泌，具有趋化粒细胞、促血管生成、抗菌和调节免疫等功能。目前还没有关于能影响CXCL6表达的基因的报道，更没有关于影响肾功能的基因或单核苷酸多态性位点的报道，也未见SNP位点与器官移植术后肾功能损伤情况相关的现有技术。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种检测器官移植术后肾功能损伤情况的试剂盒，它包括任选的用于检测MTHFD2L基因rs28588511变异和/或rs1246576变异的相关试剂。

[0006] 进一步地，它包括检测MTHFD2L基因rs28588511A→C变异和/或rs1246576T→C变异的试剂；还包括任选的用于扩增包含MTHFD2L基因rs28588511和/或rs1246576的基因片段的试剂。

[0007] 更进一步地，所述的检测MTHFD2L基因rs28588511A→C变异和/或rs1246576T→C变异的试剂为Snapshot试剂。

[0008] 进一步地，所述的检测MTHFD2L基因rs28588511A→C变异和/或rs1246576T→C变异的试剂为测序用试剂。

[0009] 进一步地，所述的检测MTHFD2L基因rs28588511A→C变异和/或rs1246576T→C变异的试剂为限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。

[0010] 本发明还提供了一种MTHFD2L基因rs28588511变异和/或rs1246576变异在制备用于检测器官移植术后肾功能损伤情况的试剂中的用途。

[0011] 进一步地，所述的试剂包括检测MTHFD2L基因rs28588511A→C变异和/或rs1246576T→C变异的试剂；所述试剂还包括任选的用于扩增包含MTHFD2L基因rs28588511和/或rs1246576的基因片段的试剂。

[0012] 进一步地，所述的检测MTHFD2L基因rs28588511A→C变异和/或rs1246576T→C变异的试剂为Snapshot试剂。

[0013] 进一步地，所述的检测MTHFD2L基因rs28588511A→C变异和/或rs1246576T→C变异的试剂为测序用试剂。

[0014] 进一步地，所述的检测MTHFD2L基因rs28588511A→C变异和/或rs1246576T→C变异的试剂为限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。

[0015] 本发明基于研究发现位于基因MTHFD2L(Ensembl:ENSG00000163738,MIM:614047)内含子区域内的rs28588511及rs1246576位点与肾移植术后长期肾功能损伤显著相关，这些SNP位点可以影响MTHFD2L旁边的另一个基因CXCL6(Ensembl:ENSG00000124875,MIM:138965)的表达，从而通过诱导炎症反应引起最后的肾功能损伤。

[0016] 本发明提供了一种检测器官移植术后肾功能损伤情况的标志物和一种评估器官移植后肾功能损伤情况的试剂盒，能够实现准确评估器官移植术损伤情况；且能以血细胞作为检测样品，对患者伤害很低。本发明具备良好的应用前景。

[0017] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

[0018] 以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

[0019] 图1 rs28588511不同基因型的测序结果

[0020] 图2 rs1246576不同基因型的测序结果

具体实施方式

[0021] 实施例1本发明的检测试剂盒的组成及其使用方法

[0022] 本发明试剂盒中的全部组分、含量和使用方法如下：

[0023] 一、试剂盒组成

[0024] PCR扩增试剂(50人份)：

[0025]

[0026] Sanpshot分型检测试剂(50人份)：

[0027] 组分 浓度 体积Sanpshot Multiplex   60μl
碱性磷酸酶   150μl
限制性外切酶   50μl
Sanpshot引物混合物 2μM 50μl
纯化缓冲液   500μl

[0028] 标准DNA样品：

[0029]

[0030]

[0031] 二、试剂盒使用方法

[0032] 1.DNA提取

[0033] 以提取血液组织为例，对于能获取血液样本进行DNA抽提，步骤如下：

[0034] (1)往15ml离心管中加入1‑5ml血液样本，加入2倍体积的Buffer DC,上下颠倒混匀，4,000rpm离心10min，小心倒掉上清，再加入500μl Buffer BL1，震荡至彻底混匀，进行步骤2。

[0035] (2)向混合液中加入40μl Foregene Protease Plus，颠倒混匀，放置于65℃约10min。

[0036] (3)向混合液中，加入500μl Buffer BL2，涡旋混匀至分层消失，置于65℃放置10min，期间涡旋混匀数次，溶液应变清亮。

[0037] 注意：在温育过程中涡旋混匀数次，以保证细胞裂解充分。若溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可适当延长时间。样本储存条件不佳时，水浴或金属浴处理后颜色可能为深褐色，注意溶液中应无团块等沉淀。

[0038] (4)加入300μl无水乙醇，涡旋震荡混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

[0039] (5)将800μl混合液转移至离心柱(DNA‑Only Column)中，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，弃掉收集管中的废液。

[0040] 注意：如果混合液中出现絮状沉淀，请将沉淀一并转移至离心柱中。

[0041] (6)将离心柱放回收集管中，将剩余混合液全部加入离心柱中，12,000rpm(～13,400×g)，离心1min，弃掉收集管中的废液。

[0042] (7)往离心柱中加入500μl Buffer PW，12,000rpm(～13,400×g)离心30s‑1min，弃掉收集管中的废液。

[0043] (8)往离心柱中加入700μl Buffer WB1，12,000rpm(～13,400×g)离心30s‑1min，弃掉收集管中的废液。

[0044] (9)重复步骤8一次。

[0045] (10)将离心柱放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)空管离心1min。

[0046] (11)将离心柱移至新的2ml离心管中，向膜中央悬空滴加100μl已于65℃预热的Buffer EB(切勿将洗脱液添加到压圈上，否则会损失较大体积的洗脱液)，室温放置5min，12,000rpm(～13,400×g)离心1min。再次向膜中央悬空滴加100μl已预热的Buffer EB，12,
000rpm(～13,400×g)离心1min。将两次收集的洗脱液合并。

[0047] 注意：如果希望提高DNA的浓度，可将第1次离心得到的溶液重新加回离心柱中，12,000rpm(～13,400×g)离心1min。

[0048] 2.聚合酶链式反应(PCR)

[0049] PCR扩增采用Taq DNA Polymerase试剂。

[0050] (1)反应体系配置

[0051] PCR扩增反应体系如下所示：

[0052]

[0053] 对不同的SNP位点设计不同序列的引物，下表为几个典型的SNP引物[0054]

[0055] (2)扩增样本制备

[0056] 2.1.准备新拆封无粉医用乳胶手套，以及专用全套移液枪、枪头、PCR管、PCR管架、冰盒等。

[0057] 2.2.将除冰盒外，包括移液枪、枪头和PCR管架在内的器材放入生物安全柜内，向平台和器材表面喷洒DNAzap(Invitrogen)，关闭生物安全柜，并开启紫外灯照射15‑20分钟。

[0058] 2.3.关闭紫外灯，开启隔板，使用75％乙醇擦拭生物安全柜台面和器材表面。

[0059] 2.4.按照样本原液DNA浓度将其分别稀释至5‑20ng/μL，共10μL作为工作液，按编号存放于八联管中待用。

[0060] 2.5.按PCR扩增反应体系配制反应液。

[0061] 2.6.逐个取1μL待用DNA加入PCR反应体系内，另取Buffer EB 1μL加入PCR反应体系内作为阴性对照。

[0062] 2.7.将PCR实验组和对照组同时按照PCR仪操作要求进行扩增。

[0063] 2.8.整理实验台，样本原液存放至‑80℃，作为PCR底物的样本工作液，做好编号记录后存放至4℃保存。

[0064] (3)扩增程序设置

[0065] 在EPPENDORF nexus PCR仪和Bio‑Rad T100PCR仪上进行DNA扩增操作，按生产公司提供的操作手册依次进行：

[0066]

[0067] 3.检测SNP多态性(以第一代测序为例)

[0068] 对每个PCR扩增产物取2.5μL进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，将质量合格的PCR扩增产物和测序引物进行基于第一代测序技术(桑格测序)为基础的DNA测序，并用Chromas等软件进行序列和基因型分析。

[0069] 实施例2血细胞中SNP位点rs28588511与器官移植术后肾功能损伤的关系[0070] 一、样本收集

[0071] 从华西医院搜集了810例，从2009年6月到2017年10月接受亲属捐献的器官移植手术，并使用免疫抑制剂他克莫司的患者的血样。随后，搜集移植成功后患者术后每次查血的肌酐水平，并利用如下(表1)公式估算肾小球滤过率(eGFR)，从而评估患者术后的肾功能情况。

[0072] 表1肾小球滤过率估算公式

[0073]

[0074]

[0075] 根据患者每次检查的eGFR值，将患者的肾功能情况分为5个级别。

[0076] 0：eGFR>60越好

[0077] 1：eGFR 45‑60

[0078] 2：eGFR 30‑45

[0079] 3：eGFR 15‑30

[0080] 4：eGFR<15越差将0级视为术后肾功能正常，1‑4视为术后肾功能异常。排除掉了术后随访不足6个月或者信息采集点过少的样本(25例)，以及移植不成功的样本，比如，器官移植手术后肾功无法或延迟恢复的样本(术后6个月未恢复到eGFR>60；32例)等。最终，保留了385例患者进行器官移植术后肾功能损伤情况遗传相关性分析，其中，在54个肾功能异常患者，350个肾功能正常患者。

[0081] 获取血液样本，采用福际全基因组提取试剂盒进行DNA抽提，步骤如下：

[0082] 1)往15ml离心管中加入1‑5ml血液样本，加入2倍体积的Buffer DC,上下颠倒混匀，4,000rpm离心10min，小心倒掉上清，再加入500μl Buffer BL1，震荡至彻底混匀，进行步骤2。

[0083] 2)向混合液中加入40μl Foregene Protease Plus，颠倒混匀，放置于65℃约10min。

[0084] 3)向混合液中，加入500μl Buffer BL2，涡旋混匀至分层消失，置于65℃放置10min，期间涡旋混匀数次，溶液应变清亮。

[0085] 注意：在温育过程中涡旋混匀数次，以保证细胞裂解充分。若溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可适当延长时间。样本储存条件不佳时，水浴或金属浴处理后颜色可能为深褐色，注意溶液中应无团块等沉淀。

[0086] 4)加入300μl无水乙醇，涡旋震荡混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

[0087] 5)将800μl混合液转移至离心柱(DNA‑Only Column)中，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，弃掉收集管中的废液。

[0088] 注意：如果混合液中出现絮状沉淀，请将沉淀一并转移至离心柱中。

[0089] 6)将离心柱放回收集管中，将剩余混合液全部加入离心柱中，12,000rpm(～13,400×g)，离心1min，弃掉收集管中的废液。

[0090] 7)往离心柱中加入500μl Buffer PW，12,000rpm(～13,400×g)离心30s‑1min，弃掉收集管中的废液。

[0091] 8)往离心柱中加入700μl Buffer WB1，12,000rpm(～13,400×g)离心30s‑1min，弃掉收集管中的废液。

[0092] 9)重复步骤8一次。

[0093] 10)将离心柱放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)空管离心1min。

[0094] 11)将离心柱移至新的2ml离心管中，向膜中央悬空滴加100μl已于65℃预热的Buffer EB(切勿将洗脱液添加到压圈上，否则会损失较大体积的洗脱液)，室温放置5min，12,000rpm(～13,400×g)离心1min。再次向膜中央悬空滴加100μl已预热的Buffer EB，12,
000rpm(～13,400×g)离心1min。将两次收集的洗脱液合并。

[0095] 注意：如果希望提高DNA的浓度，可将第1次离心得到的溶液重新加回离心柱中，12,000rpm(～13,400×g)离心1min。

[0096] 二、基因型检测

[0097] 多态性的基因型分析可以用现有的SNP检测手段进行检测，如，测序方法、限制性片段长度多态性分析方法、单链构象多态性分析方法，Snapshot检测方法等。

[0098] 本发明采用测序方法进行检测：

[0099] 1、PCR扩增

[0100] 采用Genomic DNA Isolation Kit(购自成都福际生物有限公司)和普通Taq DNA polymerase(购自唯赞生物公司)，对提取到的血液样品DNA进行扩增。

[0101] 1.1扩增的引物如下：

[0102]

[0103] 1.2扩增的步骤如下：

[0104] a、扩增样本制备

[0105] ①.准备新拆封无粉医用乳胶手套，以及专用全套移液枪、枪头、PCR管、PCR管架、冰盒等。

[0106] ②将除冰盒外，包括移液枪、枪头和PCR管架在内的器材放入生物安全柜内，向平台和器材表面喷洒DNAzap(Invitrogen)，关闭生物安全柜，并开启紫外灯照射15‑20分钟。

[0107] ③关闭紫外灯，开启隔板，使用75％乙醇擦拭生物安全柜台面和器材表面。

[0108] ④按照样本原液DNA浓度将其分别稀释至5‑20ng/μL，共10μL作为工作液，按编号存放于八联管中待用。

[0109] ⑤按PCR扩增反应体系配制反应液。

[0110] ⑥逐个取1μL待用DNA加入PCR反应体系内，另取Buffer EB 1μL加入PCR反应体系内作为阴性对照。

[0111] ⑦将PCR实验组和对照组同时按照PCR仪操作要求进行扩增。

[0112] ⑧整理实验台，样本原液存放至‑80℃，作为PCR底物的样本工作液，做好编号记录后存放至4℃保存。

[0113] b、扩增程序设置

[0114] 在EPPENDORF nexus PCR仪和Bio‑Rad T100PCR仪上进行DNA扩增操作，按生产公司提供的操作手册依次进行：

[0115]

[0116] 2、测序

[0117] 对每个PCR扩增产物取2.5μL进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，将质量合格的PCR扩增产物送北京擎科生物科技有限公司进行测序；rs28588511不同基因型的测序结果见图1；rs1246576不同基因型的测序结果见图2。

[0118] 三、关联性分析

[0119] SNP位点多态性与肾功能恢复情况的关系：

[0120] 位于4号染色体p13.3上的rs28588511位点SNP变异(A→C)(即SNP rs28588511位点的碱基A突变为C)，与患者在2年时间点的肾功能损伤情况显著性相关：Fisher精确检验P‑8＝3.32×10 ；OR＝5。

[0121] 位于4号染色体p13.3上的rs1246576位点SNP变异(T→C)(即SNP rs1246576位点的碱基T突变为C)，与患者在2年时间点的肾功能损伤情况显著性相关：Fisher精确检验P＝‑83.32×10 ；OR＝5。

[0122] 实验证明4号染色体p13.3上的rs28588511位点和rs1246576位点的变异与肾功能损伤情况的相关性高，rs28588511位点和rs1246576位点出现变异，患者出现肾功能损伤的风险高，未出现变异则肾功能损伤的风险低，可用于预测器官移植成功后肾功能出现损伤的风险。