一株假单孢菌及其用途

摘要

本发明公开了一株假单孢菌及其用途，属于生物技术领域。本发明通过平板对峙实验、新生防菌株发酵液抑菌活性实验，从甘肃温室黄瓜根际微生物中分离、筛选出具有高效生防拮抗枯萎病菌株假单胞菌属菌株33‑1。该菌能较好的抑制病原菌生长，对黄瓜枯萎病病原菌尖孢镰刀菌黄瓜专化型菌株有较好的抑制作用，抑菌率可达76.4％，其发酵产物也能很好的抑制尖孢镰刀菌菌丝生长，抑制率可达80.65％。33‑1菌为假单胞菌，其分类学命名为弗雷德里克斯堡假单胞菌，已于2020年09月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.20833。

权利要求

1.一株假单胞菌(Pseudomonas frederiksbergensis)33‑1，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年09月27日，保藏编号为CGMCC No.20833。

2.如权利要求1所述的假单胞菌(Pseudomonas frederiksbergensis)33‑1在黄瓜枯萎病防治中的应用。

3.如权利要求1所述的假单胞菌(Pseudomonas frederiksbergensis)33‑1在促进黄瓜苗期生长中的应用。

4.一种菌剂，其包含权利要求1所述的假单胞菌(Pseudomonas frederiksbergensis)

33‑1。

5.如权利要求4所述的菌剂在黄瓜枯萎病防治中的应用。

6.如权利要求4所述的菌剂在促进黄瓜苗期生长中的应用。

说明书

一株假单孢菌及其用途

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其涉及一株假单孢菌及其用途。

背景技术

[0002] 黄瓜枯萎病(cucumber fusarium wilt)由尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)这一类真菌浸染，主要经土壤传播的维管束病害，露地和保
护地栽培黄瓜上均可发生，连作地区尤为严重，现已成为世界范围内影响黄瓜生产的毁灭
性土传病害。发病率可达20％‑30％，造成黄瓜产量下降，严重时可达80％‑90％，导致了黄
瓜的严重减产。目前，此病害己成为生产上制约黄瓜产量和品质的重要因素之一，而黄瓜是
日光温室反季节栽培的主要蔬菜种类，栽培面积已占日光温室生产面积的50％以上，所以
此病害也成为制约农业发展的重要因素。

[0003] 目前，对温室黄瓜枯萎病的防治则是使用化学农药，化学农药可以有效控制温室黄瓜枯萎病的发生，而长期使用化学农药所产生的农药残留不仅污染土壤和地下水，也危
害着人畜健康，而且随着内吸性杀菌剂大量使用，病菌易产生抗药性，防效会逐渐降低。因
此，亟需筛选出具有高效生防拮抗枯萎病的菌株。

发明内容

[0004] 本发明是针对现有技术的缺陷和不足，本发明提供了一株假单胞菌及其用途。

[0005] 本发明的目的一是提供从黄瓜根际土壤中分离的一株假单胞菌(Pseudomonas frederiksbergensis)33‑1，该菌株现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物
中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCCNo.20833，保藏时间2020年09
月27日。

[0006] 本发明的目的二是提供一株假单胞菌(Pseudomonas frederiksbergensis)33‑1的用途，用途一为该菌株用于黄瓜枯萎病的防治，用途二为促进黄瓜苗期生长。

[0007] 同时本发明还提供了包含该假单胞菌的菌剂的用途，用途一为该菌剂用于黄瓜枯萎病的防治，用途二为促进黄瓜苗期生长。

[0008] 假单胞菌属是植物根系、根际最丰富的细菌类群，其具有多样的生物活性，对植物的生长有促进作用，具有作为生防菌的有利条件，能很好的发挥生防作用。本发明从甘肃温
室黄瓜根际微生物中进行拮抗菌分离、筛选出具有高效生防拮抗枯萎病菌株假单胞菌属菌
株33‑1。经过形态观察、生理生化鉴定和16S rDNA分子鉴定最终确定该菌为弗雷德里克斯
堡假单胞菌(Pseudomonas frederiksbergensis)。

[0009] 菌株33‑1能较好的抑制病原菌生长，对黄瓜枯萎病病原菌尖孢镰刀菌黄瓜专化型菌株有较好的抑制作用，抑菌率可达76.4％，其发酵产物也能很好的抑制尖孢镰刀菌菌丝
生长，抑制率可达80.65％。室内盆栽防病效果试验结果表明，菌株33‑1能够较好抑制温室
黄瓜枯萎病，并且在室内对黄瓜苗期生长有一定的促进作用。

[0010] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明筛选出的33‑1属于假单胞菌属中的弗雷德里克斯堡假单胞菌，具有拮抗杀菌活性作用，并在黄瓜苗期防病、促生方面有
显著作用，在防治土传植物病害方面具有极大的潜力。菌株33‑1的菌液或者以菌株33‑1为
核心菌株的菌剂产品可应用于用于黄瓜枯萎病的防治及黄瓜苗期促生。

[0011] 保藏说明：

[0012] 保藏号：CGMCC No.20833

[0013] 分类学命名：弗雷德里克斯堡假单胞菌

[0014] 拉丁名：Pseudomonas frederiksbergensis

[0015] 菌株编号：33‑1

[0016] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

[0017] 保藏机构简称：CGMCC

[0018] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

[0019] 保藏日期：2020年09月27日。

附图说明

[0020] 图1为实施例2中拮抗菌株对尖孢镰刀菌的抑制效果图。

[0021] 图2为实施例2中拮抗菌发酵液对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制作用图。

具体实施方式

[0022] 下面结合具体实施实例对本发明进行详细说明。以下实施实例有助于此领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

[0023] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0024] 下述 实施 例中所 使 用的 尖 孢镰 刀菌黄 瓜专化 型 (Fus ar iu m oxysporumf.sp.cucumberinum)购于中国微生物菌种保藏中心。菌株33‑1分离筛选于甘肃
省武威市凉州区日光温室黄瓜根际土壤中,现保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通
微生物中心。供试药剂为50％多菌灵可湿性粉剂。

[0025] 下述实施例中所使用的其他材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0026] 实施例1

[0027] 高拮抗菌株33‑1菌株的分离及鉴定

[0028] 取5g土样(采自甘肃省武威市黄瓜温室土壤)放入三角瓶中，加入50ml无菌水，封口后于摇床震荡20min制成混悬液，吸取5ml加入100ml牛肉膏蛋白胨培养基中，28℃培养，
72h后吸取5ml菌液加入100ml牛肉膏蛋白胨培养基继续培养，重复培养三次后进行单菌落
分离。分离采用平板划线法与梯度稀释法：平板划线法即用接种环蘸取菌液在牛肉膏蛋白
‑2 ‑4 ‑6 ‑8
胨固体培养基上进行划线分离；梯度稀释法是将培养后的菌液按照10 、10 、10 、10 稀释
度用无菌水制成菌悬液后，吸取0.1ml在牛肉膏蛋白胨固体培养基上均匀涂布。涂布好的平
板于28℃静置培养，5‑7d后挑取单菌落用平板划线法进行菌种纯化。将分离纯化所得的其
中一个菌株命名为33‑1。

[0029] 对菌株33‑1进行形态学镜检及生理生化反应检测。参照《常见细菌系统鉴定手册》，对33‑1进行分类鉴定。生理生化反应检测结果见表1。

[0030] 表1菌株33‑1的部分生理生化特性

[0031] 测试项目 特性 测试项目 特性革兰氏 ‑ 明胶水解 +
甲基红 ‑ 4℃生长 +
淀粉水解 ‑ 产H2S ‑
过氧化氢酶 + 氧化酶 +
硝酸盐还原 + 5％Nacl ‑
V.P.试验 + 7％Nacl ‑

[0032] 注：“+”、“‑”分别代表阳性和阴性反应。

[0033] 平板菌落观察结果可见，菌株33‑1菌落圆形隆起，边缘整齐，湿润；通过镜检，菌株33‑1是革兰氏阴性菌，杆状，运动，不产芽胞；结合菌株生理生化反应结果，初步确认菌株
33‑1为假单孢属。

[0034] 菌株33‑1 16S rDNA的分子生物学鉴定。菌株33‑1的16S rDNA的测定由上海基康生物技术有限公司完成，测定结果如SEQ ID NO.1所示，将测序所得序列与NCBI数据库进行
blast比对后，鉴定33‑1为弗雷德里克斯堡假单胞菌(Pseudomonas frederiksbergensis)。

[0035] 实施例2

[0036] 菌株33‑1的抑菌作用测试

[0037] (1)将33‑1接种在牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，28℃恒温活化48h，活化后菌株接在牛肉膏蛋白胨平面培养基中，28℃恒温培养24h。将尖孢镰刀菌接种在PDA平面培养基中
26℃恒温活化96h。将尖孢镰刀菌均匀涂布在9cm的培养皿中，在培养皿中心放置内径为6mm
的牛津杯，牛津杯中加入33‑1菌悬液，在26℃恒温培养箱中培养，设空白对照CK(无菌水处
理)，供试菌设三次重复，待对照平板菌落长满时测量抑菌菌落直径，结果如图1所示(其中
编码为1的平板代表33‑1菌株，2代表CK)，根据公式2‑1计算抑菌率，结果如表2所示。

[0038] 抑菌率＝处理生长直径/对照生长直径×100％  (2‑1)

[0039] 表2拮抗菌株对尖孢镰刀菌的抑制效果

[0040]

[0041] 由表2可知，菌株33‑1对尖孢镰刀菌有较好的抑制作用，抑菌率最高，可达76.4％。

[0042] (2)采用菌丝生长速率法测定菌株发酵产物的抑菌活性，即发酵液对病原菌菌丝生长抑制作用。将33‑1接入到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28℃恒温培养48h,制成发酵液，
将尖孢镰刀菌接种在PDA平面培养基中26℃恒温活化96h，后用200μl 33‑1发酵液均匀涂布
在PDA平板上，在平板中心放置5mm病原菌菌饼，以无菌培养液为对照CK，26℃下培养7d，设
三次重复，结果如图2所示(其中编码为1的平板代表33‑1菌株，2代表CK)，用十字交叉法测
量病原真菌菌落直径。根据公式2‑2计算菌丝生长抑制率，结果如表3所示。

[0043]

[0044] 表3拮抗菌发酵液对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制作用

[0045]

[0046]

[0047] 由表3可知,33‑1对病原菌菌丝生长有明显的抑制作用，33‑1对病原菌菌丝生长抑制率可达80.65％。

[0048] 实施例3

[0049] 菌株33‑1对黄瓜枯萎病的防治效果及促生效果测试

[0050] 将菌株33‑1接入液体牛肉膏蛋白胨培养基28℃培养2d备用，将病原菌尖孢镰刀菌接在PDA液体培养基中26℃培养7d，制成尖孢镰刀菌菌悬液备用。将不包衣的黄瓜种子在45
℃水中泡种1h，之后经过70％酒精消毒1min，HgCl2消毒1min，无菌水冲洗多次后放入培养
皿中25℃催芽9天，之后将芽根部划伤，将划伤的根部在之前培养好的尖孢镰刀菌菌悬液中
浸泡5s，后接入70孔育苗盘中，并将尖孢镰刀菌菌悬液每穴6ml灌在距茎部1cm周围，24h后
‑1 ‑2 ‑3
灌根接入拮抗菌33‑1液体悬浮液6ml，菌液处理分B(原液)、A(10 )、C(10 )、D(10 )、E(10
‑4
)五个浓度。每个处理30个重复，并设有CK空白对照(不接病原菌)、CK(病原菌+清水)、CK培
对照(病原菌+培养基)、CK药剂对照(病原菌+50％多菌灵可湿性粉剂稀释1000倍)。温度24‑
28℃,相对湿度50‑70％。30d后调查发病情况，根据表4的黄瓜枯萎病分级标准对结果进行
统计，计算防治效果，并测量植株株高、根长、总重。

[0051] 表4黄瓜枯萎病分级标准

[0052]

[0053] 植株发病程度及病情分级标准计算病情指数按公式l、2进行计算。

[0054] 公式1：病情指数(％)＝∑(病情级值×该病情级株数)/(病情最高级值×总株数)×100％

[0055] 公式2：相对防治效果(％)＝(对照病情指数一处理病情指数)/对照病情指数×100％

[0056] 试验数据用Excel 2007和SPSS16.0统计分析软件进行方差分析和显著性水平检验，结果如表5所示。

[0057] 表5菌株33‑1室内盆栽防效试验结果

[0058]

[0059]

[0060] 注：同行数据后相同小写字母者表示在0.05水平上无显著差异。

[0061] 同行数据后相同大写字母者表示在0.01水平上无显著差异。

[0062] 由表5可知，在室内条件下，五种处理较CK都降低了病情指数，其中C和D处理病情指数最低，分别是5.36％和12.5％，D与CK药剂效果相当，而C处理植株发病程度明显小于CK
药剂14.28％，在防效上，C和D的效果也尤为突出，分别是86.95％和69.56％，C更是明显高
于CK药剂65.23％的防治效果。以上实验数据表明，菌株33‑1对黄瓜枯萎病具有很好的防治
效果。

[0063] 促生效果方面，由上表可知，A、C、D株高高于CK，其中C的株高显著高于CK，而C与CK药剂没有显著差异，说明C浓度可以促进植株生长，这个浓度与已经商品化的农药在对植株
生长上没有显著差异。在对植株根长的影响上，A、B、C、D、E均与CK、CK药剂无显著差异，与CK
空白有极显著差异，说明虽然各浓度菌剂没有改善病原菌对植株根长生长的影响，但也没
有加剧这种对根长生长的抑制作用。从各浓度药剂对植株总重影响上来看，C与CK、CK空白、
CK药剂有极显著差异，D与CK药剂无差异，A、B、E都与CK、CK空白有极显著差异，说明五种浓
度药剂对植株都有一定的增重效果，C、D效果尤为明显。菌株33‑1对黄瓜苗期具有明显的促
生作用。

[0064] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出
的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。