一株表达猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系及抗体与试剂盒转让专利
申请号 : CN202011286720.0
文献号 : CN112359021B
文献日 : 2021-07-09
发明人 : 李红卫 , 颜仁和 , 毛莹莹 , 李安迪 , 高永新 , 仇珍珍 , 万鹏飞
申请人 : 广州伯尼兹生物科技有限公司
摘要 :
本发明属于细胞工程与免疫学领域，具体涉及一株表达猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系及抗体与试剂盒。本发明提供的杂交瘤细胞系经重组猪瘟病毒NS3抗原制备、免疫小鼠及融合、筛选特定杂交瘤细胞株等过程。本发明提供的杂交瘤细胞系，抗原性好，特异性强，制备的抗体与天然蛋白亲和力好，本发明提供的试剂盒中，含有与NS3抗原紧密结合的单克隆抗体，这个抗体可以与猪瘟野毒特异性结合，但是不与猪瘟兔化弱毒疫苗株发生反应，在猪瘟疫苗毒株和野毒株的鉴别诊断中发挥重要作用。
权利要求 :
1.一株表达猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系CSFV‑NS3H，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2020227，其特征在于，由如下方法制得：S1、重组猪瘟病毒NS3抗原的制备：将猪瘟病毒NS3蛋白与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂充分混合10～20min，制得重组NS3抗原；
S2、用步骤S1制得的重组NS3抗原免疫小鼠，并进行细胞融合，得融合细胞；
S3、筛选步骤S2所得融合细胞中可以分泌猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，标记为CSFV‑NS3H，即得。
2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞系CSFV‑NS3H，其特征在于，步骤S1所述猪瘟病毒NS3蛋白的加入量为初次免疫为100μg/只，二次和三次免疫为50μg/只，弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按体积比1～3：5～8加入。
3.如权利要求1所述的杂交瘤细胞系CSFV‑NS3H，其特征在于，步骤S2所述用重组NS3抗原免疫小鼠的具体操作过程为：取步骤S1所得重组抗原与等体积的弗氏完全佐剂混匀后，腹腔注射BALB/c小鼠；一免后14和28天，取等量的重组抗原及弗氏完全佐剂混合，多点皮下注射相同小鼠进行二次和三次免疫，每次免疫后7天尾静采血，采用ELISA方法检测免疫应答水平；三免后14天，于小鼠尾静脉取血，以重组抗原包被，ELISA检测血清效价，取效价大6
于5×10的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合；用含15％胎牛血清的DMEM/F‑12培养基筛选融合细胞，即可。
4.如权利要求1所述杂交瘤细胞系CSFV‑NS3H，其特征在于，步骤S3所述筛选融合细胞的具体操作为：间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化3‑5次，直至细胞阳性率达100％，筛选到10～15株能获得稳定分泌抗猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体的细胞株，将筛选到的细胞表达的抗体分别跟猪瘟标准强毒石门株及多株野毒株和猪瘟兔弱毒疫苗株反应，得到仅能与猪瘟标准强毒石门株及野毒株结合，但与猪瘟兔化弱毒疫苗株不发生反应的细胞株，标记为CSFV‑NS3H。
5.一种猪瘟病毒NS3蛋白的NS3H单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述CSFV‑NS3H杂交瘤细胞株表达；所述CSFV‑NS3H杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO:C2020227。
6.如权利要求5所述的猪瘟病毒NS3蛋白的NS3H单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为IgM的亚型，轻链为λ链。
7.一种猪瘟病毒间接免疫荧光检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求5或6所述的猪瘟病毒NS3蛋白NS3H的单克隆抗体。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包含纤维蛋白原，质量分数为0.88％的氯化钠溶液。
9.利用权利要求1所述杂交瘤细胞系CSFV‑NS3H表达单克隆抗体的方法，包括如下步骤：无血清培养CSFV‑NS3H杂交瘤细胞，收集上清，采用自切割自聚集功能的融合标签纯化单克隆抗体，以SDS‑PAGE测定单克隆抗体纯度，即得；
所述CSFV‑NS3H杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO:C2020227。
10.如权利要求9所述表达单克隆抗体的方法，其特征在于，所述无血清培养采用HL‑
1TM完全无血清培养基培养细胞。
说明书 :
一株表达猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系及抗体
与试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于细胞工程与免疫学领域，具体涉及一株表达猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系及抗体与试剂盒。
背景技术
[0002] 猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fevervirus，CSFV)引起的一种高度接触性传染病，以发热和出血为主要特征，该病流行广
泛，发病率和死亡率高。给养猪业造成了严重的经济损失，OIE将其列为必须呈报的传染病。
现阶段CSF仍然是对全球养猪业威胁最大的疾病。在我国，猪瘟的危害也十分严重，是我国
猪的四大疫病之一。
泛，发病率和死亡率高。给养猪业造成了严重的经济损失，OIE将其列为必须呈报的传染病。
现阶段CSF仍然是对全球养猪业威胁最大的疾病。在我国，猪瘟的危害也十分严重，是我国
猪的四大疫病之一。
[0003] CSFV为单股正链RNA病毒，基因组约12.3kb，两端为非编码区5‑NCR和3‑NCR，中间存在一个开放性阅读框，从N端到C端依次分别为：Npro、C、E0、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、
NS4B、NS5A和NS5B。猪瘟病毒非结构蛋白NS3高度保守，具有丝氨酸蛋白酶、核苷三磷酸酶和
RNA解旋酶活性，是病毒复制增殖的必需蛋白。NS3和E0、E2均为CSFV主要抗原蛋白，可以诱
导机体产生抗体，通过检测猪体内NS3抗体水平可以反映CSFV在体内感染状况。为了与猪瘟
病毒E2和E0基因工程疫苗的快速发展相适应，需要建立一套与之相匹配的用于鉴别诊断野
毒感染和疫苗免疫接种猪的血清学检测方法。如果猪只免疫仅表达E2和E0蛋白，并非全病
毒，即可利用针对NS3重组蛋白的ELISA检测试剂盒来区分全病毒(包括疫苗毒和野毒)和猪
瘟重组疫苗激发机体产生的抗体。
NS4B、NS5A和NS5B。猪瘟病毒非结构蛋白NS3高度保守，具有丝氨酸蛋白酶、核苷三磷酸酶和
RNA解旋酶活性，是病毒复制增殖的必需蛋白。NS3和E0、E2均为CSFV主要抗原蛋白，可以诱
导机体产生抗体，通过检测猪体内NS3抗体水平可以反映CSFV在体内感染状况。为了与猪瘟
病毒E2和E0基因工程疫苗的快速发展相适应，需要建立一套与之相匹配的用于鉴别诊断野
毒感染和疫苗免疫接种猪的血清学检测方法。如果猪只免疫仅表达E2和E0蛋白，并非全病
毒，即可利用针对NS3重组蛋白的ELISA检测试剂盒来区分全病毒(包括疫苗毒和野毒)和猪
瘟重组疫苗激发机体产生的抗体。
[0004] 而现有技术中，关于NS3单克隆抗体的研究极少，且大多采用亲和柱层析法纯化蛋白，提高了单抗的制备成本，且生产规模小，同时，现有的单克隆抗体与天然蛋白的亲和力
不佳。
不佳。
[0005] 中国专利申请CN110669134A公开了一种IgM‑FC片段、IgM‑FC抗体及其制备方法和应用，提供了一种IgM‑FC抗体，选择五聚体蛋白，经粗分离处理，蛋白除杂等过程，获得片
段，并以此为免疫原免疫动物，产生抗体；该方法制得的抗体虽然可以与IgM特异性结合，然
而，其特异性不高，且采用亲和层析，增加了生产成本。
段，并以此为免疫原免疫动物，产生抗体；该方法制得的抗体虽然可以与IgM特异性结合，然
而，其特异性不高，且采用亲和层析，增加了生产成本。
[0006] 同时，中国专利CN102435733B公开了一种AFP‑IgM检测试剂盒及检测方法，所述试剂盒包括免疫球蛋白IgM，AFP抗体，辣根过氧化物酶标记物等，所述试剂盒可以提高肝癌诊
断准确度，且敏感度高，然而，该试剂盒检测时需要花费大量时间检测，且容易出现假阳性
问题，生产成本也较高。
断准确度，且敏感度高，然而，该试剂盒检测时需要花费大量时间检测，且容易出现假阳性
问题，生产成本也较高。
[0007] 综上所述，现有技术中普遍存在特异性差，与天然蛋白亲和力差，花费时间长，制备成本高等缺点。
发明内容
[0008] 针对现有技术普遍存在的缺点，本发明提供了一株表达猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系及抗体与试剂盒；本发明提供的细胞系，可以特异性分泌猪瘟病毒NS3蛋
白单克隆抗体，且抗体可以与猪瘟野毒特异性结合，但是不与猪瘟兔化弱毒疫苗株发生反
应，在猪瘟疫苗毒株和野毒株的鉴别诊断中发挥重要作用。
白单克隆抗体，且抗体可以与猪瘟野毒特异性结合，但是不与猪瘟兔化弱毒疫苗株发生反
应，在猪瘟疫苗毒株和野毒株的鉴别诊断中发挥重要作用。
[0009] 为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0010] 一株表达猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系CSFV‑NS3H，由如下方法制得：
[0011] S1、重组猪瘟病毒NS3抗原的制备：将猪瘟病毒NS3蛋白与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂充分混合10～20min，制得重组NS3抗原；
[0012] S2、用步骤S1制得的重组NS3抗原免疫小鼠，并进行细胞融合，得融合细胞；
[0013] S3、筛选步骤S2所得融合细胞中可以分泌猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，标记为CSFV‑NS3H，即得。
[0014] 优选地，步骤S1所述猪瘟病毒NS3蛋白的加入量为100～300mg/mL，弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按体积比1～3：5～8加入。
[0015] 优选地，步骤S2所述用重组NS3抗原免疫小鼠的具体操作过程为：取步骤S1所得重组抗原与等体积的弗氏完全佐剂混匀后，腹腔注射BALB/c小鼠；一免后14和28天，取等量的
重组抗原及弗氏不完全佐剂混合，多点皮下注射相同小鼠进行二次和三次免疫，每次免疫
后7天尾静采血，采用ELISA方法检测免疫应答水平。三免后14天，于小鼠尾静脉取血，以重
6
组抗原包被，ELISA检测血清效价，取效价大于5×10 的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融
合；用含15％胎牛血清的DMEM/F‑12培养基筛选融合细胞，即可。
重组抗原及弗氏不完全佐剂混合，多点皮下注射相同小鼠进行二次和三次免疫，每次免疫
后7天尾静采血，采用ELISA方法检测免疫应答水平。三免后14天，于小鼠尾静脉取血，以重
6
组抗原包被，ELISA检测血清效价，取效价大于5×10 的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融
合；用含15％胎牛血清的DMEM/F‑12培养基筛选融合细胞，即可。
[0016] 优选地，步骤S3所述筛选融合细胞的具体操作为：间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化3‑5
次，直至细胞阳性率达100％，筛选到10～15株能获得稳定分泌抗猪瘟病毒NS3蛋白单克隆
抗体的细胞株，将筛选到的细胞表达的抗体分别跟猪瘟标准强毒石门株及多株野毒株和猪
瘟兔弱毒疫苗株反应，得到仅能与猪瘟标准强毒石门株及野毒株结合，但与猪瘟兔化弱毒
疫苗株不发生反应的细胞株，标记为CSFV‑NS3H。
次，直至细胞阳性率达100％，筛选到10～15株能获得稳定分泌抗猪瘟病毒NS3蛋白单克隆
抗体的细胞株，将筛选到的细胞表达的抗体分别跟猪瘟标准强毒石门株及多株野毒株和猪
瘟兔弱毒疫苗株反应，得到仅能与猪瘟标准强毒石门株及野毒株结合，但与猪瘟兔化弱毒
疫苗株不发生反应的细胞株，标记为CSFV‑NS3H。
[0017] 本发明提供的杂交瘤细胞系CSFV‑NS3H保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉，武汉大学，培养物的名称(分类命名)为杂交瘤细胞株CSFV‑NS3H，保藏编号为
CCTCC NO:C2020227，保藏日为2020年11月11日，
CCTCC NO:C2020227，保藏日为2020年11月11日，
[0018] 本发明还提供了一种猪瘟病毒NS3蛋白的NS3H单克隆抗体，由所述CSFV‑NS3H杂交瘤细胞株表达。
[0019] 优选地，所述单克隆抗体为IgM的亚型，轻链为λ链。
[0020] 本发明还提供了一种猪瘟病毒间接免疫荧光检测试剂盒，含有所述的猪瘟病毒NS3蛋白NS3H的单克隆抗体。
[0021] 优选地，所述试剂盒还包含纤维蛋白原，质量分数为0.88％的氯化钠溶液。
[0022] 本发明还提供了利用所述杂交瘤细胞系CSFV‑NS3H表达单克隆抗体的方法，包括如下步骤：无血清培养CSFV‑NS3H杂交瘤细胞，收集上清，采用自切割自聚集功能的融合标
签纯化单克隆抗体，以SDS‑PAGE测定单克隆抗体纯度，即得。
签纯化单克隆抗体，以SDS‑PAGE测定单克隆抗体纯度，即得。
[0023] 优选地，所述无血清培养采用HL‑1TM完全无血清培养基培养细胞。
[0024] 本发明在制备重组猪瘟病毒NS3抗原时，同时加入弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂，将二者与NS3蛋白按一定比例混合，这样制得的抗原活性强，进一步制成抗体时，可以显
著提高其特异性及敏感度。而且，发明人还意外发现，在制备检测试剂盒时，加入纤维蛋白
原及质量分数为0.88％的氯化钠溶液，可以提高抗体蛋白的活性，加快其与抗原的特异性
结合，有效缩短了检测时间，大大降低了生产成本。
著提高其特异性及敏感度。而且，发明人还意外发现，在制备检测试剂盒时，加入纤维蛋白
原及质量分数为0.88％的氯化钠溶液，可以提高抗体蛋白的活性，加快其与抗原的特异性
结合，有效缩短了检测时间，大大降低了生产成本。
[0025] 与现有技术相比，本发明提供的表达猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系及抗体与试剂盒具有如下优势：
[0026] (1)本发明提供的细胞系，采用哺乳动物细胞表达获得蛋白进行免疫，该蛋白接近病毒蛋白的天然构象与修饰加工，抗原性好，制备的单克隆抗体与天然蛋白亲和力好；
[0027] (2)本发明提供的试剂盒中，加入了纤维蛋白原及氯化钠溶液，提高了抗体蛋白的活性，加快了其与抗原的亲和反应，降低了检测时间，节约了生产成本。
具体实施方式
[0028] 下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发
明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的
常规手段，所用原料为市售商品。
明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的
常规手段，所用原料为市售商品。
[0029] 哺乳动物细胞表达的猪瘟病毒NS3蛋白由广州伯尼兹生物科技有限公司生产保存；猪瘟兔化弱毒疫苗株及野毒株由军事医学科学院军事兽医研究所提供；牛血清白蛋白
和琼脂糖购自Amresco公司；二氨基联苯胺购自上海迈瑞尔化学技术有限公司；二甲基亚砜
0.25％胰蛋白酶、DMEM/F‑12培养基及胎牛血清为Sigma公司产品；弗氏完全佐剂和弗氏不
完全佐剂均使用商品化产品。
和琼脂糖购自Amresco公司；二氨基联苯胺购自上海迈瑞尔化学技术有限公司；二甲基亚砜
0.25％胰蛋白酶、DMEM/F‑12培养基及胎牛血清为Sigma公司产品；弗氏完全佐剂和弗氏不
完全佐剂均使用商品化产品。
[0030] 实施例1一株表达猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系CSFV‑NS3H所
[0031] 述杂交瘤细胞系，由如下方法制得：
[0032] S1、重组猪瘟病毒NS3抗原的制备：将猪瘟病毒NS3蛋白与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂充分混合10min，制得重组NS3抗原；所述猪瘟病毒NS3蛋白的加入量为100mg/mL，
弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按体积比1：5加入；
弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按体积比1：5加入；
[0033] S2、取步骤S1所得重组抗原与等体积的弗氏完全佐剂混匀后，腹腔注射BALB/c小鼠；一免后14和28天，取等量的重组抗原及弗氏不完全佐剂混合，多点皮下注射相同小鼠进
行二次和三次免疫，每次免疫后7天尾静采血，采用ELISA方法检测免疫应答水平。三免后14
6
天，于小鼠尾静脉取血，以重组抗原包被，ELISA检测血清效价，取效价大于5×10的小鼠脾
细胞与骨髓瘤细胞进行融合；用含15％胎牛血清的DMEM/F‑12培养基筛选融合细胞，即可。
行二次和三次免疫，每次免疫后7天尾静采血，采用ELISA方法检测免疫应答水平。三免后14
6
天，于小鼠尾静脉取血，以重组抗原包被，ELISA检测血清效价，取效价大于5×10的小鼠脾
细胞与骨髓瘤细胞进行融合；用含15％胎牛血清的DMEM/F‑12培养基筛选融合细胞，即可。
[0034] S3、筛选步骤S2所得融合细胞中可以分泌猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，标记为CSFV‑NS3H，即得；所述筛选过程为：间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择效价
较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化3次，直至细胞阳性
率达100％，筛选到10株能获得稳定分泌抗猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体的细胞株，将10株
细胞表达的抗体分别跟猪瘟标准强毒石门株及多株野毒株和猪瘟兔弱毒疫苗株反应，最终
得到3株仅能与猪瘟标准强毒石门株及野毒株结合，但与猪瘟兔化弱毒疫苗株不发生反应
的细胞株，标记为CSFV‑NS3H。
较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化3次，直至细胞阳性
率达100％，筛选到10株能获得稳定分泌抗猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体的细胞株，将10株
细胞表达的抗体分别跟猪瘟标准强毒石门株及多株野毒株和猪瘟兔弱毒疫苗株反应，最终
得到3株仅能与猪瘟标准强毒石门株及野毒株结合，但与猪瘟兔化弱毒疫苗株不发生反应
的细胞株，标记为CSFV‑NS3H。
[0035] 实施例2一株表达猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系CSFV‑NS3H所述杂交瘤细胞系CSFV‑NS3H，由如下方法制得：
[0036] S1、重组猪瘟病毒NS3抗原的制备：将猪瘟病毒NS3蛋白与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂充分混合20min，制得重组NS3抗原；所述猪瘟病毒NS3蛋白的加入量为300mg/mL，
弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按体积比3：8加入
弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按体积比3：8加入
[0037] S2、取步骤S1所得重组抗原与等体积的弗氏完全佐剂混匀后，腹腔注射BALB/c小鼠；一免后14和28天，取等量的重组抗原及弗氏不完全佐剂混合，多点皮下注射相同小鼠进
行二次和三次免疫，每次免疫后7天尾静采血，采用ELISA方法检测免疫应答水平。三免后14
6
天，于小鼠尾静脉取血，以重组抗原包被，ELISA检测血清效价，取效价大于5×10的小鼠脾
细胞与骨髓瘤细胞进行融合；用含15％胎牛血清的DMEM/F‑12培养基筛选融合细胞，得融合
细胞；
行二次和三次免疫，每次免疫后7天尾静采血，采用ELISA方法检测免疫应答水平。三免后14
6
天，于小鼠尾静脉取血，以重组抗原包被，ELISA检测血清效价，取效价大于5×10的小鼠脾
细胞与骨髓瘤细胞进行融合；用含15％胎牛血清的DMEM/F‑12培养基筛选融合细胞，得融合
细胞；
[0038] S3、筛选步骤S2所得融合细胞中可以分泌猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，标记为CSFV‑NS3H，即得；所述筛选过程为：间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择效价
较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化5次，直至细胞阳性
率达100％，筛选到12株能获得稳定分泌抗猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体的细胞株，将12株
细胞表达的抗体分别跟猪瘟标准强毒石门株及多株野毒株和猪瘟兔弱毒疫苗株反应，最终
得到4株仅能与猪瘟标准强毒石门株及野毒株结合，但与猪瘟兔化弱毒疫苗株不发生反应
的细胞株，标记为CSFV‑NS3H。
较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化5次，直至细胞阳性
率达100％，筛选到12株能获得稳定分泌抗猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体的细胞株，将12株
细胞表达的抗体分别跟猪瘟标准强毒石门株及多株野毒株和猪瘟兔弱毒疫苗株反应，最终
得到4株仅能与猪瘟标准强毒石门株及野毒株结合，但与猪瘟兔化弱毒疫苗株不发生反应
的细胞株，标记为CSFV‑NS3H。
[0039] 实施例3一株表达猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系CSFV‑NS3H所述杂交瘤细胞系CSFV‑NS3H，由如下方法制得：
[0040] S1、重组猪瘟病毒NS3抗原的制备：将猪瘟病毒NS3蛋白与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂充分混合15min，制得重组NS3抗原；所述猪瘟病毒NS3蛋白的加入量为200mg/mL，
弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按体积比2：7加入；
弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按体积比2：7加入；
[0041] S2、取步骤S1所得重组抗原与等体积的弗氏完全佐剂混匀后，腹腔注射BALB/c小鼠；一免后14和28天，取等量的重组抗原及弗氏不完全佐剂混合，多点皮下注射相同小鼠进
行二次和三次免疫，每次免疫后7天尾静采血，采用ELISA方法检测免疫应答水平。三免后14
6
天，于小鼠尾静脉取血，以重组抗原包被，ELISA检测血清效价，取效价大于5×10的小鼠脾
细胞与骨髓瘤细胞进行融合；用含15％胎牛血清的DMEM/F‑12培养基筛选融合细胞，得融合
细胞；
行二次和三次免疫，每次免疫后7天尾静采血，采用ELISA方法检测免疫应答水平。三免后14
6
天，于小鼠尾静脉取血，以重组抗原包被，ELISA检测血清效价，取效价大于5×10的小鼠脾
细胞与骨髓瘤细胞进行融合；用含15％胎牛血清的DMEM/F‑12培养基筛选融合细胞，得融合
细胞；
[0042] S3、筛选步骤S2所得融合细胞中可以分泌猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，标记为CSFV‑NS3H，即得；所述筛选过程为：间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择效价
较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化4次，直至细胞阳性
率达100％，筛选到15株能获得稳定分泌抗猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体的细胞株，将15株
细胞表达的抗体分别跟猪瘟标准强毒石门株及多株野毒株和猪瘟兔弱毒疫苗株反应，最终
得到6株仅能与猪瘟标准强毒石门株及野毒株结合，但与猪瘟兔化弱毒疫苗株不发生反应
的细胞株，标记为CSFV‑NS3H。
较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化4次，直至细胞阳性
率达100％，筛选到15株能获得稳定分泌抗猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体的细胞株，将15株
细胞表达的抗体分别跟猪瘟标准强毒石门株及多株野毒株和猪瘟兔弱毒疫苗株反应，最终
得到6株仅能与猪瘟标准强毒石门株及野毒株结合，但与猪瘟兔化弱毒疫苗株不发生反应
的细胞株，标记为CSFV‑NS3H。
[0043] 实施例4效价测定
[0044] 1.免疫血清效价测定：采用间接ELISA法测定免疫血清效价。取100μg重组猪瘟病毒NS3蛋白溶解于10mL 0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液，包被96孔酶标板，100μL/孔，4℃过夜。次
日，使用PBS(含有0.05％(V/V)Tween‑20)洗板三次，小鼠于每次免疫后7天眼眶采血，鼠免
‑1 ‑8
疫血清用含1％BSA 10mMPBS以10 ‑10 倍稀释，加入96孔板，100μL/孔37℃1h，PBS(含有
0.05％(V/V)Tween‑20)洗板三次后，加入1:1000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG
二抗，100μL/孔37℃1h，同上洗板后，TMB显色，100μL/孔，室温避光10min，加100μL/孔2M
H2SO4终止反应，测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值的比
≥2.1为阳性来判断免疫血清的效价。
日，使用PBS(含有0.05％(V/V)Tween‑20)洗板三次，小鼠于每次免疫后7天眼眶采血，鼠免
‑1 ‑8
疫血清用含1％BSA 10mMPBS以10 ‑10 倍稀释，加入96孔板，100μL/孔37℃1h，PBS(含有
0.05％(V/V)Tween‑20)洗板三次后，加入1:1000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG
二抗，100μL/孔37℃1h，同上洗板后，TMB显色，100μL/孔，室温避光10min，加100μL/孔2M
H2SO4终止反应，测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值的比
≥2.1为阳性来判断免疫血清的效价。
[0045] 2.纯化抗体的效价测定：100μg重组猪瘟病毒NS3蛋白溶于10mL pH 9.6的0.05M碳酸盐包被液缓冲液中，加入96孔板，100μl/孔，4℃包被过夜。PBST洗板三次，用含1％BSA封
闭液的PBS150μL/孔，37℃封闭1h；PBST洗板三次后，每孔加入100μL纯化抗体，37℃孵育1h，
PBST洗板三次后，加入辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG二抗，100μL/孔37℃1h，PBST洗板
三次后，TMB显色，100μL/孔，室温避光15min，加100μL/孔2M H2SO4终止反应，测450nm吸收
值。
闭液的PBS150μL/孔，37℃封闭1h；PBST洗板三次后，每孔加入100μL纯化抗体，37℃孵育1h，
PBST洗板三次后，加入辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG二抗，100μL/孔37℃1h，PBST洗板
三次后，TMB显色，100μL/孔，室温避光15min，加100μL/孔2M H2SO4终止反应，测450nm吸收
值。
[0046] 实施例5一种猪瘟病毒间接免疫荧光检测试剂盒
[0047] 所述检测试剂盒采用如下方法：将纤维蛋白原0.15μg加入到质量分数为0.88％，体积为5μL的氯化钠溶液中，然后与45μL的Modifier regent混合均匀，加入纯化的NS3蛋白
50μL，混合均匀，将混合液体加入到含有120μg的FITC冻干粉管内，于25℃下避光处理4h，最
后加入50μL的Quencher reagent，混匀，静置1h，然后进行分装，置于‑80℃下保存备用。
50μL，混合均匀，将混合液体加入到含有120μg的FITC冻干粉管内，于25℃下避光处理4h，最
后加入50μL的Quencher reagent，混匀，静置1h，然后进行分装，置于‑80℃下保存备用。
[0048] 对比例1一株表达猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系CSFV‑NS3H
[0049] 所述杂交瘤细胞系的制备过程与实施例3类似；
[0050] 与实施例3的区别在于，对比例1中的弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按体积比1：1组成；最终筛选出1株细胞。
[0051] 对比例2一种猪瘟病毒间接免疫荧光检测试剂盒
[0052] 所述猪瘟病毒间接免疫荧光检测试剂盒与实施例5类似；
[0053] 与实施例5的区别在于，对比例2中不包含纤维蛋白原及氯化钠溶液。
[0054] 试验例1单克隆抗体纯度测定
[0055] 1.试验样品：实施例1‑3及对比例1制得的杂交瘤细胞株；
[0056] 2.试验方法：用HL‑1TM完全无血清培养基培养实施例1‑3及对比例1制得的细胞，培养12h，收集上清液，然后用等体积的切割缓冲液buffer B2(20mmol/LTris‑HCl，
500mmol/LNaCl，1mmol/LEDTA，40mmol/L DTT，pH8.5)充分重悬沉淀，置于4℃旋转混匀器中
诱导切割24h。诱导切割后，4℃、8000rpm离心20min，收集上清，用SDS‑PAGE测定单克隆抗体
的纯度；使用BIO‑RAD公司生产的Smart Spec plus蛋白测定仪测定抗体浓度；采用Hbt公司
的鼠单抗亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株的亚型。
500mmol/LNaCl，1mmol/LEDTA，40mmol/L DTT，pH8.5)充分重悬沉淀，置于4℃旋转混匀器中
诱导切割24h。诱导切割后，4℃、8000rpm离心20min，收集上清，用SDS‑PAGE测定单克隆抗体
的纯度；使用BIO‑RAD公司生产的Smart Spec plus蛋白测定仪测定抗体浓度；采用Hbt公司
的鼠单抗亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株的亚型。
[0057] 3.试验结果：经检测，单克隆抗体为IgM的亚型，轻链为λ链，浓度及纯度的具体试验结果见表1。
[0058] 表1不同方法制得的单克隆抗体的纯度及浓度对比
[0059] 试验样品 单克隆抗体浓度/mg/mL 单克隆抗体纯度/％实施例1 1.08 96.7％
实施例2 1.12 97.3％
实施例3 1.18 98.5％
对比例1 0.76 78.9％
实施例2 1.12 97.3％
实施例3 1.18 98.5％
对比例1 0.76 78.9％
[0060] 由此可知，本申请实施例1‑3所示方法筛选出的细胞株，分泌的单克隆抗体纯度均在96％以上，尤其是实施例3组，单抗纯度达98.5％，故实施例3组为本发明的最佳实施例；
而对比例1改变了两种佐剂的比例，影响了抗原活性，最终将单抗纯度降低至80％以下。
而对比例1改变了两种佐剂的比例，影响了抗原活性，最终将单抗纯度降低至80％以下。
[0061] 试验例2猪瘟病毒检测试验
[0062] 1.试验样品：实施例1‑3及对比例1所得细胞；实施例5及对比例2所选择的试剂盒；
[0063] 2.试验方法：
[0064] 2.1敏感性测试：用PKWRL细胞以2×104个/孔的密度铺一块96孔板，于36℃、5％CO2培养箱中培养。细胞贴壁16h后将猪瘟病毒稀释后接入96孔板中，每孔80μL，于36℃、5％CO2
培养箱中培养48h。弃去培养液，PBS洗涤2次，使用预冷的4％多聚甲醛固定细胞，室温固定
1h；PBS洗涤2次加入0.1％Triton，40μL/孔，透膜20min；等分成8份，然后将FITC标记的猪瘟
病毒E2蛋白单克隆抗体分别稀释成20、100、500、1000、2000、4000、6000、8000倍，分别加入
上述细胞液中，并分别置于37℃温箱中孵育1h，PBS洗涤3次，于荧光显微镜下观察荧光强
度。
培养箱中培养48h。弃去培养液，PBS洗涤2次，使用预冷的4％多聚甲醛固定细胞，室温固定
1h；PBS洗涤2次加入0.1％Triton，40μL/孔，透膜20min；等分成8份，然后将FITC标记的猪瘟
病毒E2蛋白单克隆抗体分别稀释成20、100、500、1000、2000、4000、6000、8000倍，分别加入
上述细胞液中，并分别置于37℃温箱中孵育1h，PBS洗涤3次，于荧光显微镜下观察荧光强
度。
[0065] 2.2特异性的测定：取牛病毒性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒，猪瘟病毒标准强毒石门株和兔化弱毒株，分别用实施例5及对比例2所
述的试剂盒进行免疫荧光实验，检测单克隆抗体的特异性。
述的试剂盒进行免疫荧光实验，检测单克隆抗体的特异性。
[0066] 2.3猪瘟兔化弱毒株与野毒株：取猪瘟病毒标准强毒石门株(SM)及野毒株(包括SM、GD53‑2.1c、GD176‑2.1b、GD2‑2.1c、GD49‑2.1j、HY‑11‑2.1h)和兔化弱毒株(HCLV)，进行
免疫荧光实验，检测单克隆抗体的特异性。
免疫荧光实验，检测单克隆抗体的特异性。
[0067] 3.试验结果：具体试验结果见表2。
[0068] 表2不同试剂盒检测试验结果
[0069]
[0070]
[0071] 由表2可知，本发明实施例1‑3组的抗原性及敏感性均很高，可以在稀释到6000倍以上仍然发出荧光，尤其实施例3组，稀释至6000倍荧光强度仍然很强，至8000倍，荧光强度
才降低，故实施例3为本发明的最佳实施例；而且，对比例2中提供的试剂盒，去掉纤维蛋白
原及氯化钠溶液，不会影响单克隆抗体特异性检测结果，但是对单克隆抗体本身的敏感性
显著降低，采用对比例2所述的试剂盒，荧光强度大大降低，对比例1改变佐剂的比例，改变
了抗原活性，会影响不同毒株中单克隆抗体的鉴定结果。
才降低，故实施例3为本发明的最佳实施例；而且，对比例2中提供的试剂盒，去掉纤维蛋白
原及氯化钠溶液，不会影响单克隆抗体特异性检测结果，但是对单克隆抗体本身的敏感性
显著降低，采用对比例2所述的试剂盒，荧光强度大大降低，对比例1改变佐剂的比例，改变
了抗原活性，会影响不同毒株中单克隆抗体的鉴定结果。
[0072] 最后应当说明的是，上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例
进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精
神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精
神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。