一种多肽抑制剂及其用途

摘要

一种多肽抑制剂，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。还提供了上述一种多肽抑制剂在制备用于抑制USP30蛋白酶活活性的药物中的用途。通过酶活抑制实验证明，本发明的多肽可以有效抑制USP30的去泛素化酶活性。通过泛素链水解、线粒体去泛素化实验证明，本发明的多肽可以有效抑制去泛素化酶USP30的催化活性。通过共沉淀实验、细胞热迁移实验、免疫荧光共定位实验证明本发明的多肽可以和细胞中的USP30蛋白发生相互作用。通过线粒体自噬相关蛋白的western blot实验、线粒体ATP含量以及线粒体mtDNA含量的检测实验证明本发明的多肽可以抑制细胞中的USP30催化活性并提高线粒体自噬水平。

权利要求

1.一种多肽抑制剂，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种多肽抑制剂，其特征在于，其氨基酸序列结构如下所示：

说明书

一种多肽抑制剂及其用途

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程领域，涉及一种多肽，具体来说是一种多肽抑制剂及其用途。

背景技术

[0002] 随着人口老龄化的加速，世界范围内帕金森病的发病率和致死率不断攀升，帕金森病已成为人类健康的主要威胁之一。既往研究认为帕金森病的确切病因仍不清楚，遗传因素、环境因素、年龄老化、氧化应激等均可能参与帕金森病多巴胺能神经元的变性死亡过程。目前帕金森病的病理发生机制尚待更加深入的研究，同时也缺乏特异性根治帕金森病的药物，因而进一步阐释帕金森病的病理机制，寻找更有效的药物靶点将为疾病的治疗提供新思路。

[0003] 线粒体是细胞中至关重要的一种细胞器，通过呼吸链氧化磷酸化将糖，脂肪和蛋白质等生物大分子彻底氧化水解来产生ATP供应细胞生命活动所需的能量，是细胞内代谢网络和信号传导网络的调控中心，在生长发育、代谢、衰老和死亡等方面发挥重要的作用。线粒体功能障碍导致的氧化应激和兴奋性毒性会攻击细胞基因组，给细胞带来严重损害。
越来越多的证据表明线粒体功能障碍与帕金森病有着密切的关系。帕金森病患者的脑组织中可以观察到线粒体复合物I的活性降低以及较高的线粒体基因的突变。此外，帕金森病的遗传模型中也存在着线粒体功能和形态异常。这些证据均表明线粒体功能障碍与帕金森病高度相关。线粒体质量控制是细胞存活的关键，为了及时清除受损线粒体维持其正常功能，细胞通过线粒体自噬这一重要途径起到控制线粒体质量和数量的作用，线粒体自噬对于能量需求很大并且没有再生能力的神经细胞来说尤其重要。线粒体自噬作为选择性自噬的一种形式，哺乳动物主要通过三种途径来介导线粒体自噬，分别是 PINK1/Parkin介导的线粒体自噬、Nix介导的线粒体自噬以及FUNDC1介导的线粒体自噬。

[0004] 近年的研究发现去泛素化酶USP30能够通过拮抗Parkin介导的泛素化过程平衡线粒体自噬。USP30是属于泛素特异型加工蛋白酶(Ubiquitin‑specific proteases，USPs)家族的一种去泛素化酶，蛋白N端的一段跨膜结构域可以使得USP30蛋白定位在线粒体外膜上。当线粒体受损时，E3泛素连接酶Parkin可以将K6、K11、K63泛素链连接到线粒体上，USP30可以选择性地去除K6和K11 泛素链，拮抗Parkin的泛素化过程。

[0005] 此外，利用模拟帕金森病的果蝇模型进行研究，发现抑制USP30的功能可以为同时缺失了Parkin和PINK1的果蝇提供应激保护来提高线粒体的完整性和改善运动神经元的功能。在Hela细胞中，同样也观察到了一致的现象，即抑制USP30 的功能可以促进线粒体的延伸和线粒体网络的形成，意味着USP30在调控线粒体的分裂和融合的重要作用。

[0006] 但是目前针对USP30的抑制剂较少，主要包括小分子S3  (15‑oxaspiramilactone)、N‑氰基吡咯烷(N‑cyano pyrrolidines)和外消旋苯丙氨酸衍生物(Racemic phenylalanine derivative)、噬菌体展示筛选得到的十二肽等。其中研究较为充分的是二萜类衍生物S3(15‑oxospiramilactone)，其通过与USP30活性催化中心的半胱氨酸直接相互作用来抑制USP30的去泛素化酶活性，进而调节线粒体功能，包括恢复线粒体膜电位、促进线粒体融合和线粒体产能等。但这些小分子对于细胞内的USP30的抑制情况以及抑制方式暂不清楚。因此，发展新型高效的USP30抑制剂是目前非常急需的。

[0007] 多肽作为分子量适中的具有较高成药潜力的分子形式，具有足够高的柔性适应较大的结合表面，提供更多的相互作用。与生物大分子类似，多肽类分子对于靶点也有较高的结合力与选择性，相对于小分子类药物具有更小的脱靶效应。而多肽在体内的代谢产物为氨基酸，最大限度地降低了毒性。因而，多肽药物具有良好的生物活性以及生物相容性。

[0008] 因此，我们在本发明中设计了基于去泛素化酶USP30跨膜结构域设计的多肽，其不仅具有良好的酶活抑制效果，对细胞中去泛素化酶具有良好的相互作用，在人类脑胶质细胞瘤中该多肽抑制剂表现出良好的酶活抑制能力以及提高线粒体自噬的能力，而对细胞几乎没有毒性。该多肽抑制剂的发明，拓宽了USP30 的抑制剂的设计，改善了传统小分子USP30抑制剂毒性问题，为设计新颖的去泛素化酶药物提供了思路。

发明内容

[0009] 针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种多肽抑制剂及其用途，所述的这种多肽抑制剂及其用途要解决现有技术中的药物对于人类脑胶质细胞瘤的治疗效果不佳的技术问题。

[0010] 本发明提供了一种多肽抑制剂，其氨基酸序列如SEQ  ID  NO.1所示 (GIYVIWGPITERKKRRKG)。

[0011] 进一步的，其氨基酸序列结构如下所示：

[0012]

[0013] 进一步的，本发明还提供了上述的一种多肽抑制剂在制备用于抑制USP30蛋白酶活活性的药物中的用途。

[0014] 进一步的，本发明还提供了上述的一种多肽抑制剂在制备用于抑制人胶质瘤细胞中的USP30的酶活活性的药物中的用途。

[0015] 进一步的，本发明还提供了上述的一种多肽抑制剂在制备用于提高人胶质瘤细胞中的线粒体自噬的活性的药物中的用途。

[0016] 本发明提供了一种基于去泛素化酶USP30跨膜结构域衍生的多肽抑制剂用于抑制细胞内USP30的去泛素化酶活性，与其它USP30小分子抑制剂比较，本发明的多肽抑制剂为首次基于去泛素化酶USP30跨膜结构域设计的多肽，不仅具有良好的酶活抑制效果，对细胞中去泛素化酶具有良好的相互作用，在人类脑胶质细胞瘤中该多肽抑制剂表现出良好的酶活抑制能力以及提高线粒体自噬的能力，而对细胞几乎没有毒性。该多肽抑制剂的发明，拓宽了USP30的抑制剂的设计，改善了传统小分子USP30抑制剂毒性问题，为设计新颖的去泛素化酶药物提供了思路。

[0017] 本发明通过一系列的酶活抑制实验证明本发明的多肽可以有效抑制USP30的去泛素化酶活性。通过泛素链水解、线粒体去泛素化实验证明本发明的多肽可以有效抑制去泛素化酶USP30的催化活性。通过共沉淀实验、细胞热迁移实验、免疫荧光共定位实验证明本发明的多肽可以和细胞中的USP30蛋白发生相互作用。通过线粒体自噬相关蛋白的western blot实验、线粒体ATP含量以及线粒体 mtDNA含量的检测实验证明本发明的多肽可以抑制细胞中的USP30催化活性并提高线粒体自噬水平。通过蛋白标记手段、质谱交联技术以及在线结合位点预测方法揭示了多肽与USP30的可能结合位点和结合模式(图8)。该研究成果为未来开发新颖的USP30抑制剂提供一种思路。

[0018] 本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。首先该发明通过一系列酶活实验发现了具有良好抑制效果的USP30多肽抑制剂，这是目前研究出的最新的 USP30多肽抑制剂。通过共沉淀、共定位、细胞热迁移等一系列相互作用检测实验较为全面地研究了该多肽与USP30的相互作用。通过细胞线粒体自噬相关实验进一步证明本发明多肽抑制剂对USP30相关通路的影响。过蛋白标记手段、质谱交联技术以及在线结合位点预测方法揭示了多肽与USP30的可能结合位点和结合模式。该研究成果为未来开发新颖的USP30抑制剂提供一种思路。

附图说明

[0019] 图1为多肽抑制剂初步截短筛选图。

[0020] 图2为多肽抑制剂丙氨酸筛选图。

[0021] 图3为多肽抑制剂体外去泛素化实验筛选图。

[0022] 图4为多肽抑制剂体外结合实验筛选图。

[0023] 图5为多肽抑制剂在细胞内的结合实验。

[0024] 图6为多肽抑制剂对线粒体自噬的影响。

[0025] 图7为多肽抑制剂的LIR结构域与LC3结合示意图。

[0026] 图8为多肽抑制剂抑制USP30的模式示意图。

具体实施方式

[0027] 下面结合附图对本发明进一步说明。

[0028] 实施例1：多肽抑制剂的初步截短筛选

[0029] 本发明基于USP30跨膜结构域来设计更有效的USP30多肽抑制剂。如图1 所示，既往的研究表明(Lee,J.G.,Kim,W.,Gygi,S.&Ye,Y.Characterization of the deubiquitinating activity of USP19 and its role in endoplasmic reticulum‑associated degradation.J Biol Chem 289,3510‑3517(2014).)USP19具有自身抑制活性的跨膜结构域，我们通过比对 USP19与USP30的跨膜结构域的序列，发现两者的跨膜结构域具有较高的相似性 (图1a,1b)。因而，我们推测USP30的跨膜结构域序列具有类似的抑制自身催化活性的作用。

[0030] 本发明基于USP30上35位到65位蛋白序列合成了含有跨膜结构域(TM)和线粒体外膜定位序列(MLS)的多肽Q1，如图1c所示。将不同浓度的多肽与USP30 预孵育30分钟后，加入Ub‑AMC底物，使用多功能酶标仪来监测30分钟内的荧光(340nm激发波长，465nm发射波长，30s间隔)来测量多肽对USP30酶活的影响。

[0031] 如图1c所示，Q1多肽可以在一定程度下抑制USP30的催化活性。考虑到多肽的长度和溶解性，本发明将Q1多肽进行了序列截短，合成了从N端逐渐缩短的多肽，序列如图1d所示。通过比较100nM浓度多肽处理对USP30蛋白的催化活性的影响来比较这些缩短序列的多肽抑制USP30的能力。

[0032] 如图1e所示，不同长度的多肽抑制USP30蛋白催化活性的能力不同，USP30 的跨膜结构域的N端对于USP30蛋白的抑制影响较小，而缺乏了N端较多丙氨酸的多肽的活性相对较好，也即Q13‑Q18多肽抑制USP30蛋白催化活性的能力较高。

[0033] 因此，本发明深入比较了这几条多肽的半数抑制浓度。将梯度稀释浓度的多肽Q14‑Q18与15nM USP30蛋白预孵育30分钟后加入Ub‑AMC底物，通过将未加多肽处理的对照为100％USP30活性来进行归一化比较。如图1f所示，Q14、 Q15、Q16多肽相对于原始Q1多肽的抑制USP30的能力有较大的提高，其中，Q14 的提高最为明显，IC50为57nM。这部分的结果表明USP30的跨膜结构域(TM) 和线粒体外膜定位序列(MLS)对于USP30的活性抑制是重要的，且其N端对于 USP30活性的抑制影响相对较小，而这段多肽的最短抑制长度约为18个氨基酸，即富含疏水性的N端和富含碱性氨基酸的C端的Q14多肽。

[0034] 实施例2：多肽抑制剂的丙氨酸筛选

[0035] 如上所示，USP30的跨膜结构域(TM)和线粒体外膜定位序列(MLS)中一段富含疏水性的N端和富含碱性氨基酸的C端的Q14多肽对于USP30的活性抑制较为显著。本发明想要探究多肽上的哪些残基对于抑制USP30的功能发挥着重要的作用。如图2所示，本发明对多肽的18个氨基酸进行了丙氨酸突变来检测氨基酸对于USP30的抑制的影响(图2a)。由酶活结果可以看到，Q14多肽上的氨基酸的突变整体对Q14抑制USP30蛋白的催化活性的影响较大，多肽上N端的突变造成的影响相对C末端的影响更小一些，尤其是MT6和MT9的突变对于USP30 的酶活的影响较小(图2b)。本发明之后将Q14多肽分为Q26(C‑末端部分)和 Q23(N‑末端部分)的两条多肽(图2d)，比较了它们和Q14的抑制USP30蛋白催化活性的能力。由图2c和图2e可以看到，Q14的C末端部分(Q23)在抑制 USP30蛋白活性中起较多的作用，而多肽Q14的N末端缩短(Q26)则使得多肽抑制USP30活性的能力大幅降低。C末端截短序列(Q24、Q25)和C末端突变序列(MT10‑MT18)一起表明Q14多肽的C末端，尤其是线粒体外膜定位序列(MLS) 对于抑制USP30的催化活性发挥着非常重要的作用。单独的C端序列和单独的 N‑序列表现出的抑制能力均没有完整多肽Q14的效果好，表明完整的N末端序列和C末端序列对于发挥USP30的抑制作用是必须的，它们的协同作用一起实现了对USP30的催化活性的抑制作用。而且，Q14多肽的氨基酸的适当排列对于抑制 USP30也是非常重要的。由图2f中可以看出，Q14的扰乱序列丧失了抑制USP30 的能力。

[0036] 实施例3:

[0037] 既往的研究表明USP30蛋白是一个特殊的USP型去泛素化酶，更倾向于催化水解具有紧密结构的泛素链，其中Lys 6类型的泛素链的水解速度最快。因此，本发明接下来将不同浓度的Q14多肽与2μg USP30蛋白一起预孵育30 分钟后加入Lys 6的四泛素链，在37度水浴15分钟后终止反应，并通过银染实验检测水解出的泛素链的情况来评估多肽Q14对USP30的催化活性的抑制情况。与Ub‑AMC酶切实验测定的结果一致，随着Q14浓度的增加，与对照相比，水解出的单泛素链逐渐减少(图3a)。这表明随着浓度的增加，Q14逐渐抑制了USP30的催化活性。如上所述，USP30是定位于线粒体上的去泛素化酶，因而USP30蛋白对于线粒体上的泛素化的调控非常重要。为了进一步验证多肽 Q14对USP30的去泛素化催化活性的抑制作用，本发明进一步检测了Q14对于线粒体泛素化的影响。本发明通过解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙(CCCP，10μΜ处理2小时)预处理线粒体使得线粒体泛素化水平明显增高，之后将泛素化后的线粒体作为底物，将5μM USP30蛋白和300μM Q14一起孵育，来评估线粒体去泛素化情况(图3b)。通过使用泛素抗体做蛋白质印迹(Western blot) 检测，本发明观察到USP30能够减少线粒体中的泛素链，而多肽Q14可以显著抑制泛素链的水解(图3c)。这些结果表明，Q14多肽可以有效抑制USP30的去泛素化活性。

[0038] 实施例4:

[0039] 为了进一步验证多肽Q14对USP30蛋白的结合能力，本发明合成了带有荧光标签标记的多肽FITC‑Q14，利用荧光偏振实验(Fluroscence polarization, FP)测定来评估Q14和USP30之间的结合亲和力。如图4a所示，将FITC‑Q14 与梯度稀释的USP30蛋白，一起孵育后检测确定Q14与USP30结合，其结合活性约为40nM。为了检测USP30是否为Q14多肽在细胞中的直接靶标，本发明使用了热迁移实验(Thermal shift assay,TSA)和Biotin‑Streptavidin‑ 拉下实验(Biotin‑Streptavidin pull down assay)来进一步验证该多肽与USP30是否相互作用。热迁移实验是一种新发展的基于蛋白质热稳定性测量蛋白质和配体之间的结合亲和力的方法。当配体与蛋白结合之后，可以稳定蛋白质的构象，当温度逐渐升高的时候，与配体结合的蛋白质会比没有结合的蛋白质的构象更稳定，蛋白熔点温度(Melting temperature,Tm)更高。由于纯化的 USP30蛋白自身稳定性较差，随温度升高极易发生沉淀，在尝试使用纯化蛋白与 Q14多肽用TSA实验失败之后，本发明采用了基于细胞裂解液的热迁移实验来评估多肽对于USP30结合亲和力。从图4c和图4d中可以看出，Q14多肽与 A172细胞裂解液孵育之后增强了USP30的热稳定性，而对照处理组没有显示出差异。此外，本发明还将多肽Q14用生物素标签标记，通过用生物素标记的 Q14多肽处理A172细胞裂解液后用Streptavidin的磁珠去拉出多肽‑蛋白复合物。由图4b可以看到，多肽Q14可以有效拽出细胞裂解液中的USP30蛋白。综上所述，这些结果可以表明多肽Q14可以与USP30存在直接的相互作用。

[0040] 实施例5:

[0041] 为了更进一步证明Q14在细胞中可以靶向USP30，本发明开展了一系列基于细胞的实验来证明Q14多肽的确可以在细胞中与USP30直接相互作用。目前，多肽穿透细胞膜的能力是限制多肽在细胞中发挥效应的主要问题。首先，在进行细胞实验之前，本发明需要验证多肽Q14是否能够穿过哺乳动物细胞的细胞膜。因此，本发明首先测试了多肽Q14在A172细胞中的穿透能力。将FITC 标签标记的多肽FITC‑Q14与A172细胞在37度孵育4小时。之后经过胰蛋白酶消化和0.05％台盼蓝处理后，使用流式细胞仪来评价Q14多肽的细胞摄取能力。与DMSO处理和穿膜肽FITC‑TAT为正对照的处理相比，Q14多肽表现出较强的细胞荧光，这表明Q14的细胞摄取足以用于基于细胞的实验测定(图 5a)。为了证实Q14确实在细胞中与USP30蛋白的相互作用，本发明利用 Biotin标记的多肽与活细胞A172处理之后用Biotin‑Streptavidin‑拉下实验 (Biotin‑Streptavidin pull down assay)去检测。由图5b所示，多肽Q14处理之后，可以观察到USP30的特异性条带，而用Biotin处理或者乱序多肽 Biotin‑Qscr处理的样品则未发现，这表明Q14多肽在细胞中与USP30存在相互作用。此外，本发明还使用细胞热迁移实验(Cellular thermal shift assay, CETSA)来检测USP30是否是A172细胞中Q14多肽的直接靶标。用Q14多肽与A172预孵育12小时后取样品来进行CETSA分析。如图5c所示，多肽 Q14与A172细胞的孵育使细胞中的USP30的Tm增加，证实Q14多肽可以直接与细胞中的USP30发生相互作用。此外，本发明还使用了免疫荧光实验来分析了FITC标记的Q14多肽与USP30在细胞内的共定位情况。如图5d所示，Q14多肽在细胞中具有良好的分布和与USP30的共定位情况，表明多肽可以有效穿透细胞膜和靶向细胞中的USP30蛋白。

[0042] 实施例6:

[0043] 根据文献报道(Cunningham,C.N.et al.USP30 and parkin homeostatically regulate atypical ubiquitin chains on mitochondria.Nat Cell Biol 17,160‑169(2015)。Gersch,M.et al. Mechanism and regulation of the Lys6‑selective deubiquitinase USP30.Nat Struct Mol Biol 24, 920‑930(2017).)，USP30可以去泛素化线粒体蛋白，并被视为线粒体自噬的拮抗分子。抑制USP30的功能可以增加一些线粒体蛋白质如TOMM20、TIMM23和 MFN2的降解，从而增强线粒体自噬水平。在这些USP30底物蛋白中，TOMM20 的泛素化被认为是线粒体自噬的信号。为了进一步研究Q14抑制了USP30的活性对线粒体自噬的影响，本发明进一步研究了Q14多肽对线粒体泛素化和线粒体蛋白的降解的影响。如图6a所示，Q14与A172细胞处理24小时之后使得线粒体整体的泛素化水平明显增加。TOMM20、TIMM23和MFN2蛋白作为线粒体定位的蛋白，它们的降解被视为线粒体自噬的标志物。由图6b、6c所示，Q14多肽可以随着浓度和时间增加，逐渐增强线粒体自噬标志蛋白的降解，说明多肽逐渐增强了细胞中的线粒体自噬水平。LC3‑II蛋白的逐渐增加则进一步表明了多肽Q14对于线粒体自噬的激活。本发明将多肽Q14处理之后的细胞通过免疫共沉淀方法富集细胞中的TOMM20蛋白并用泛素抗体来检测其泛素化水平。如图6d所示，与DMSO处理组和CCCP单独处理组相比，Q14 多肽可明显增加TOMM20蛋白的泛素化，而CCCP与Q14多肽共同处理组则显示出更强的TOMM20的泛素化。除了蛋白水平的检测，本发明还通过检测线粒体mtDNA的变化和ATP的含量变化来检测线粒体自噬。如图6e所示，随着多肽浓度的增高，线粒体mtDNA的含量逐渐减少，表明了多肽的处理增加了线粒体的整体降解。而与解偶联剂CCCP的共孵育使得线粒体降解的增加，说明了多肽的处理使细胞中的USP30功能抑制，线粒体自噬的敏感性更高，更容易受到解偶联剂的诱导导致的线粒体自噬的增强。如图6f所示，随着多肽浓度的增加，细胞线粒体中的ATP含量逐渐减少，证明了多肽增强了线粒体整体的降解。多肽与CCCP共处理的结果表明，多肽处理之后使得线粒体自噬的敏感性，更容易被解偶联剂诱导发生更强烈的线粒体的降解。而在多肽处理之后再与凋亡诱导剂ABT‑737共孵育的结果则显示，多肽抑制了USP30的功能使线粒体自噬增强，使得细胞对凋亡诱导的敏感性增强。总结这部分结果，可以看到多肽Q14可以有效抑制USP30增强细胞中的线粒体自噬而增加线粒体的降解。

[0044] 实施例7:

[0045] 研究报道(Birgisdottir,A.B.,Lamark,T.&Johansen,T.The LIR motif‑crucial for selective autophagy.J Cell Sci 126,3237‑3247(2013).)，在货物识别和摄取阶段， ATG8/LC3/GABARAP家族的蛋白质可以通过LC3‑相互作用域(LC3 interacting region，LIR)或ATG8‑相互作用基序(ATG interacting motif,AIM)与自噬货物受体结合从而进一步将自噬膜连接到自噬货物上。LIR是一段具有含有 [W/F/Y]‑X1‑X2‑[I/L/V](X1，X2代表任何氨基酸)氨基酸的序列，一些蛋白自身含有这段LIR结构域而与线粒体自噬有关，比如FUNDC1、Nix蛋白等。近期的一些研究发现一些含有LIR的多肽对自噬的过程具有较大的影响。陈佺课题组研究发现FUNDC1的LIR基序中Ser‑13的去磷酸化可以增强FUNDC1 和LC3之间的相互作用，从而激活线粒体自噬。在2018年，张明杰课题组利用ANK3的LIR基序(GABARAP结合配体)，在培养的细胞和秀丽隐杆线虫中利用这种相互作用开发有效的和具有选择性的自噬抑制剂。本发明通过搜索 iLIR数据库，发现USP30蛋白上存在一些LIR结构域，而其中一段LIR结构域位于Q14多肽的N末端(WGPI)。Q14多肽上的这段LIR序列引起本发明去探索多肽上的LIR序列是否可以和LC3发生相互作用，使得多肽在细胞中与USP30结合的同时与LC3也存在相互作用，从而将USP30蛋白通过多肽Q14与自噬膜连接起来，进而更进一步促进自噬的过程。为了证明这一点，本发明分别合成了带有Biotin标签的Q14多肽上的Trp和Ile突变为丙氨酸的多肽MT6、MT9以及双突变多肽M2‑mut。利用这些突变的多肽以及分段的多肽Q23、Q26，本发明通过Biotin‑Streptavidin‑拉下实验去验证这些多肽与LC3的相互作用。如图7b所示，Biotin标记的B‑Q14多肽可以拽出LC3 蛋白，分别将Trp和Ile突变为丙氨酸的多肽则丧失了与LC3结合的能力，仅含有LIR区域的多肽(Q26)表现出与Q14一样的与LIR结合的能力，不含有这段LIR区域的多肽(Q23)则不能将LC3拽出来，而双突变的多肽也不能和LC3发生相互作用，这进一步验证了Q14多肽通过LIR序列与LC3发生相互作用(如图7a‑d所示)。