一种器官芯片及其应用

摘要

本发明公开一种器官芯片及其应用，所述芯片包括：多细胞共培养结构和浓度梯度结构，所述浓度梯度结构用于向所述多细胞共培养结构提供预设浓度梯度的液体；所述多细胞共培养结构包括多个细胞培养单元和与所述多个细胞培养单元相对应的液体收集室，所述液体收集室用于收集相对应细胞培养单元排出的液体；所述浓度梯度结构包括平行设置的第一通道和第二通道，所述第一通道上引出间隔设置的多个第一子通道，所述多个第一子通道的出口与所述第二子通道连接，所述第二通道在相邻两个第一子通道之间引出第二子通道，所述第二子通道的出口与所述多个细胞培养单元连接。本发明可实现肝细胞的共培养来模拟体内微环境，从而使药物筛选的结果更准确可靠。

权利要求

1.一种器官芯片，其特征在于，所述芯片包括：多细胞共培养结构和浓度梯度结构，所述浓度梯度结构用于向所述多细胞共培养结构提供预设浓度梯度的液体；

所述多细胞共培养结构包括多个细胞培养单元和与所述多个细胞培养单元相对应的液体收集室，所述液体收集室用于收集相对应细胞培养单元排出的液体；

所述浓度梯度结构包括平行设置的第一通道和第二通道，所述第一通道上引出间隔设置的多个第一子通道，所述多个第一子通道的出口与所述第二通道连接，所述第二通道在相邻两个第一子通道之间引出第二子通道，所述第二子通道的出口与所述多个细胞培养单元连接；

所述多个细胞培养单元中的每个细胞培养单元包括至少一个细胞培养小室，所述至少一个细胞培养小室中的每个细胞培养小室被中间膜分隔成上下两层腔室；

所述每个细胞培养单元的细胞培养小室为两端敞口结构；

每个细胞培养单元中左侧细胞培养小室的上层腔室与一个所述第二子通道的出口连接；

每个细胞培养单元中右侧细胞培养小室的下层腔室与所述细胞培养单元相对应的所述液体收集室连接。

2.根据权利要求1所述的一种器官芯片，其特征在于，所述多个细胞培养单元中的每个细胞培养单元包括至少一个细胞培养小室，相邻所述细胞培养小室之间设置有连接通道。

3.根据权利要求1所述的一种器官芯片，其特征在于，各细胞培养小室的上层腔室位于芯片的上层PMMA层，且各细胞培养小室的上层腔室之间设置有连接通道；

各细胞培养小室的下层腔室位于芯片的下层PMMA层，且各细胞培养小室的之间设置有连接通道。

4.根据权利要求3所述的一种器官芯片，其特征在于，所述中间膜为PET薄膜。

5.根据权利要求1所述的一种器官芯片，其特征在于，所述第一通道为人脐静脉内皮细胞的培养基通道或磷酸盐缓冲溶液通道，所述第二通道为药物通道。

6.根据权利要求2所述的一种器官芯片，其特征在于，所述两端敞口结构与3D细胞打印机相匹配，用于实现细胞的3D打印培养。

7.根据权利要求2所述的一种器官芯片，其特征在于，所述每个细胞培养单元的细胞培养小室的孔径以及所述细胞培养单元的细胞培养小室的分布与常规96孔板尺寸相同。

8.根据权利要求3所述的一种器官芯片，其特征在于，芯片所述上层与所述下层的材料为聚甲基丙烯酸甲酯。

9.一种器官芯片的应用，其特征在于，根据权利要求1‑8任一项所述器官芯片结构的应用，用于模拟接近生理环境的结构功能，使药物筛选的结果更准确。

说明书

一种器官芯片及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微流控器官芯片技术领域，特别涉及一种一种器官芯片及其应用。

背景技术

[0002] 器官芯片为微流控器官芯片的简称，是一种多通道，包含有连续灌流腔室的三维细胞培养装置，由两部分组成，一部分为由芯片和细胞按照自然器官的比例和顺序搭建的本体，另一部分包括相应器官周边的细胞，分泌物和物理力组成的微环境。随着现代医学和现代药理学的发展，采用动物的组织，器官制备的药物筛选模型越来越多，如离体血管实验，心脏灌流实验，组织培养实验等方法。但此种模型规模小，效率低，反应药物作用有限，对样品的需求量较大，不易实现一药多筛，此外，人工操作技术要求高等也是影响其在药物筛选中应用的主要原因之一。

[0003] 目前，器官芯片经过近10年的发展，多种人体器官芯片，如：肝芯片、肺芯片、肠芯片、肾芯片、血管芯片、心脏芯片等已被开发出来，但大多芯片为单一种类的细胞二维培养，与自然器官的体内微环境还具有较大的差距，用于药物筛选很难得出与体内测试相似或相同的结果，且芯片内细胞多为封闭式培养，限制了药物筛选过程中的细胞及蛋白的分析检测。

发明内容

[0004] 为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种器官芯片及其应用。所述技术方案如下：

[0005] 一方面，提供了一种器官芯片，所述芯片包括：

[0006] 多细胞共培养结构和浓度梯度结构，所述浓度梯度结构用于向所述多细胞共培养结构提供预设浓度梯度的液体；

[0007] 所述多细胞共培养结构包括多个细胞培养单元和与所述多个细胞培养单元相对应的液体收集室，所述液体收集室用于收集相对应细胞培养单元排出的液体；

[0008] 所述浓度梯度结构包括平行设置的第一通道和第二通道，所述第一通道上引出间隔设置的多个第一子通道，所述多个第一子通道的出口与所述第二子通道连接，所述第二通道在相邻两个第一子通道之间引出第二子通道，所述第二子通道的出口与所述多个细胞培养单元连接。

[0009] 优选地，所述多个细胞培养单元中的每个细胞培养单元包括至少一个细胞培养小室，相邻所述细胞培养小室之间设置有连接通道。

[0010] 优选地，所述至少一个细胞培养小室中的每个细胞培养小室被中间膜分隔成上下两层腔室；各细胞培养小室的上层腔室位于芯片的上层PMMA层，且各细胞培养小室的上层腔室之间设置有连接通道；

[0011] 各细胞培养小室的下层腔室位于芯片的下层PMMA层，且各细胞培养小室的之间设置有连接通道。

[0012] 优选地，每个细胞培养单元中左侧细胞培养小室的上层腔室与一个所述第二子通道的出口连接；

[0013] 每个细胞培养单元中右侧细胞培养小室的下层腔室与所述细胞培养单元相对应的所述液体收集室连接。

[0014] 优选地，所述中间膜为PET薄膜。

[0015] 优选地，所述第一通道为人脐静脉内皮细胞的培养基通道或磷酸盐缓冲溶液通道，所述第二通道为药物通道。

[0016] 优选地，所述每个细胞培养单元的细胞培养小室为两端敞口结构，所述两端敞口结构与3D细胞打印机相匹配，用于实现细胞的3D打印培养。

[0017] 优选地，所述每个细胞培养单元的细胞培养小室的孔径以及所述细胞培养单元的细胞培养小室的分布与常规96孔板尺寸相同。

[0018] 优选地，芯片所述上层膜与所述下层膜的材料为聚甲基丙烯酸甲酯。

[0019] 另一方面，提供了一种器官芯片的应用，根据器官芯片结构，应用于模拟接近生理环境的结构功能，从而使药物筛选的结果更准确可靠。

[0020] 本发明提供的一种器官芯片及其应用，具有如下技术效果：

[0021] 与现有技术相比，本发明实施例通过器官芯片的多细胞共培养结构与浓度梯度结构相结合的构造，可实现利用多细胞的共培养及细胞的3D培养来模拟体内微环境，使芯片接近生理环境的结构功能特性，从而使药物筛选的结果更准确可靠。

附图说明

[0022] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0023] 图1是本发明实施例提供的一种器官芯片的结构示意图。

[0024] 图2是本发明实施例提供的一种器官芯片灌流前后对HUVEC细胞形态排列变化的示意图。

[0025] 图3是本发明实施例提供的3D肝芯片共培养及2D培养下HepG2细胞白蛋白表达的示意图。

[0026] 图4是本发明实施例提供的一种器官芯片的细胞培养小室的部分截面图。

[0027] 图5是本发明实施例提供的一种器官芯片的浓度梯度仿真结果的示意图。

[0028] 图6是本发明实施例提供的药物苦参碱处理前后HepG2细胞存活率的示意图。

[0029] 图7是本发明实施例提供的药物金雀花碱处理前后HepG2细胞存活率的示意图。

[0030] 图8是本发明实施例提供的器官芯片三层键合后的示意图。

具体实施方式

[0031] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0032] 下面结合图1所示的器官芯片结构图来对本发明实施提供的技术方案进行详细说明。

[0033] 具体的，如图1所示，该器官芯片结构包括多细胞共培养结构和浓度梯度结构，所述浓度梯度结构用于向所述多细胞共培养结构提供预设浓度梯度的液体。

[0034] 在本发明实施例中，该器官芯片不仅仅包括多细胞培养结构和浓度梯度结构，还可以包括贯穿整个药物筛选过程的灌流系统。灌流系统是指药物从浓度梯度结构进入之后，由上层腔室通过PET多孔膜渗透到下层腔室，从最底部的流道排出的整个过程。

[0035] 在本发明实施例中，如图2所示为灌流前后对HUVEC细胞形态排列变化示意图。在肝器官芯片生理指标检测时，灌流共培养后对白蛋白表达进行了检测，并且跟2D培养状态下的白蛋白表达量进行了对比，如图3所示为3D肝芯片共培养及2D培养下HepG2细胞白蛋白表达的示意图，该图表明在3D共培养状态下，白蛋白表达量更高。HUVEC细胞灌流前细胞无序排列，灌流后细胞有方向性排列，说明细胞排列更紧密，便于药物筛选，确保数据的准确性。

[0036] 具体的，多细胞共培养结构包括多个细胞培养单元和与所述多个细胞培养单元相对应的液体收集室，所述液体收集室用于收集相对应细胞培养单元排出的液体。

[0037] 具体的，所述多个细胞培养单元中的每个细胞培养单元包括至少一个细胞培养小室，相邻所述细胞培养小室之间设置有连接通道。

[0038] 在本发明具体实施例中，如图1所示，多细胞培养结构可以包括24个细胞培养小室和8个药物收集小室，排列成8行，每行3个细胞培养小室以及一个药物收集小室，每个小室均有通道连接邻近小室。

[0039] 具体的，所述至少一个细胞培养小室中的每个细胞培养小室被中间膜分隔成上下两层腔室；各细胞培养小室的上层腔室位于芯片的上层PMMA层，且各细胞培养小室的上层腔室之间设置有连接通道；各细胞培养小室的下层腔室位于芯片的下层PMMA层，且各细胞培养小室的之间设置有连接通道。

[0040] 在本发明具体实施例中，如图4所示，为芯片细胞培养小室部分截面图，每一个细胞培养小室由PET薄膜隔成上下两个均等的腔室，浓度梯度结构以及各细胞培养小室的上层腔室位于芯片的上层PMMA层，药物收集小室以及各细胞培养小室的下层腔室位于芯片的下层PMMA层。

[0041] 所述PET薄膜也称PET多孔膜，其为一种性能比较全面的包装薄膜，其强韧性是所有热塑性塑料中最好的，抗张强度和抗冲击强度比一般薄膜高得多，其透明性好，有光泽，具有良好的气密性等性质作为选择中间膜提供可靠依据。

[0042] 具体的，每个细胞培养单元中左侧细胞培养小室的上层腔室与一个所述第二子通道的出口连接；每个细胞培养单元中右侧细胞培养小室的下层腔室与所述细胞培养单元相对应的所述液体收集室连接。

[0043] 在本发明具体实施例中，器官芯片的构造排列成8行的细胞培养小室中左端小室与浓度梯度结构相连接，每一行分别连接不同浓度药物的出口。每一行的左边三个培养小室用于细胞培养，同时可作为同一浓度药物处理的三个平行样，每一行最右端的小室为反应后的药物收集小室，用于检测药物处理后细胞分泌物的收集。

[0044] 具体的，所述浓度梯度结构包括平行设置的第一通道和第二通道，所述第一通道上引出间隔设置的多个第一子通道，所述多个第一子通道的出口与所述第二子通道连接，所述第二通道在相邻两个第一子通道之间引出第二子通道，所述第二子通道的出口与所述多个细胞培养单元连接。

[0045] 具体的，所述第一通道为人脐静脉内皮细胞的培养基通道或磷酸盐缓冲溶液通道，所述第二通道为药物通道。

[0046] 在本发明具体实施例中，平行通道的两个入口，一侧是药物入口，一侧HUVEC的培养基或PBS溶液入口，混合两者溶液，形成药物浓度梯度。

[0047] 药物及HUVEC的培养基或PBS溶液通过浓度梯度结构的两个入口同时进入通道，并在通道中进行层流混合，形成8个浓度梯度，进入8行细胞培养小室。其中，层流混合是把药物和培养基或PBS溶液从两个平行通道入口加进去之后，通过层流混合形成浓度梯度。

[0048] 药物浓度梯度形成之后，药物到达左侧三个细胞培养小室后聚集，此后药物及药物刺激后的HUVEC的细胞分泌物缓缓通过PET多孔膜上的小孔进入膜下层，使下层HepG2细胞受到药物刺激，最终两种细胞经由药物刺激后的分泌物聚集在每行最右端的孔即药物收集小室中后采集分析。

[0049] 如图5所示，浓度梯度仿真结果的示意图，可通过药物浓度的大小，使其进入不同的浓度梯度通道，进行高通量的药物筛选功能，高通量筛选技术具有微量、快速、灵敏和准确等特点，可通过一次实验获得大量有价值的信息，便于使药物筛选的结果更准确可靠。

[0050] 在本发明具体实施例中，如图6、图7分别为苦参碱、金雀花碱药物处理前后HepG2细胞存活率的示意图，在对药物检测时，注射药物用的是苦参碱和金雀花碱，下层肝细胞用苦参碱及金雀花碱通过浓度梯度进行处理后，对细胞的存活率进行了检测，说明HepG2活性降低，便于药物检测。

[0051] 具体的，所述每个细胞培养单元的细胞培养小室为两端敞口结构，所述两端敞口结构与3D细胞打印机相匹配，用于实现细胞的3D打印培养。

[0052] 在本发明具体实施例中，细胞培养小室设计为两端敞口结构，细胞接种时，首先进行下层细胞的打印，下层细胞打印时候将器官芯片翻转，在细胞培养小室中多孔膜的下层铺上一层胶原及matrigel 1：1的混合物，然后利用3D细胞打印机打入matrigel和肝细胞的混合细胞悬液(同样适用于手动加入matrigel和肝细胞的混合细胞悬液)，将其打在基质胶上，让细胞3D生长，整个过程在冰上操作。肝细胞混合细胞悬液加入后，将器官芯片放入培养箱培养过夜，等待matrigel完全凝固后在器官芯片上贴上一层经过高压灭菌的医用压敏膜，并用滚轮按压使膜与芯片完全贴合，再将芯片翻转回来，在多孔膜的上层利用3D细胞打印机打入确定数量的HUVEC细胞，或者手动加入一定量的HUVEC细胞悬液，培养箱培养过夜待细胞贴壁。细胞完全贴壁后，利用泵从浓度梯度结构的两个入口同时加入培养基，培养基通过多孔膜进入下层后对上层的HUVEC细胞形成剪切力，剪切力的大小可以经由PET多孔膜的孔径大小进行调节。细胞共培养3天后，将浓度梯度一侧入口的培养基换成药物，对细胞进行药物处理。并在药物注入的同时，清空每列底端小室中的培养基，为了让液体更好的流入，同时也便于药物处理后的细胞分泌物收集。

[0053] 具体的，敞口设计相比于现有技术封闭式培养的优点在于能够于细胞打印技术相匹配，实现细胞的3D打印培养，与此同时，还可以控制打入准确数量的HUVEC细胞，同时，药物处理后的细胞除了对细胞分泌物的检测，更可以将细胞取出进行更多手段的检测，如流式细胞仪及WESTEN等分析。

[0054] 具体的，所述每个细胞培养单元的细胞培养小室的孔径以及所述细胞培养单元的细胞培养小室的分布与常规96孔板尺寸相同。

[0055] 在本发明具体实施例中，细胞培养单元的细胞培养小室的分布与常规96孔板尺寸相同，则可直接将器官芯片放入酶标仪等仪器中进行直接读数，省掉的转移的步骤，既方便又快捷。

[0056] 具体的，芯片所述上层膜与所述下层膜的材料为聚甲基丙烯酸甲酯。

[0057] 在本发明实施例中，芯片使用材料是聚甲基丙烯酸甲酯，即PMMA材料，PMMA材料为上下两层，根据浓度梯度结构和细胞培养室相连接的通道设计以及细胞培养小室的孔的切割，切割后在两层PMMA细胞培养小室的孔部分夹入PET膜后进行键合，芯片键合的方式为涂胶键合，采用固态胶粘剂作为器官芯片的粘结剂，通过胶粘接加温与常温键合，使其三层键合在一起，最后得到一个结构完整的芯片，如图8所示，为器官芯片三层键合后的示意图。在器官芯片键合工艺中，选择胶粘键合的方式，旨在使PET膜与PMMA层贴合更好，避免出现漏液等问题。

[0058] 在一实施例的实施方式中，可以保护该器官芯片结构的应用，根据所述器官芯片结构，应用于模拟接近生理环境的结构功能，使药物筛选的结果更准确。

[0059] 由本发明实施例的上述方案可见，本发明通过肝血窦结构的模拟及芯片中细胞的3D培养和共培养模式能更好的模拟体内肝脏微环境，从而使药物筛选的结果更加准确，细胞培养小室采用两端敞口设计，其能于细胞打印技术相匹配，实现细胞的3D打印培养，同时可准确控制细胞数接种。芯片使用的材料是PMMA，其加工属于自动化工艺，比较适合量产，而且确保了芯片的质量。

[0060] 以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。