一种具有良好的形状记忆、血液凝固能力的可注射可降解干态止血晶胶及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN201910702685.7
文献号 : CN112386736B
文献日 : 2021-10-08
发明人 : 郭保林 , 赵鑫
申请人 : 西安交通大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种具有良好的形状记忆、血液凝固能力的可注射可降解干态止血晶胶的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)将壳聚糖重悬在去离子水中,再搅拌滴加冰乙酸,混合均匀得到CS溶液;将盐酸多巴胺加入到去离子水中配制成DA溶液;
(2)将CS溶液和DA溶液混合,同时加入氧化剂溶液混合均匀,得到混合液,其中,CS的最终质量浓度是0.5~2%,DA的终浓度是0.5~9mg/mL;
(3)将混合液置于‑7~‑20℃进行反应12~36h,得到冰冻状态的交联晶胶网络,将冰冻状态的交联晶胶网络置于去离子水中进行融化,冷冻干燥得到具有良好的形状记忆、血液凝固能力的可注射可降解干态止血晶胶;
步骤(2)中,CS溶液、DA溶液和氧化剂溶液均置于冰浴中进行预冷却,然后再进行混合;
步骤(2)中的氧化剂是高碘酸钠。
2.根据权利要求1所述的一种具有良好的形状记忆、血液凝固能力的可注射可降解干态止血晶胶的制备方法,其特征在于:步骤(1)的CS溶液中,壳聚糖、去离子水和冰乙酸之间的比例为1.0g:(39~160)mL:(1000~4000)μL。
3.根据权利要求1所述的一种具有良好的形状记忆、血液凝固能力的可注射可降解干态止血晶胶的制备方法,其特征在于:步骤(1)中,混合均匀是在50~60℃加热搅拌30~
60min完成的。
4.根据权利要求1所述的一种具有良好的形状记忆、血液凝固能力的可注射可降解干态止血晶胶的制备方法,其特征在于:高碘酸钠与多巴胺的摩尔比为(0.5~1):1。
5.根据权利要求1所述的一种具有良好的形状记忆、血液凝固能力的可注射可降解干态止血晶胶的制备方法,其特征在于:步骤(3)中,冷冻干燥是在‑80℃进行的。
6.利用权利要求1‑5任意一项所述制备方法制得具有良好的形状记忆、血液凝固能力的可注射可降解干态止血晶胶。
7.如权利要求6所述具有良好的形状记忆、血液凝固能力的可注射可降解干态止血晶胶在制备止血药物中的应用。
8.如权利要求6所述具有良好的形状记忆、血液凝固能力的可注射可降解干态止血晶胶在制备止血药物中的应用,其特征在于:所述的止血包括创伤止血或者凝血障碍止血;所述的可注射可降解干态止血晶胶在凝血酶的磷酸盐缓冲液中溶胀,随后对其冷冻干燥处理,获得负载凝血酶的干态止血晶胶;该负载凝血酶的干态止血晶胶在制备止血药物中的应用。
说明书 :
一种具有良好的形状记忆、血液凝固能力的可注射可降解干
态止血晶胶及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
报道或商业止血剂对体表出血伤口具有高止血效率,如组织粘合剂,戊二醛交联白蛋白,基
于沸石的QuickClot,基于纤维蛋白的绷带或基于明胶的止血剂,它们通常对由小口径火
器,战场和日常生活中的简易爆炸装置引起的深度伤口无效。因为这些伤口形状不规则且
不可按压。此外,患有凝血病,如血友病,糖尿病,肝病或期晚期癌症的患者,其凝血因子缺
乏或影响凝血酶形成的功能障碍经常出现延迟止血,这进一步增加了患者因过度出血而死
亡的风险。因此,不可按压性出血和患有凝血病的患者的止血都是该领域的两个主要挑战。
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好的性能,但是他们仍然有局限性。比如,含有多种压缩纤维素海绵的XStat 不可生物降
解,需要更多时间从伤口上小心地清除每块海绵;形状记忆聚合物泡沫通常吸收液体的能
力有限,需要数十秒才能恢复其初始形状,导致延长止血时间造成更多的失血。此外,尚未
有研究报道形状记忆材料对凝血障碍模型的止血效率,并且由于缺乏生物活性止血组合
物,它们可能对凝血病患者的止血效率较低。因此,人们备受期待开发一种制备简便、使用
安全的形状记忆止血材料。它能够吸收大量血液快速恢复形状,同时可以对血液进行浓缩,
并具有生物降解性和加载止血生物活性分子的能力,达到迅速止血的目的。因此,对凝血障
碍患者的止血,是一个持续的挑战。
发明内容
低廉,同时制得的晶胶具有可注射性、可降解性、血液触发的形状记忆恢复作为物理屏障进
行止血、近红外辅助的优良光热抗菌性能及促进伤口愈合性能。
血液凝固能力的可注射可降解干态止血晶胶。
干态止血晶胶;该负载凝血酶的干态止血晶胶在制备止血药物中的应用。
此外,聚多巴胺及其上的儿茶酚基团可改善体内凝血效率并减少凝血病患者出血,壳聚糖
可以通过体液中的溶菌酶在体内降解,采用聚多巴胺的生物材料也可以降解。因此,壳聚糖
通过多巴胺聚合可以形成可生物降解的壳聚糖/聚多巴胺(CS/PDA)晶胶,其对于不可按压
的出血和凝血病性出血具有极好的止血能力。
胶接触到液体,在压缩态晶胶网络储存的弹性势能的驱动下,晶胶会瞬间吸收液体膨胀。
压力去除,晶胶立即吸收自由水恢复原状。
而将细菌光热裂解。
外,晶胶拥有可注射性,允许直接将其注射到狭窄的深部的创伤,随后其吸收并浓缩血液,
一方面加快凝血,另一方面体积恢复的晶胶可以提供足够机械性能作为物理屏障应用于深
部的伤口压迫止血。
血模型中显示出优异的止血能力,在小鼠、大鼠及兔创伤模型相应的抗凝模型和致死性不
可按压猪锁骨下动脉和静脉完全横断模型中仍然显示出出色的止血能力。在使用和不使用
抗凝血药物(利伐沙班)的情况下,优化的晶胶在创伤模型中均比美国战斗纱布和明胶止血
海绵显著缩短了止血时间,且具有更少的失血量,这归因于其平衡血液吸收和血液浓缩能
力,优良的血细胞和血小板粘附和活化能力。特别是,在致死性不可按压猪锁骨下动脉和静
脉完全横断模型中,晶胶的止血时间比纱布短得多,出血量少的多,动物存活率为100%。此
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外,晶胶比壳聚糖海绵和Tegaderm 薄膜具有更好的伤口愈合效果。CS/PDA晶胶止血敷料具
有多种功能,可作为非按压性出血止血,凝血病出血止血和伤口愈合应用的优良候选物。
CS/PDA晶胶,其提高的止血效果来自于凝血酶的凝血效果。
附图说明
2(g)为本发明制得的CS20/PDA4.5晶胶循环100次的压缩应力‑应变循环曲线。
近红外808nm的辐射功率为1.4W/cm;图3(b)本发明制得的CS20/PDA4.5晶胶在不同近红外
808nm辐射功率下的温度变量‑近红外辐射时间曲线。
L10CFU/mL金黄色葡萄球菌和大肠杆菌后,使用近红外808nm(1.4W/cm)辐射不同时间时,
其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌杀死量的对数时间曲线。
6(c)是本发明所制得晶胶与L929直接接触培养24小时后细胞的存活率。
得晶胶在兔肝脏缺损不可按压出血模型止血测试中的流血量;图11(d)本发明所制得晶胶
在兔肝脏缺损不可按压出血模型止血测试中的止血时间;图11(e)至图11(g)为小鼠、大鼠
及兔创伤模型相应的抗凝模型止血测试中的流血量;图11(h)本发明所制得晶胶在兔肝脏
缺损不可按压出血抗凝模型止血测试中的止血时间;均是以战斗纱布和明胶止血海绵作为
对照组。
静脉完全横断模型止血测试中的流血量;图12(c)本发明所制得晶胶在致死性不可按压猪
锁骨下动脉和静脉完全横断模型止血测试中的止血时间;以纱布作为对照组。
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绵、Tegaderm 敷料在第3天,第7天以及第15天的创伤再生组织的组织学观察。
具体实施方式
好的生物相容性,壳聚糖的止血性能是固有的,其可以增进与血细胞、血小板的作用从而提
高晶胶的促凝血性能。聚多巴胺的引入不仅可以对晶胶的机械性能进行增强,还可以赋予
晶胶近红外辅助的光热抗菌性,同时进一步提高晶胶的促凝血效果。基于CS的晶胶具有良
好的可注射性和良好的形状记忆性能,其赋予晶胶干态形状压缩固定性能以及超快的血液
触发形状恢复性能。这些性能使得该晶胶材料可以通过针管注射到深部的狭窄的不可按压
性止血创伤内部,并且立即吸收血液并恢复体积。该过程不仅可以快速浓缩血液加速凝血,
其还可以作为物理屏障对伤口进行堵塞止血。除此之外,CS/PDA晶胶亦可促进伤口愈合。因
此,基于CS的可注射形状记忆的晶胶止血材料对于深部的狭窄的不可压缩止血的创伤出血
止血具有重要的应用潜力。
160)mL:(1000~4000)μL;将盐酸多巴胺(DA)加入到去离子水中配置成DA溶液;
的终浓度是0.5~9mg/mL;氧化剂是高碘酸钠;高碘酸钠与多巴胺的摩尔比为0.5~1:1;
记忆、血液凝固能力的可注射可降解干态止血晶胶。
旦再次接触到水,其会立即恢复原状并吸收大量的水;或者冻干状态的晶胶可以被压缩,在
挤出空气后,其可以维持压缩状态,一旦再次接触到水,其会立即吸收水并恢复原状。本发
明制备的晶胶具有可注射性,具体是指其可以利用注射器送入狭窄的且深的创伤内部。本
发明制备的晶胶具有可降解性,具体是指壳聚糖可以通过体液中的溶菌酶在体内降解,采
用聚多巴胺的生物材料也可以降解。本发明制备的晶胶的光热抗菌性能是指,晶胶中的PDA
吸收近红外可以产热,随后光热裂解细菌提供出色抗菌性能。本发明制备的晶胶可以加速
凝血,具体是指形状固定态的晶胶在接触到血液时,可以快速的吸收血液并且浓缩血液从
而加速凝血,另外一方面是CS/PDA晶胶的本身组成成份有利于促进凝血过程。
的比例为1.0g:39mL:1000μL;将盐酸多巴胺加入到去离子水中配置成5mg/mL的DA溶液;将
高碘酸钠加入到去离子水中配置成5.64mg/mL的SP溶液;高碘酸钠与多巴胺的摩尔比为1:
1。随后,将CS溶液、DA溶液和SP溶液置于冰水混合浴中充分预冷后再充分混合,获得CS的终
浓度是2.0wt%,DA的终浓度是0.5mg/mL。随后将混合液置于‑20℃低温反应器进行反应
36h。反应结束后,将晶胶置于去离子水中进行融化,并于‑80℃进行冷冻干燥,即可得具有
血液触发形状恢复的可注射可降解干态晶胶止血敷料CS20/PDA0.5晶胶。
每克干态晶胶中约含有6000U凝血酶,获得负载凝血酶的CS20/PDA4.5止血晶胶。
特征吸收峰。与纯CS相比,CS/PDA晶胶的红外图谱显示在1587cm 处氨基吸收减少,但在
‑1
1633cm 处出现了新的席夫碱基的特征吸收峰,这表明CS骨架上的氨基与多巴胺的邻醌发
生了席夫碱反应,证明了CS/PDA晶胶的形成。
轴向力不断增高。此外,除CS20/PDA9.0晶胶外,所有的CS20/PDA晶胶在承受80%以内的应
变时,经历5次循环应力‑应变压缩后均保持完整形状和良好的弹性,且随着DA含量的增加,
晶胶样品呈现出逐渐降低的回复率,但是所有的晶胶样品仍然保持未破损的完整形状。图2
(g)显示CS20/PDA4.5晶胶经历100次循环应力‑应变压缩后均仍保持完整形状和良好的弹
性。这些结果说明,依照本发明方法制得的晶胶可以利用DA增强晶胶强度的同时,不会严重
影响晶胶的压缩回弹性,从而为形状记忆止血晶胶提供良好的形状回复率以及足够的可调
的机械性能。
2
cm ,随着DA含量的逐渐增加,晶胶的温度变化(ΔT)逐渐从10℃升到19℃。当DA含量达到
4.5mg/mL时,ΔT即可达到最高19℃,继续增加DA含量到7.5mg/mL时温度不再增加。图3(b)
中使用CS20/PDA4.5晶胶进一步研究了不同近红外辐射强度下晶胶的光热效应,可以发现
2 2
随着近红外光功率逐渐从1.0W/cm增加到1.8W/cm时,CS20/PDA4.5晶胶的ΔT也逐渐从10
℃升到25℃。因此,说明CS20/PDA晶胶具有出色且可调的近红外光热效应。
(1.4W/cm)下10CFU/mL细菌的杀死量的对数来进行测量。该测试以CS20/PDA4.5晶胶和PBS
为例进行研究。图4(a)和图4(b)可以看出当近红外光照时间逐渐从0min增加到10min时,
CS20/PDA4.5晶胶的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌杀死量不断增加,且当照射时间10min时可
以杀死全部细菌。PBS对照组在不同时间照射下细菌杀死量保持不变。因此,可以说明CS20/
PDA4.5晶胶可以通过DA的光热效应极显著的提高抗菌性能。
释放曲线比阿莫西林慢,因为万古霉素的分子量高得多。因此,可以说明多孔晶胶可以通过
简单地吸收药物溶液然后冷冻干燥来包封生物活性分子(例如抗生素或止血药物)。
率仍然不超过5%。图6(b)的结果可以看出,当所有晶胶样品的萃取液浓度从5mg/mL增加到
20mg/mL时,他们均表现出高于90%的细胞存活率,并且和组织培养板组没有明显差异。图6
(c)的结果可以看出,CS20/PDA晶胶与细胞接触培养一天后,细胞均呈现出高于90%的存活
率。因此,所有的晶胶样品均呈现出较好的血液相容性。此外,所有晶胶样品的渗出物没有
明显的细胞毒性。
然呈现出较高的凝血指数,而战斗纱布组比明胶海绵组凝血指数大幅降低。然而,所有的晶
胶组在相同的时间点呈现出比战斗纱布更低的凝血指数。因此,说明CS20/PDA晶胶具有有
效的凝血性能。
且闭合的孔。但是所有的晶胶样品均保持未破损的晶胶网络结构。当形状固定态的晶胶吸
收液体恢复后,所有的晶胶样品均呈现出与其原始状态相似的微观相貌。因此,说明晶胶既
有良好的形状固定性能又具有优秀的形状恢复性能。
大量的血细胞粘附,而且粘附的血细胞呈现出不规则的聚集。所以,说明晶胶促进血细胞的
粘附,并且可以激活血细胞。
仅仅呈现出少数的血小板粘附。因此,说明CS20/PDA晶胶可以促进血小板的粘附与激活,加
入DA后可以进一步促进血小板的粘附和激活。
战斗纱布组都呈现出更少的流血量,此外CS20/PDA4.5晶胶呈现出最低的流血量。图11(b)
为晶胶的大鼠肝脏圆形切片模型的流血量测试结果,从其可以看出,战斗纱布组、明胶止血
海绵组以及晶胶样品组都表现出相似的流血量,且他们的流血量都明显少于空白组。图11
(c)为晶胶的兔肝脏缺损不可按压出血模型的流血量测试结果,从其可以看出,明胶海绵D2
(直径12mm)组较D1(直径9mm)组流血量显著减少,而CS20/PDA4.5晶胶呈现出最低的流血
量。图11(d)为晶胶的兔肝脏缺损不可按压出血模型的止血时间测试结果,从其可以看出,
晶胶样品组相比于空白组、明胶海绵D1及D2组都表现出更短的止血时间。图11(e)至图11(g)
为小鼠、大鼠及兔创伤模型相应的抗凝模型中的流血量测试结果,从其可以看出,CS20/
PDA4.5晶胶和CS20/PDA4.5/T晶胶与空白组、战斗纱布组及明胶止血海绵组相比较均表现
出更少的流血量。图11(h)为兔肝脏缺损不可按压出血抗凝模型中的止血时间测试结果,从
其可以看出两个晶胶组都表现出较低的止血时间,他们的止血时间均显著短于空白组及明
胶止血海绵组。因此,CS20/PDA4.5晶胶可以促进止血,尤其是加入一定量的DA后可以进一
步促进止血效果。此外,针对于深部的、不可按压止血的新西兰兔子肝脏体积缺损致死流血
模型,含有DA的晶胶表现出最好的止血效果。
不可按压猪锁骨下动脉和静脉完全横断模型止血测试中的流血量和止血时间,从其可以看
出晶胶组的流血量和止血时间均显著低于纱布组。因此,针对于深部的、不规则的、不可按
压止血的猪锁骨下动脉和静脉完全横断模型,晶胶表现出良好的止血效果。
果可以看出,处理3天后,壳聚糖海绵、CS20/PDA4.5晶胶与Tegaderm 敷料相比伤口愈合率
TM
没有差异。处理7天后,壳聚糖海绵和CS20/PDA4.5晶胶均表现出比Tegaderm 敷料更高的伤
口愈合率,且CS20/PDA4.5晶胶组的伤口愈合率显著高于壳聚糖海绵组。处理15天后,壳聚
TM
糖海绵和CS20/PDA4.5晶胶的小鼠都表现出100%的愈合率,显著高于Tegaderm 敷料组。图
TM
13(b)可以看出,处理3天后,所有的组都表现出不同程度的炎症反应,并且Tegaderm 敷料
呈现出更多的炎症细胞。处理7天后,所有组的炎症反应逐渐得到改善,并且炎症细胞变少,
此外,CS20/PDA4.5晶胶在第7天的血管化最高。处理15天后,所有组的炎症反应均不明显,
并且血管化随着时间延长在所有处理组中逐渐减弱。CS20/PDA4.5晶胶呈现出更好的毛囊
形成。因此,说明CS20/PDA4.5晶胶可以通过促进血管化和调节炎症反应来加速伤口愈合。
160mL:4000μL;将盐酸多巴胺加入到去离子水中配置成90mg/mL的DA溶液;将高碘酸钠加入
到去离子水中配置成50.76mg/mL SP溶液。随后,将CS溶液、DA溶液和SP溶液置于冰水混合
浴中充分预冷后再充分混合,调节CS的终浓度是0.5wt%,DA的终浓度是9mg/mL;高碘酸钠
与多巴胺的摩尔比为0.5:1。随后将混合液置于‑7℃冰乙醇进行反应24h。反应结束后,将晶
胶置于去离子水中进行融化,即可得具有血液触发形状恢复的可注射可降解晶胶止血敷料
CS5/PDA9晶胶。
1.0g:80mL:2000μL;将盐酸多巴胺加入到去离子水中配置成10mg/mL的DA溶液;将高碘酸钠
加入到去离子水中配置成9.024mg/mL SP溶液。随后,将CS溶液、DA溶液和SP溶液置于冰水
混合浴中充分预冷后再充分混合,调节CS的终浓度是1wt%,DA的终浓度是1mg/mL;高碘酸
钠与多巴胺的摩尔比为0.8:1。随后将混合液置于‑15℃冰乙醇进行反应12h。反应结束后,
将晶胶置于去离子水中进行融化,即可得具有血液触发形状恢复的可注射可降解晶胶止血
敷料CS10/PDA1晶胶。