一种生物质化学-酶法制备L-呋喃丝氨酸的方法

摘要

本发明公开了一种生物质化学‑酶法制备L‑呋喃丝氨酸的方法，属于生物化工领域。本发明提供了一种优化了制备工艺的Fe3O4@MCM‑41/SO42–，并将其用于生物质化学‑酶法生产L‑呋喃丝氨酸的工艺。本发明的L‑呋喃丝氨酸的生产方法省去了中间物的分离过程，生物相容性好，步骤简单，过程经济环保，可使L‑呋喃丝氨酸的产率达73.6％，为β‑羟基‑α‑氨基酸的绿色可持续制造提供了参考。

权利要求

1.一种制备L‑呋喃丝氨酸的方法，其特征在于，以玉米芯粉为原料，加入终浓度20～

2–

25g/L的磁性固体酸Fe3O4@MCM‑41/SO4 在160–200℃下反应5–180min制备糠醛，再加入糠醛

10倍摩尔当量的甘氨酸，终浓度5–50μM PLP和苏氨酸醛缩酶，在28–30℃反应；

2–

其中所述磁性固体酸Fe3O4@MCM‑41/SO4 的制备方法按照(a)–(c)所示：(a)将三价铁盐与二价铁盐以2:(1–1.2)的摩尔比在水相中混合，在氮气保护下，升温至80℃以上，加入NH3·H2O溶液，利用磁场分离得到Fe3O4磁性颗粒；

(b)将粉煤灰与含盐酸的溶液混合，在70℃以上搅拌4h，过滤，洗涤，干燥，得到预处理后的粉煤灰，再与2倍重量的氢氧化钠混合，在500℃以上加热1h得到的碱熔粉煤；将得到的碱熔粉煤灰与水按1:3‑5质量比混合，搅拌至少20h，过滤后得到淡黄色的硅酸钠溶液；

(c)将步骤(a)制备好的Fe3O4磁性颗粒在水中分散，加入氨水并搅拌，再加入CTAB水溶液，加入步骤(b)制备的硅酸钠溶液，反应至少20h，再将pH值调至10–11，在100‑120℃热处理至少20h，磁分离收集固体产品，清洗后干燥得到Fe3O4@MCM‑41；

(d)将步骤(c)的Fe3O4@MCM‑41在(NH4)2SO4溶液中浸渍至少24h，磁分离和干燥后，在

2–

450‑550℃煅烧2‑3h得到固体酸Fe3O4@MCM‑41/SO4 。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述苏氨酸醛缩酶为纯酶液，或表达苏氨酸醛缩酶的微生物细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述苏氨酸醛缩酶来源于恶臭假单胞杆菌。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述表达苏氨酸醛缩酶的微生物细胞在反应体系中的湿菌体浓度为5–100g/L。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述玉米芯的粒径为40–60目。

6.根据权利要求1–5任一所述的方法，其特征在于，所述方法还对反应后的反应液进行分离、纯化处理。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述分离、纯化的具体步骤为：(1)将反应液通过磁分离和过滤去除固体酸催化剂和玉米芯残渣；

(2)用乙醚萃取反应混合物以去除未反应的糠醛；

(3)向步骤(2)萃取后的水相中加入400mL甲醇，在4℃下孵育12h，收集沉淀的甘氨酸并用甲醇洗涤；

(4)将甲醇蒸发后的残渣溶解在pH 8.0磷酸盐缓冲液中，加入过量的甘氨酸氧化酶分解剩余的甘氨酸；

(5)将步骤(4)反应后的酶解液在阴离子交换树脂上纯化，用0.5％醋酸洗脱树脂；

(6)收集步骤(5)的洗脱液，蒸发浓缩后在4℃下结晶得到L‑呋喃丝氨酸。

8.权利要求1–7任一所述方法在制备含糠醛和/或L‑呋喃丝氨酸的产品方面的应用。

说明书

一种生物质化学‑酶法制备L‑呋喃丝氨酸的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种生物质化学‑酶法制备L‑呋喃丝氨酸的方法，属于生物化工领域。

背景技术

[0002] 生物质的利用不仅可以缓解化石能源枯竭和环境污染危机，而且增加了对废弃资源的利用途径，对农业经济发展也起到了支持作用。

[0003] 糠醛，又名呋喃甲醛，是呋喃系的衍生物，作为一种生物基平台化合物，可进一步转化为精细化学品和燃料。一步稀酸法糠醛生产因其设备投资少，操作简单，在糠醛工业中
得到了广泛的应用。但是，糠醛传统的一步稀酸生产工艺收率低、能耗高、污染严重，而且该
过程只利用了生物质中的半纤维素，而纤维素等未被利用，原料利用率低。为了推进糠醛行
业的进一步发展，研究开发磁性固体酸催化剂用于制备糠醛，反应结束后该磁性固体酸可
以通过外界磁场与反应体系快速抽离，并且过滤所得的纤维素残渣进一步被纤维素酶水解
得到葡萄糖。

[0004] 呋喃丝氨酸(FLSE)属于呋喃β‑羟基‑α‑氨基酸，是重要的糠醛高附加值衍生产品，可作为呋喃类抗生素和2‑氨基‑1‑呋喃‑2‑乙醇的前体。一般地，FLSE通过化学法合成，但在
此过程中需要消耗大量的有机溶剂和强碱，并且反应需控制在4℃左右，反应时间较长
(Dullaghan M.E.,et al.Journal of the American Chemical Society,1951,73(11):
5455.)。因此，选择性好以及对环境友好的生物催化方法亟待开发。

发明内容

[0005] 本发明针对L‑呋喃丝氨酸传统有机合成的问题，提出了一种高效的一锅化学‑酶催化工艺途径，将木质纤维素原料直接转化为L‑呋喃丝氨酸。该方法制备简单，步骤少，易
于操作，过程经济高效。

[0006] 本发明的第一个目的是提供一种磁性固体酸Fe3O4@MCM‑41/SO42–，包括(a)–(c)所示步骤：

[0007] (a)将三价铁盐与二价铁盐以2:(1–1.2)的比例在水相中混合，在氮气保护下，升温至80℃以上，加入NH3·H2O溶液，利用磁场分离得到Fe3O4磁性颗粒；

[0008] (b)将粉煤灰与含盐酸的溶液混合，在70℃以上搅拌4h，过滤、洗涤、干燥，得到预处理后的粉煤灰，再与2倍重量的氢氧化钠混合，在500℃以上加热1h；将得到的碱熔粉煤灰
与水按1:4比例混合，在室温下搅拌24h，过滤后得到淡黄色的硅酸钠溶液；

[0009] (c)将步骤(a)制备好的Fe3O4在水中分散，加入氨水并搅拌，再加入溶于热水的CTAB，继续搅拌；慢慢加入步骤(b)制备的硅酸钠溶液，持续反应24h，再将pH值调至10.5，在
110℃的反应釜中水热处理24h，磁分离收集固体产品，清洗后干燥得到Fe3O4@MCM‑41。

[0010] (d)将步骤(c)的Fe3O4@MCM‑41研磨，用3M(NH4)2SO4溶液浸渍至少24h，磁分离和干2–
燥后，在500℃煅烧3h得到固体酸Fe3O4@MCM‑41/SO4 。

[0011] 在一种实施方式中，所述磁性固体酸的制备方法具体为：

[0012] (1)将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O溶解于搅拌式反应器中，Fe3+与Fe2+的摩尔比为2.0:1.1。在氮气保护下，升温至85℃，在高速搅拌下加入NH3·H2O溶液，利用磁场将沉积的
产物分离，即得到Fe3O4磁性颗粒；

[0013] (2)将粉煤灰原料与20％盐酸混合，在80℃下搅拌4h，去除铁、钙等杂质，然后过滤、洗涤、干燥，得到预处理后的粉煤灰，然后将氢氧化钠按重量比1:2均匀混合，在550℃下
加热1h。将得到的碱熔粉煤灰与去离子水按1:4比例混合，在室温下搅拌24h，过滤后得到淡
黄色的硅酸钠溶液，作为制备MCM‑41的硅源；

[0014] (3)将步骤(1)制备好的Fe3O4在去离子水中分散，加入氨水后室温搅拌1h。将溶于热水的CTAB，慢慢加入到Fe3O4分散体中，继续搅拌1h。将硅酸钠溶液慢慢加入到悬浮液中，
缓慢搅拌，使反应持续24h。并将磁性复合材料的pH值调至10.5，在110℃的反应釜中水热处
理24h。固体产品磁分离并用去离子水清洗，最后在60℃烘箱中干燥24h。将制备得到的
–1
Fe3O4@MCM‑41经研磨并用3M(NH4)2SO4溶液按15mL·g 浸渍24h。磁分离和干燥后，在500℃
2–
煅烧3h得到固体酸Fe3O4@MCM‑41/SO4 。

[0015] 本发明还提供所述磁性固体酸Fe3O4@MCM‑41/SO42–在制备糠醛中的应用。

[0016] 本发明还提供一种生物质化学‑酶法生产制备L‑呋喃丝氨酸的方法，是以玉米芯2–
粉为原料，加入磁性固体酸Fe3O4@MCM‑41/SO4 在160–200℃下反应5–180min，再加入糠醛10
倍摩尔当量的甘氨酸，5–50μM PLP和苏氨酸醛缩酶催化剂，在28–30℃反应。

[0017] 在一种实施方式中，所述苏氨酸醛缩酶为纯酶液，或表达苏氨酸醛缩酶的细胞。

[0018] 在一种实施方式中，所述L‑苏氨酸醛缩酶(PpLTA)来源于恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)的L‑苏氨酸醛缩酶。

[0019] 在一种实施方式中，所述所述L‑苏氨酸醛缩酶具有催化糠醛生产L‑呋喃丝氨酸的能力，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

[0020] 在一种实施方式中，所述方法为：200mL高压反应釜内装有100mL去离子水，5–10g2–
玉米芯粉，0.25–5wt％磁性固体酸Fe3O4@MCM‑41/SO4 ，并在160–200℃下加热搅拌5–
180min。反应结束后，调节pH值为8.0，再加入糠醛10倍摩尔当量的甘氨酸，5–50μM PLP和5–
–1
100g·L 全细胞酶活为4000–80000U/g的重组苏氨酸醛缩酶细胞，在30℃，200rpm条件下进
行生物转化。

[0021] 在一种实施方式中，向反应釜中加入10g玉米芯粉，20–22g/L磁性固体酸Fe3O4@2–
MCM‑41/SO4 ，在160–200℃下加热搅拌5–180min。

[0022] 在一种实施方式中，所述玉米芯购买于当地农产品商店，并粉碎至40–60目；优选地，玉米芯粒径为40目。

[0023] 在一种实施方式中，所述方法还将反应液进行分离纯化，所述分离纯化是将反应液通过磁分离和过滤去除固体酸催化剂和玉米芯残渣，用乙醚萃取反应混合物以去除未反
应的糠醛；再向水相中加入甲醇以沉淀大部分未反应的甘氨酸，收集沉淀的甘氨酸并用甲
醇洗涤；再将甲醇蒸发后的残渣溶解在pH 8.0磷酸盐缓冲液中，加入过量的甘氨酸氧化酶
分解剩余的甘氨酸；将酶解处理后的含羟醛产物的酶解液在阴离子交换树脂上纯化，用
0.5％醋酸洗脱，蒸发浓缩后在4℃下结晶得到L‑呋喃丝氨酸。

[0024] 在一种实施方式中，所述分离、纯化的具体步骤为：

[0025] (1)将反应液通过磁分离和过滤去除固体酸催化剂和玉米芯残渣；

[0026] (2)用乙醚萃取反应混合物以去除未反应的糠醛；

[0027] (3)向步骤(2)萃取后的水相中加入400mL甲醇，在4℃下孵育12h，收集沉淀的甘氨酸并用甲醇洗涤；

[0028] (4)将甲醇蒸发后的残渣溶解在pH 8.0磷酸盐缓冲液中，加入过量的甘氨酸氧化酶分解剩余的甘氨酸；

[0029] (5)将步骤(4)反应后的酶解液在阴离子交换树脂上纯化，用0.5％醋酸洗脱树脂；

[0030] (6)收集步骤(5)的洗脱液，蒸发浓缩后在4℃下结晶得到L‑呋喃丝氨酸。

[0031] 本发明还要求保护所述方法在制备含L‑呋喃丝氨酸的产品方面的应用。

[0032] 有益效果：本发明提供了一种生物质化学‑酶法生产L‑呋喃丝氨酸的方法，该方法省去了中间物的分离，生物相容性好，步骤简单，过程经济环保，可使L‑呋喃丝氨酸的产率
达73.6％，为β‑羟基‑α‑氨基酸的绿色可持续制造提供了参考。

附图说明

[0033] 图1为化学‑酶法制备L‑呋喃丝氨酸流程图。

[0034] 图2固体酸的扫描电子显微镜(SEM)图，(a)为Fe3O4；(b)为Fe3O4@MCM‑41；(c)为2–
Fe3O4@MCM‑41/SO4 。

[0035] 图3固体酸Fe3O4@MCM‑41/SO42–的EDAX能谱图。

[0036] 图4固体酸的振动样品磁强计(VSM)图，(a)为反应过程状态；(b)为磁分离固体酸。

[0037] 图5产物L‑呋喃丝氨酸1H NMR图。

具体实施方式

[0038] 糠醛和L‑呋喃丝氨酸利用高效液相色谱分析定量，其中分析L‑呋喃丝氨酸时需要采用OPA/NAC柱前衍生化(Gong,L.,et al.Bioresource Technology,2019,293,122065；
Molnar‑Perl,Journal of Chromatography A,2001,913,283–302.)。

[0039] 实施例1固体酸Fe3O4@MCM‑41/SO42–的制备

[0040] 磁性固体酸Fe3O4@MCM‑41/SO42–按如下方法制备：

[0041] (1)将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O溶解于搅拌式反应器中，其中，Fe3+与Fe2+的摩尔比为2.0:1.1。在氮气保护下，升温至85℃，在1000r/min高速搅拌下滴加NH3·H2O溶液至反
应液pH值为11，利用磁场将沉积的产物分离，即得到Fe3O4磁性颗粒。

[0042] (2)将粉煤灰原料与质量分数为20％盐酸以质量比1:10混合，在80℃下搅拌4h，去除铁、钙等杂质，然后过滤、洗涤、干燥，得到预处理后的粉煤灰。然后将氢氧化钠按质量比
1:2的比例与预处理后的粉煤灰均匀混合，在550℃下加热1h。将得到的碱熔粉煤灰与去离
子水按1:4比例混合，在室温下搅拌24h，过滤后得到淡黄色的硅酸钠溶液，作为制备MCM‑41
的硅源。

[0043] (3)将步骤(1)制备好的Fe3O4磁性颗粒在去离子水中搅拌分散1h。将以质量比1:20的比例溶于热水的CTAB慢慢加入到Fe3O4分散体中，继续搅拌1h，得到悬浮液。将步骤(2)制
备的硅酸钠溶液慢慢加入到悬浮液中，缓慢搅拌，使反应持续24h。再调节反应体系的pH值
调至10.5，在110℃的反应釜中水热处理24h。固体产品磁分离并用去离子水清洗，最后在60
℃烘箱中干燥24h，得到Fe3O4@MCM‑41。

[0044] (4)将步骤(3)得到的呈块状Fe3O4@MCM‑41研磨成粉末，并用浓度为3mol/L的(NH4)2SO4溶液按15mL(NH4)2SO4溶液/g Fe3O4@MCM‑41的剂量浸渍24h。磁分离和干燥后，在
2–
500℃煅烧3h得到固体酸Fe3O4@MCM‑41/SO4 。

[0045] 用电子显微镜对制备的固体酸结构进行观察，结果如图2所示，Fe3O4粒子呈准球形，表面不均匀。此外，由于粒子间的磁偶极矩，粒子之间存在轻微的聚集。在MCM‑41涂层
后，得到的材料的形状也是球形的。结果表明，Fe3O4粒子成功地被MCM‑41所包覆。进一步说
明了Fe3O4纳米粒子的形状并没有因为功能化过程而发生很大的变化。图3中EDAX结果说明
了该催化剂由O,Fe,Si,S组成，MCM‑41包裹在磁颗粒的表面，并且成功进行了硫酸化，催化
2‑ 2‑
剂表面负载了SO4 。图4的VSM磁滞曲线可以看出，Fe3O4和Fe3O4@MCM‑41/SO4 纳米粒子具有
典型的超顺磁性。另外，Fe3O4磁饱和度从80下降到46emu/g，这是由于在Fe3O4纳米颗粒上包
裹了非磁性的MCM‑41缘故。该磁性固体酸催化剂可以通过外加磁场与残渣进行固‑固分离，
操作方便快捷，以便于固体酸的循环再利用。图2–4的结果综合说明了该固体酸制备成功且
具有良好的催化和分离性能。

[0046] 实施例2固体酸Fe3O4@MCM‑41/SO42–催化玉米芯制备糠醛

[0047] 在200mL高压反应釜内加入100mL去离子水，10g玉米芯粉，终浓度22g/L实施例1制2–
备的磁性固体酸Fe3O4@MCM‑41/SO4 ，通过电加热套将高压反应釜迅速加热到180℃并搅拌
反应40min。反应结束后，立即将反应器浸泡在冰水浴中冷却到室温。

[0048] 经检测，反应后的糠醛的浓度为72mM。

[0049] 实施例3生物质糠醛一锅法合成L‑呋喃丝氨酸

[0050] 重组L‑苏氨酸醛缩酶全细胞按如下方法制备：将含L‑苏氨酸醛缩酶基因的工程菌(工程菌构建方法参考如下文献：Gong,L.,et al.Applied  Biochemistry and 
–1
Biotechnology,2020.DOI:org/10.1007/s12010‑020‑03447‑y)接种至含50μg·mL 卡那霉
–1
素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。再以1％(体积浓度)接种量接种到含50μg·mL 卡那
霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养至菌体浓度OD600为0.6–1.0，加入终浓度为0.2mM
的IPTG，25℃诱导培养10h后，4℃、8000rpm离心10min收集湿菌体，即为重组L‑苏氨酸醛缩
酶全细胞，经酶活测定，全细胞酶活为4000–80000U/g。

[0051] 在200mL高压反应釜内加入100mL去离子水，10g玉米芯粉，2wt％磁性固体酸Fe3O4@2–
MCM‑41/SO4 ，并在180℃下加热搅拌40min后生成72mM糠醛。然后，直接调节体系的pH值为
–1
8.0，加入720mM甘氨酸，50μM PLP和20g·L 重组全细胞PpLTA，在30℃，200rpm条件下进行
生物转化合成L‑呋喃丝氨酸。反应6h后，72mM玉米芯糠醛可转化为53mM L‑呋喃丝氨酸，产
率为73.6％。

[0052] 实施例4生物质糠醛一锅法合成L‑呋喃丝氨酸

[0053] 按照实施例3的方法合成L‑呋喃丝氨酸，收集反应后的反应液，按照下述方法纯化：通过磁分离和过滤去除固体酸催化剂和玉米芯残渣。然后用乙醚萃取反应混合物以去
除未反应的糠醛。在水相中加入甲醇(400mL)，在4℃下孵育12h，以沉淀大部分未反应的甘
氨酸，收集沉淀的甘氨酸并用甲醇洗涤。将甲醇蒸发后的残渣溶解在pH 8.0磷酸盐缓冲液
中，加入过量的枯草芽孢杆菌(Bacillius subtilis)168来源的甘氨酸氧化酶(氨基酸序列
如SEQ ID NO.2所示，公开于论文Beaudoin,S.F.,et al.Enzyme and Microbial 
Technology,2018,119:1–9中)分解剩余的甘氨酸。在阴离子交换树脂上纯化羟醛产物，并
用0.5％醋酸洗脱。蒸发浓缩后在4℃下结晶得到L‑呋喃丝氨酸。

[0054] 经检测(如图5)，纯化制备得到固体收率为37.8％，ee>99％，de(threo)＝20％，1H 1
NMR表征结果为：H NMR(400MHz,D2O)δ7.56(d,J＝1.8Hz,1H),6.53–6.46(m,2H),5.29(d,J
＝4.3Hz,1H),4.06(d,J＝4.3Hz,1H)。

[0055] 对比例1传统化学法制备糠醛

[0056] 具体实施方式同实施例3，区别在于，将固体酸Fe3O4@MCM‑41/SO42–替换为现有技术中常使用的无机酸H2SO4，相同pH条件下，糠醛的产量为32mM，但反应后需要对H2SO4废液进
行处理。

[0057] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范
围应该以权利要求书所界定的为准。