用于检测蓝舌病的蛋白质及其编码基因和可溶制备方法转让专利
申请号 : CN202011162626.4
文献号 : CN112390862B
文献日 : 2022-03-22
发明人 : 韩雪清 , 孔玉方 , 王慧煜 , 欧先金
申请人 : 中国检验检疫科学研究院
摘要 :
本发明公开用于检测蓝舌病的蛋白质及其编码基因和可溶制备方法。本发明首先公开了用于检测蓝舌病的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.1第2‑219位所示。本发明进一步公开了上述蛋白质的编码基因及其可溶性制备方法。本发明从VP7蛋白质三维空间结构特点出发，对VP7蛋白质的氨基酸序列进行裁剪重排得到新的用于检测蓝舌病的VP7‑N蛋白质，通过将VP7‑N蛋白质的编码基因导入到原核表达系统实现了VP7‑N蛋白质在原核表达系统中的高效可溶性表达，具有表达产量高、可溶性好的特点，另外，并未因原核表达降低免疫原性，具有良好的免疫反应特性，为蓝舌病检测提供了优质的蛋白。
权利要求 :
1.一种用于检测蓝舌病的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为A1)或A2)所示：A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1第2‑219位所示的蛋白质；
A2)在SEQ ID No.1第2‑219位所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白。
2.一种用于检测蓝舌病的蛋白质的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.包含如权利要求2所述的编码基因的重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为将权利要求2所述的编码基因连接到pet‑28a的Nco I和Xho I酶切位点之间，且保持pet‑28a的其他序列不变得到的重组载体VP7‑N‑28a。
5.含有权利要求3或4所述的重组载体的重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
6.权利要求2所述的编码基因，或权利要求3或4所述的重组载体，或权利要求5所述的重组菌在制备用于检测蓝舌病的蛋白质中的应用。
7.一种用于检测蓝舌病的蛋白质的可溶制备方法，其特征在于，所述可溶制备方法包括如下步骤：
合成用于检测蓝舌病的蛋白质的编码基因：所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
构建包含所述用于检测蓝舌病的蛋白质的编码基因的重组载体：所述重组载体为重组载体VP7‑N‑28a，该重组载体VP7‑N‑28a是将所述SEQ ID NO.2所示的用于检测蓝舌病的蛋白质的编码基因连接到pet‑28a的Nco I和Xho I酶切位点之间，且保持pet‑28a的其他序列不变得到的；
构建包含所述用于检测蓝舌病的蛋白质的编码基因的重组载体的得到重组菌：所述重组菌为重组菌BL21(De3)/VP7‑N‑28a，该重组菌BL21(De3)/VP7‑N‑28a是将重组载体VP7‑N‑
28a转化到大肠杆菌BL21(De3)感受态细胞得到的；
诱导表达：将重组菌BL21(De3)/VP7‑N‑28a接种到LB液体培养基中，加入终浓度为
0.5mM的IPTG进行诱导表达，继续培养，离心收集菌体，即得用于检测蓝舌病的蛋白质。
8.根据权利要求7所述的可溶制备方法，其特征在于，所述方法还包括进一步亲和纯化的步骤。
说明书 :
用于检测蓝舌病的蛋白质及其编码基因和可溶制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种用于检测蓝舌病的蛋白质及其编码基因和可溶制备方法。
背景技术
[0002] 蓝舌病是由动物感染蓝舌病毒(BTV)导致的非接触烈性传染病，主要感染羊和牛等反刍动物，病死率达30％，其中绵羊死亡率高达80％，给畜牧行业带来巨大的经济损失。
蓝舌病毒属于RNA病毒，编码7种结构蛋白质(简称VP1‑VP7)和5种非结构蛋白质(简称NS1‑
NS5)，其中结构蛋白质VP7含有引起动物宿主细胞免疫反应的抗原决定簇，是检测动物是否
感染蓝舌病毒的理想抗原蛋白质。重组表达并纯化得到VP7，然后固定在试纸等固体载体上
面，与待检测的动物血液样品，通过抗原抗体免疫反应产生检测信号，这是常有蓝舌病检测
方法。这首先需要对VP7进行重组表达，VP7在原核表达系统中通常呈现为不可溶的包涵体
形态，不利于后续的免疫反应(蓝舌病病毒VP7蛋白、施马伦贝格病毒N蛋白的原核表达及间
接ELISA检测方法的建立(硕士论文).王贞钧,2015)。
蓝舌病毒属于RNA病毒，编码7种结构蛋白质(简称VP1‑VP7)和5种非结构蛋白质(简称NS1‑
NS5)，其中结构蛋白质VP7含有引起动物宿主细胞免疫反应的抗原决定簇，是检测动物是否
感染蓝舌病毒的理想抗原蛋白质。重组表达并纯化得到VP7，然后固定在试纸等固体载体上
面，与待检测的动物血液样品，通过抗原抗体免疫反应产生检测信号，这是常有蓝舌病检测
方法。这首先需要对VP7进行重组表达，VP7在原核表达系统中通常呈现为不可溶的包涵体
形态，不利于后续的免疫反应(蓝舌病病毒VP7蛋白、施马伦贝格病毒N蛋白的原核表达及间
接ELISA检测方法的建立(硕士论文).王贞钧,2015)。
[0003] 蓝舌病毒的主要免疫抗原蛋白质VP7在蛋白质原核表达系统中通常是包涵体表达，有人尝试利用融合表达的方式增加目标蛋白质VP7的可溶性表达，也就是采用“融合蛋
白质‑目标蛋白质”串联一起重组表达，融合蛋白质的促溶效果会改进目标蛋白质VP7的可
溶性表达效果，常用融合蛋白质是GST和MBP等(蓝舌病病毒VP7蛋白的原核表达及单克隆抗
体的制备(硕士论文)，李文超，2007；蓝舌病病毒VP7蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备
(硕士论文)，宋红酶，2010)。
白质‑目标蛋白质”串联一起重组表达，融合蛋白质的促溶效果会改进目标蛋白质VP7的可
溶性表达效果，常用融合蛋白质是GST和MBP等(蓝舌病病毒VP7蛋白的原核表达及单克隆抗
体的制备(硕士论文)，李文超，2007；蓝舌病病毒VP7蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备
(硕士论文)，宋红酶，2010)。
[0004] 尽管融合蛋白质表达载体能够改善目标融合蛋白质的可溶性，但是这种可溶性状态通常也是部分正确折叠，其余大部分都是不均一的高聚状态，影响免疫反应信号；同时融
合蛋白质的存在也带来负面的免疫反应干扰，融合表达仅仅是部分可溶性表达，需要在蛋
白质纯化过程中用特定的蛋白酶进行切割除去辅助的融合蛋白质，增加了目标蛋白质的生
产成本。
合蛋白质的存在也带来负面的免疫反应干扰，融合表达仅仅是部分可溶性表达，需要在蛋
白质纯化过程中用特定的蛋白酶进行切割除去辅助的融合蛋白质，增加了目标蛋白质的生
产成本。
[0005] 因此，需要提供一种能在原核表达系统很好地可溶性表达，同时具有免疫反应特性的用于检测蓝舌病的蛋白质。
发明内容
[0006] 本发明的第一个目的在于提供新的用于检测蓝舌病的蛋白质(简称为VP7‑N蛋白质)，其能在原核表达系统很好地可溶性表达，同时保持其免疫反应特性。
[0007] 本发明的第二个目的在于提供上述蛋白质的编码基因及包含所述编码基因的重组载体和重组菌及其在制备用于检测蓝舌病的蛋白质中的应用。
[0008] 本发明的第三个目的在于提供用于检测蓝舌病的蛋白质的可溶制备方法，该方法能高效可溶性表达蛋白质，且得到的蛋白质纯度较高。
[0009] 为达到第一个目，本发明提供了一种用于检测蓝舌病的蛋白质，简称为VP7‑N蛋白质，所述蛋白质为A1)或A2)所示：
[0010] A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1第2‑219位所示的蛋白质；
[0011] A2)在SEQ ID No.1第2‑219位所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白。
[0012] 上述蛋白质中，蛋白标签(protein‑tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪或纯化。所述蛋白
标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
[0013] 在本发明具体的实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1第2‑227位所示。
[0014] 本发明进一步提供了用于检测蓝舌病的蛋白质的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，该编码基因能通过原核表达系统表达得到可溶性的蛋白质(即VP7‑N蛋白
质)。
质)。
[0015] 为达到第二个目的，本发明提供了包含上述用于检测蓝舌病的蛋白质的编码基因的重组载体。
[0016] 进一步，所述重组载体为将上述用于检测蓝舌病的蛋白质的编码基因连接到pet‑28a的Nco I和Xho I酶切位点之间，且保持pet‑28a的其他序列不变得到的重组载体VP7‑N‑
28a。
28a。
[0017] 本发明进一步提供了含有上述重组载体VP7‑N‑28a的重组菌，所述重组菌的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
[0018] 本发明进一步还公开了上述编码基因、重组载体或重组菌在制备用于检测蓝舌病的蛋白质的应用。
[0019] 为达到第三个目的，本发明提供了用于检测蓝舌病的蛋白质的可溶制备方法，所述可溶制备方法包括如下步骤：
[0020] 合成用于检测蓝舌病的蛋白质的编码基因：所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；
[0021] 构建包含用于检测蓝舌病的蛋白质的编码基因的重组载体：所述重组载体为VP7‑N‑28a，该重组载体VP7‑N‑28a是将所述SEQ ID NO.2所示的用于检测蓝舌病的蛋白质的编
码基因连接到pet‑28a的Nco I和Xho I酶切位点之间，且保持pet‑28a的其他序列不变得到
的；
码基因连接到pet‑28a的Nco I和Xho I酶切位点之间，且保持pet‑28a的其他序列不变得到
的；
[0022] 构建包含用于检测蓝舌病的蛋白质的编码基因的重组载体得到重组菌：所述重组菌为BL21(De3)/VP7‑N‑28a，该重组菌BL21(De3)/VP7‑N‑28a是将重组载体VP7‑N‑28a转化
到大肠杆菌BL21(De3)感受态细胞得到；
到大肠杆菌BL21(De3)感受态细胞得到；
[0023] 诱导表达：将重组菌BL21(De3)/VP7‑N‑28a接种到LB液体培养基中，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，继续培养，离心收集菌体，即得到用于检测蓝舌病的蛋白质。
[0024] 进一步，所述可溶制备方法还包括亲和纯化的步骤。
[0025] 在本发明具体的实施方式中，所述亲和纯化为在所述菌体中加入Tris缓冲液，超声波破碎，离心后得上清；将上清流经镍介质，进行洗杂和洗脱后得到纯化的用于检测蓝舌
病的蛋白质。
病的蛋白质。
[0026] 本发明的有益效果如下：
[0027] 本发明从VP7蛋白质三维空间结构特点出发，对VP7蛋白质的氨基酸序列进行裁剪重排得到新的用于检测蓝舌病的蛋白质(简称为VP7‑N蛋白质)，通过将VP7‑N蛋白质的编码
基因导入到原核表达系统实现了VP7‑N蛋白质在原核表达系统中的高效可溶性表达，具有
表达产量高、可溶性好的特点，另外，并未因原核表达降低免疫原性，具有良好的免疫反应
特性，为蓝舌病检测提供了优质的蛋白。
基因导入到原核表达系统实现了VP7‑N蛋白质在原核表达系统中的高效可溶性表达，具有
表达产量高、可溶性好的特点，另外，并未因原核表达降低免疫原性，具有良好的免疫反应
特性，为蓝舌病检测提供了优质的蛋白。
附图说明
[0028] 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
[0029] 图1示出VP7蛋白质的三维晶体结构；其中，圆圈中的结构域定义为N结构域；方框中的结构域定义为C结构域。
[0030] 图2示出SDA‑PAGE分析VP7‑N蛋白质诱导表达的电泳图；其中，1为诱导前的菌体，2为蛋白质Marker，3和4均为诱导后的菌体；箭头所指是目标蛋白质VP7‑N蛋白质。
[0031] 图3示出SDA‑PAGE分析VP7‑N蛋白质纯化的电泳图；其中，1为上清，2为沉淀，3为蛋白质Marker，4为咪唑20mM洗杂得到的样品，5为咪唑500mM洗脱得到的样品，箭头指向是目
标蛋白质VP7‑N蛋白质。
标蛋白质VP7‑N蛋白质。
[0032] 图4示出蓝舌病抗体检测试纸条的特异性检测结果；其中，1‑6分别为结核病、布鲁氏杆菌病、病毒性腹泻、口蹄疫、巴氏杆菌病、白血病阳性血清；7‑14均为蓝舌病阳性血清。
具体实施方式
[0033] 为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体
描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
[0034] 不同病毒来源的VP7蛋白质的氨基酸序列会略有不同，本发明以SEQ ID NO.3所示的VP7蛋白质氨基酸序列进行试验设计，该序列在www.ncbi.nlm.nih.gov专业网站数据库
的编号是AAF97690.1，含有349个氨基酸残基。VP7的三维空间结构已经被解析，对应PDB数
据库(protein data base)的编号是2BTV和1BVP。在三维空间结构中，3个VP7蛋白质以头碰
头、脚碰脚方式形成对称3重轴的3聚体。单体VP7蛋白质由2个独立的结构域组成，结构如图
1所示，图1圆圈中的结构域定义为N‑结构域，方框中的结构域定义为C‑结构域。这2个结构
域在一级氨基酸序列上是不连续分布的。N‑结构域为SEQ ID NO.3第1‑120位和第254‑349
位所示，共计216个氨基酸残基组成；C‑结构域为SEQ ID NO.3第121‑253位所示，共计133个
氨基酸残基组成。在三维空间相近的氨基酸对应其一级序列上反而距离很远的蛋白质在病
毒上比较常见，这种特点的蛋白质但通常会增加其重组表达的难度。
的编号是AAF97690.1，含有349个氨基酸残基。VP7的三维空间结构已经被解析，对应PDB数
据库(protein data base)的编号是2BTV和1BVP。在三维空间结构中，3个VP7蛋白质以头碰
头、脚碰脚方式形成对称3重轴的3聚体。单体VP7蛋白质由2个独立的结构域组成，结构如图
1所示，图1圆圈中的结构域定义为N‑结构域，方框中的结构域定义为C‑结构域。这2个结构
域在一级氨基酸序列上是不连续分布的。N‑结构域为SEQ ID NO.3第1‑120位和第254‑349
位所示，共计216个氨基酸残基组成；C‑结构域为SEQ ID NO.3第121‑253位所示，共计133个
氨基酸残基组成。在三维空间相近的氨基酸对应其一级序列上反而距离很远的蛋白质在病
毒上比较常见，这种特点的蛋白质但通常会增加其重组表达的难度。
[0035] 本发明根据其三维空间结构特点对氨基酸序列进行拼接，然后独立重组表达N‑结构域，大大提高VP7蛋白质在原核系统的可溶性表达，且不会影响其免疫抗原反应。具体的
本发明将SEQ ID NO.3第1‑120位(计120个氨基酸残基)和第254‑349位(计96个氨基酸残
基)所示的片段由几个氨基酸组成的连接片段(Linker)连接形成一个独立的新蛋白质(SEQ
ID NO.1第2‑219位所示，简称VP7‑N蛋白质)，然后合成VP7‑N蛋白质的编码基因在原核系统
进行单独的重组表达。
本发明将SEQ ID NO.3第1‑120位(计120个氨基酸残基)和第254‑349位(计96个氨基酸残
基)所示的片段由几个氨基酸组成的连接片段(Linker)连接形成一个独立的新蛋白质(SEQ
ID NO.1第2‑219位所示，简称VP7‑N蛋白质)，然后合成VP7‑N蛋白质的编码基因在原核系统
进行单独的重组表达。
[0036] 下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。
[0037] 实施例1VP7‑N蛋白质的可溶制备方法
[0038] 一、VP7‑N蛋白质基因序列的获得
[0039] 将编码SEQ ID NO.3第1‑120位所示氨基酸序列的DNA片段(SEQ ID NO.4第1‑360位所示)和编码SEQ ID NO.3第254‑349位所示氨基酸序列的DNA片段(SEQ ID NO.4第760‑
1047位所示)中间通过6bp的核苷酸“GGAGGT”(对应氨基酸序列是“甘氨酸‑甘氨酸”)连接，
得到SEQ ID NO.2所示的VP7‑N蛋白质基因序列，该序列的全长654bp。
1047位所示)中间通过6bp的核苷酸“GGAGGT”(对应氨基酸序列是“甘氨酸‑甘氨酸”)连接，
得到SEQ ID NO.2所示的VP7‑N蛋白质基因序列，该序列的全长654bp。
[0040] 通过直接合成的方式得到SEQ ID NO.2所示的VP7‑N蛋白质基因序列。
[0041] 二、重组载体的构建
[0042] 将SEQ ID NO.2所示的DNA片段连接到pet‑28a(Novagen公司，货号为69864‑3CN)的Nco I和Xho I酶切位点之间，且保持pet‑28a的其他序列不变得到的重组载体VP7‑N‑
28a。
28a。
[0043] 三、重组菌的获得
[0044] 将重组载体VP7‑N‑28a转入大肠杆菌BL21(De3)感受态细胞，筛选得到重组菌BL21(De3)/VP7‑N‑28a。
[0045] 具体步骤包括：
[0046] 1、大肠杆菌BL21(De3)感受态细胞的制备
[0047] 1)接种一个大肠杆菌BL21(De3)单菌落于50ml LB培养液中，于37℃摇床培养过夜(250r/min)，得过夜培养液。
[0048] 2)往一个2L的烧瓶中加入400ml LB培养液，再加入4ml过夜培养液，于37℃；摇床，培养至OD600为0.4‑0.6，得培养液。
[0049] 3)将培养液分装到8个50ml预冷无菌的聚丙烯管中，于冰上放置5～10min，然后于4℃，1 600g离心7min得细胞沉淀。
[0050] 4)细胞沉淀用10ml冰冷的CaCl2溶液重悬，于4℃，以1100g离心5min得细胞沉淀。
[0051] 5)细胞沉淀用10ml冰冷的CaCl2溶液重悬，冰上放置30min，于4℃，1 100g离心5min去上清，用2ml冰冷的CaCl2溶液重悬各管细胞，然后按每管250ul的量分装于预冷的无
菌聚丙烯管中，立即冻存于‑70℃，得到大肠杆菌BL21(De3)感受态细胞。
菌聚丙烯管中，立即冻存于‑70℃，得到大肠杆菌BL21(De3)感受态细胞。
[0052] 2、重组载体VP7‑N‑28a转入大肠杆菌BL21(De3)感受态细胞
[0053] 1)将10ng重组载体VP7‑N‑28a加入到一个15ml无菌的圆底试管中，并放置冰上。
[0054] 2)将盛有大肠杆菌BL21(De3)感受态细胞的管子握在手上使菌液迅速熔化。
[0055] 3)立即将100ul大肠杆菌BL21(De3)感受态细胞加入到管中，轻轻旋动，并放置冰上10min。
[0056] 4)将管放入42℃水浴2min进行热休克，然后加入1ml LB培养液于每一支试管中，于37℃置滚筒式摇床口培养1h。
[0057] 5)将几个稀释度菌液涂布于含合适抗生素的平板上，于37℃培养12～16h。
[0058] 6)第二天挑起阳性克隆进行测序验证，测序正确的克隆菌即为重组菌BL21(De3)/VP7‑N‑28a。
[0059] 四、诱导表达
[0060] 将重组菌BL21(De3)/VP7‑N‑28a接种到LB液体培养基中过夜培养获得种子液，种子液按照1‑2％体积比的接种量接种到LB液体培养基，37℃，200rpm条件下培养2‑4小时，菌
液的光密度(600nm)在0.6‑1之间时降温到16℃，添加终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，
继续过夜培养，离心收集菌体，得到诱导后的菌体。同时收集诱导前的菌体作为对照，利用
蛋白质变性电泳胶(SDS‑PAGE)进行检测。
液的光密度(600nm)在0.6‑1之间时降温到16℃，添加终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，
继续过夜培养，离心收集菌体，得到诱导后的菌体。同时收集诱导前的菌体作为对照，利用
蛋白质变性电泳胶(SDS‑PAGE)进行检测。
[0061] VP7‑N蛋白质在诱导表达时，引入了载体序列，因此在VP7‑N蛋白质的末端带有His6标签(SEQ ID NO.1所示，由227个氨基酸残基组成)，方便后续VP7‑N蛋白质的快速亲和
纯化。
纯化。
[0062] 蛋白质变性电泳胶检测结果如图2所示，诱导表达得到的蛋白质的分子量约为25kda，与理论分子量一致，因此，VP7‑N蛋白质得到很好的重组表达。
[0063] 五、VP7‑N蛋白质的亲和纯化
[0064] 步骤四诱导后的菌体用Tris缓冲液(20mM tris，100mM NacL，pH＝8)悬浮得到菌体重悬液(菌体重悬液中菌体的质量浓度为10‑20％)，菌体重悬液在冰浴的条件下进行超
声波破碎，得到破碎后的菌体液，其中，超声波破碎条件：200w功率，4秒工作，4秒休息，总时
间20分钟。把破碎后的菌体液进行高速离心，16000g离心力，30分钟，得到上清和沉淀；沉淀
用与上清体积相同的Tris缓冲液重悬，作为沉淀样品，与上清互为对照，用来验证蛋白质是
否可溶性表达。
声波破碎，得到破碎后的菌体液，其中，超声波破碎条件：200w功率，4秒工作，4秒休息，总时
间20分钟。把破碎后的菌体液进行高速离心，16000g离心力，30分钟，得到上清和沉淀；沉淀
用与上清体积相同的Tris缓冲液重悬，作为沉淀样品，与上清互为对照，用来验证蛋白质是
否可溶性表达。
[0065] 上清通过重力作用流经镍介质(3‑5mL)，含有His6标签的VP7‑N蛋白质与镍介质特异性结合，然后用50mL的tris缓冲液(含有浓度为20M的咪唑)洗杂(即为咪唑20mM洗杂得到
的样品)，再用50mL的tris缓冲液(含有浓度为500M的咪唑)洗脱(即为咪唑500mM洗脱得到
的样品)，将得到的样品进行蛋白质变性电泳胶(SDS‑PAGE)检测，结果如图3所示，在上清中
得到了纯度高的蛋白质，即VP7‑N蛋白质以可溶性形式存在于上清中。
的样品)，再用50mL的tris缓冲液(含有浓度为500M的咪唑)洗脱(即为咪唑500mM洗脱得到
的样品)，将得到的样品进行蛋白质变性电泳胶(SDS‑PAGE)检测，结果如图3所示，在上清中
得到了纯度高的蛋白质，即VP7‑N蛋白质以可溶性形式存在于上清中。
[0066] 实施例2蛋白质VP7‑N的免疫反应
[0067] 一、利用实施例1制备的蛋白质VP7‑N构建蓝舌病抗体检测试纸条
[0068] 1、胶体金标记过程
[0069] 取10mL 20nm胶体金溶液至15mL离心管内平衡至室温，用0.2mol/L K2CO3调pH8.2，加入100μg葡萄球菌蛋白A(SPA)，用搅拌器搅拌30min混匀，接着加入100μL的2％酪蛋白封
闭30min，8000rmp/min 4℃离心15min，弃上清保留浓缩的胶体金颗粒，然后用1mL胶体金重
悬液重悬胶体金颗粒(重悬液20mM TB pH8.5，1％酪蛋白，2％蔗糖)。采用BIO‑DOT三维喷金
滑膜仪以9μL/cm的量喷于金标垫上，然后将金标垫置于37℃恒温箱4h烘干备用。
闭30min，8000rmp/min 4℃离心15min，弃上清保留浓缩的胶体金颗粒，然后用1mL胶体金重
悬液重悬胶体金颗粒(重悬液20mM TB pH8.5，1％酪蛋白，2％蔗糖)。采用BIO‑DOT三维喷金
滑膜仪以9μL/cm的量喷于金标垫上，然后将金标垫置于37℃恒温箱4h烘干备用。
[0070] 2、样品垫预处理
[0071] 将样品垫浸泡在含20mM TB pH8.5，0.5％酪蛋白，5％Tween‑20，0.3％PVP‑40缓冲液中，浸泡30min后放置37℃恒温箱4h烘干备用。
[0072] 3、试纸条组装
[0073] 使用BIO‑DOT三维喷金滑膜仪将2.5mg/mL的蛋白质VP7‑N和1mg/mL的抗SPA兔多克隆抗体喷涂在NC膜上，分别作为检测线(T)和质控线(C)，放置37℃恒温箱1h烘干。将样品
垫、NC膜、金标垫、吸水纸粘于PVC底板上，然后用BIO‑DOT切条机将组装好的大板切割成4mm
宽度的蓝舌病抗体检测试纸条，用于后续样品的检测。
垫、NC膜、金标垫、吸水纸粘于PVC底板上，然后用BIO‑DOT切条机将组装好的大板切割成4mm
宽度的蓝舌病抗体检测试纸条，用于后续样品的检测。
[0074] 二、蓝舌病抗体检测试纸条的特异性验证
[0075] 采用中国检科院动物检验与检疫研究所保存的结核病、布鲁氏杆菌病、病毒性腹泻、口蹄疫、巴氏杆菌病、白血病和蓝舌病的阳性血清验证该蓝舌病抗体检测试纸条检测的
特异性。采用样品稀释液(20mM TB pH8.5，1％Tween‑20，0.3％酪蛋白)按照1:4对结核病、
布鲁氏杆菌病、病毒性腹泻、口蹄疫、巴氏杆菌病、白血病和蓝舌病的阳性血清进行稀释，即
20μL血清样品加60μL样品稀释液，然后分别滴加到不同的蓝舌病抗体检测试纸条的样品垫
上，5‑10min后观察结果。
特异性。采用样品稀释液(20mM TB pH8.5，1％Tween‑20，0.3％酪蛋白)按照1:4对结核病、
布鲁氏杆菌病、病毒性腹泻、口蹄疫、巴氏杆菌病、白血病和蓝舌病的阳性血清进行稀释，即
20μL血清样品加60μL样品稀释液，然后分别滴加到不同的蓝舌病抗体检测试纸条的样品垫
上，5‑10min后观察结果。
[0076] 结果如图4所示，结果显示该蓝舌病抗体检测试纸条与结核病、布鲁氏杆菌病、病毒性腹泻、口蹄疫、巴氏杆菌病、白血病阳性血清无交叉反应，且能检测出蓝舌病，表明该蓝
舌病抗体检测试纸条具有较好的特异性。
舌病抗体检测试纸条具有较好的特异性。
[0077] 显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可
以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发
明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发
明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。