灵芝多糖还原氧化石墨烯制备纳米酶的方法、制得的纳米酶及其应用

摘要

本发明公开一种灵芝多糖还原氧化石墨烯制备纳米酶的方法，涉及材料制备技术领域，本发明包括以下步骤：将灵芝多糖分散于氧化石墨烯水溶液中，再加入NH3·H2O，在70‑95℃下搅拌，即获得纳米酶。本发明还提供采用上述制备方法制得的纳米膜及应用。本发明的有益效果在于：本发明以灵芝为还原剂，将氧化石墨烯还原成石墨烯，该还原剂温和无污染，且在有效还原氧化石墨烯的同时，减少石墨烯的堆叠程度。还原后的复合材料可以作为类过氧化物纳米酶，能高效氧化过氧化氢，并且比一般天然过氧化物酶有很高效的催化性能，是可能成为一种替代天然过氧化物酶非常实用的纳米酶。

权利要求

1.一种纳米酶作为催化剂的应用，其特征在于：纳米酶作为类过氧化物纳米酶，能氧化过氧化氢；所述纳米酶是通过灵芝多糖还原氧化石墨烯制备得到的；

所述纳米酶制备方法包括以下步骤：（1）将灵芝粉粉碎后,置于80℃水浴3h，然后将灵芝水冷冻干燥,即获得灵芝多糖；（2）将灵芝多糖分散于氧化石墨烯水溶液中，再加入NH3·H2O，在80℃下搅拌，即获得纳米酶；所述灵芝多糖在氧化石墨烯水溶液中的浓度为0.4mg/mL；所述氧化石墨烯水溶液的浓度为0.1mg/mL；所述NH3·H2O与氧化石墨烯水溶液的体积比为0.01：25。

2.根据权利要求1所述纳米酶作为催化剂的应用，其特征在于：所述氧化石墨烯的制备方法包括以下步骤：将石墨粉倒入硫酸中，在5℃以下冰水浴中搅拌，同时加入KMnO4搅拌，将温度升至40℃反应1h，再将温度升高至85℃，滴加水，保温30min，再加入H2O2，直至无明显气泡产生，反应5min，再用5%HCl进行洗涤，最后用去离子水洗涤后，将固体材料分散在水中,超声2h。

3.根据权利要求2所述纳米酶作为催化剂的应用，其特征在于：所述石墨粉的质量与硫酸的体积之比为1.5g：50mL。

4.根据权利要求2所述纳米酶作为催化剂的应用，其特征在于：所述石墨粉与KMnO4的质量比为1.5：6。

说明书

灵芝多糖还原氧化石墨烯制备纳米酶的方法、制得的纳米酶

及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及材料制备技术领域，具体涉及一种灵芝多糖还原氧化石墨烯制备纳米酶的方法、制得的纳米酶及其应用。

背景技术

[0002] 石墨烯因其比表面积大，吸附能力强，导电性高等优点，广泛用于物理、化学和生物等领域。目前，制备高质量的石墨烯方法很多，有化学气相沉积法、化学还原法和外延生长法等。其中，利用化学还原法还原氧化石墨烯是最常见的获得石墨烯的一种方法。

[0003] 但是当前，化学还原法所使用的还原剂大多是水合肼和NaBH4等有毒物质，会污染环境且所需还原反应温度较高。因此，开发一种绿色，简单的还原剂是非常重要的。如公开号为CN103318877A的专利公开一种水溶性壳聚糖衍生物制备石墨烯的方法，以水溶性壳聚糖衍生物为还原剂和稳定剂，在90～100℃条件下，与氧化石墨烯水溶液进行还原反应，得到稳定分散的石墨烯。灵芝多糖，作为一种灵芝提取物，在许多方面都具有药理活性，如提高机体免疫力，清除自由基，抗辐射等作用。目前，还没有人用灵芝多糖作为还原剂去还原和修饰氧化石墨烯。

[0004] 天然酶作为一种大分子生物催化剂，可以高效的催化生物过程中的各类化学反应，但价格昂贵且反应条件严格限制了其使用范围。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种采用灵芝多糖还原和改性石墨烯制备纳米酶的方法。

[0006] 本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：

[0007] 一种灵芝多糖还原氧化石墨烯制备纳米酶的方法，包括以下步骤：将灵芝多糖分散于氧化石墨烯水溶液中，再加入NH3·H2O，在70‑95℃下搅拌，即获得纳米酶。

[0008] 有益效果：本发明以灵芝为还原剂，将氧化石墨烯还原成石墨烯，该还原剂温和无污染，且在有效还原氧化石墨烯的同时，减少石墨烯的堆叠程度。

[0009] 还原后的复合材料可以作为类过氧化物纳米酶，能高效氧化过氧化氢，并且比一般天然过氧化物酶(如:辣根过氧化物酶HRP)有很高效的催化性能，是可能成为一种替代天然过氧化物酶非常实用的纳米酶。

[0010] 在本发明的温度条件下反应，可以使反应更加充分快速的进行，同时不会对反应物造成影响。

[0011] 优选地，所述灵芝多糖在氧化石墨烯水溶液中的浓度为0.4mg/mL。

[0012] 优选地，所述氧化石墨烯水溶液的浓度为0.1mg/mL。

[0013] 优选地，所述NH3·H2O与氧化石墨烯水溶液的体积比为0.01:25。

[0014] 优选地，所述灵芝多糖还原氧化石墨烯制备纳米酶的方法具体包括以下步骤：取20mg灵芝多糖分散于50ml、浓度为0.1mg/ml氧化石墨烯水溶液中，再加入20ul NH3·H2O，在
60‑80℃下搅拌，然后用去离子水清洗后，即获得纳米酶。

[0015] 有益效果：还原剂灵芝多糖的用量是过量的，低温条件下的反应进展缓慢。氨水的用量要根据反应的总体积决定，是为了使反应保持在一个弱碱性条件下，使反应更容易进行。

[0016] 优选地，所述氧化石墨烯的制备方法包括以下步骤：将石墨粉倒入硫酸中，在0‑5℃以下冰水浴中搅拌，同时加入KMnO4搅拌，将温度升至35‑40℃反应1h，再将温度升高至80‑95℃，滴加水，保温30min，再加入H2O2，直至无明显气泡产生，反应5min，再用5％HCl进行洗涤，最后用去离子水洗涤后，将固体材料分散在水中，超声2h。

[0017] 有益效果：采用改进的Hummers方法制备过程耗时较短，所用的试剂量较少。其中低温0‑5℃反应防止温度高时硫酸的爆沸，80‑95℃高温反应为了使插层的硫酸根水解得到GO。

[0018] 优选地，所述石墨粉的质量与硫酸的体积之比为1.5g:50mL。

[0019] 优选地，所述石墨粉与KMnO4的质量比为1.5:6。

[0020] 优选地，所述氧化石墨烯的制备方法具体包括以下步骤：将1.5g石墨粉加入50ml硫酸中，在5℃以下的冰水浴中进行搅拌，同时加入6g KMnO4搅拌1h，将温度升至40℃反应1h，再调温度到85℃后，逐滴滴加50ml H2O，保温30min；最后再加4‑6ml H2O2，直至无明显气泡产生，反应5min；再用5％HCl进行洗涤，接着用去离子水不断洗涤，最后将固体材料分散在水中，超声处理2h。

[0021] 优选地，所述灵芝多糖的制备方法包括以下步骤：将灵芝粉粉碎后，置于80℃水浴3h，然后将灵芝水冷冻干燥，即获得灵芝多糖。

[0022] 本发明还提供由上述制备方法制得的纳米酶。

[0023] 有益效果：本发明制得的纳米酶可以作为类过氧化物纳米酶，能高效氧化过氧化氢，并且比一般天然过氧化物酶(如:辣根过氧化物酶HRP)有很高效的催化性能，是可能成为一种替代天然过氧化物酶非常实用的纳米酶。

[0024] 本发明还提供由上述制备方法制得的纳米酶作为催化剂的应用。

[0025] 本发明的优点在于：本发明以灵芝为还原剂，该将氧化石墨烯还原成石墨烯，该还原剂无毒、温和环保；得到的石墨烯含氧官能团很低，石墨化程度高，灵芝多糖连接在石墨烯的表面，促进石墨烯均匀分散的同时，又可以对其进行有效还原。在有效还原氧化石墨烯的同时，减少石墨烯的堆叠程度。在很大程度上改善了灵芝多糖/还原性氧化石墨烯复合材料的性能。

[0026] 还原后的复合材料可以作为类过氧化物纳米酶，能高效氧化过氧化氢，并且比一般天然过氧化物酶(如:辣根过氧化物酶HRP)有很高效的催化性能，rGO‑GP的Km值为0.024mM，约为HPR(0.43mM)的20倍，是能成为一种替代天然过氧化物酶非常实用的纳米酶。
为大量制备绿色无污染的纳米酶提供了新的方法和思路。

附图说明

[0027] 图1为本发明实施例1中GO and rGO‑GP的UV‑Vis图；

[0028] 图2为本发明实施例1中GO and rGO‑GP的FTIR图；

[0029] 图3为本发明实施例1中GO and rGO‑GP的SEM图；图中A为GO，图中B为rGO‑GP；

[0030] 图4为本发明实施例1中不同反应体系的UV‑Vis谱图；图中A为不同反应体系的UV‑Vis谱图，图中B为在652nm处对应的光谱变化随反应时间的变化。

具体实施方式

[0031] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0032] 下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

[0033] 实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

[0034] 以下实施例中：石墨和TMB购买自阿拉丁。硫酸(98％)，过氧化氢(30％)，KMnO4，氨水购买自中国国药集团。灵芝来源于中国金寨。

[0035] 实施例1

[0036] 灵芝多糖还原氧化石墨烯制备纳米酶的方法，包括以下步骤：

[0037] (1)制备氧化石墨烯：将1.5g石墨粉加入50ml质量分数为98％的硫酸中，在5℃的冰水浴中进行搅拌，同时加入6g KMnO4搅拌1h，将温度升至40℃反应1h，再调温度到85℃后，逐滴滴加50ml H2O，保温30min；最后再加5ml质量分数为30％的H2O2，直至无明显气泡产生，反应5min；再用5％HCl进行洗涤，接着用去离子水不断洗涤，最后将固体材料分散在水中，超声处理2h，获得氧化石墨烯(GO)水溶液。

[0038] (2)灵芝多糖的提取：将灵芝粉用粉碎机磨碎后在80℃水浴中保存3h，再将灵芝水冷冻干燥，得到灵芝多糖固体粉末，本实施例中灵芝粉与水的质量比为1:10。

[0039] (3)取20mg灵芝多糖(GP)分散于50ml,0.1mg/ml GO水溶液中，再加入20ul NH3·H2O，在80℃下搅拌均匀，然后用去离子水清洗材料，获得纳米酶，命名为rGO‑GP。

[0040] 实施例2

[0041] (1)制备氧化石墨烯：将3g石墨粉加入100ml质量分数为98％的硫酸中，在3℃的冰水浴中进行搅拌，同时加入12g KMnO4搅拌1h，将温度升至40℃反应1h，再调温度到85℃后，逐滴滴加50ml H2O，保温30min；最后再加5ml质量分数为30％的H2O2，直至无明显气泡产生，反应5min；再用5％HCl进行洗涤，接着用去离子水不断洗涤，最后将固体材料分散在水中，超声处理2h，获得氧化石墨烯水溶液。

[0042] (2)灵芝多糖的提取：将灵芝粉用粉碎机磨碎后在80℃水浴中中提取3h，旋转蒸发后冷冻干燥得到灵芝多糖固体粉末，本实施例中灵芝粉与水的质量比为1:10。

[0043] (3)取30mg灵芝多糖(GP)分散于75ml,0.1mg/ml GO溶液中，再加入30ul NH3·H2O，在80℃下搅拌均匀，然后用去离子水清洗材料，获得纳米酶。

[0044] 实施例3

[0045] (1)制备氧化石墨烯：将6g石墨粉加入200ml质量分数为98％的硫酸中，在3℃的冰水浴中进行搅拌，同时加入24g KMnO4搅拌1h，将温度升至40℃反应1h，再调温度到85℃后，逐滴滴加50ml H2O，保温30min；最后再加5ml质量分数为30％的H2O2，直至无明显气泡产生，反应5min；再用5％HCl进行洗涤，接着用去离子水不断洗涤，最后将固体材料分散在水中，超声处理2h，获得氧化石墨烯水溶液。

[0046] (2)灵芝多糖的提取：将灵芝粉用粉碎机磨碎后在80℃水浴中保存3h，再将灵芝水冷冻干燥，得到灵芝多糖固体粉末，本实施例中灵芝粉与水的质量比为1:10。

[0047] (3)取40mg灵芝多糖(GP)分散于100ml,0.1mg/ml GO溶液中，再加入40ul NH3·H2O，在80℃下搅拌均匀，然后用去离子水清洗材料，获得纳米酶。

[0048] 对比例1

[0049] 本对比例与实施例1的区别之处在于：将灵芝多糖替换成壳聚糖，制得的产物命名为rGO。

[0050] UV‑Vis可有效监测实施例1中的GO是否被还原成了rGO。

[0051] 如图1所示，230nm和300nm处有两个吸收峰，分别对应氧化石墨烯的C＝C键和C＝O键。加入GP后，可以明显发现230nm处的峰红移，这是由于含氧官能团的去除使得石墨烯层中的电子共轭态被复原。这可以有效证明灵芝多糖可有效地将GO还原成rGO。

[0052] 图2的红外谱图也可以证明实施例1中的GO还原成rGO。1700cm‑1的出现是由于C＝O‑1 ‑1键，1400cm 是由于O‑H键，而1030cm 是由于C‑O键。对比GO，用灵芝多糖还原得到的rGO中的C‑C键明显增强，C＝O/C‑O键明显减弱。

[0053] 为了能够直观的看到rGO的形貌特征，对材料进行了SEM。如图3所示，对比GO，经还原后的rGO‑GP表面褶皱明显增加。这是由于rGO之间的折叠造成的。

[0054] 对比对比例1的rGO存在的过氧化物酶底物TMB在H2O2中的催化氧化反应。如图4所示，含有H2O2和TMB的溶液在rGO‑GP存在下变蓝，说明过氧化氢对TMB的氧化有促进作用。同样的，rGO‑GP/TMB/H2O2体系在652nm处的吸光度强于单一的rGO/TMB/H2O2，也证实了rGO‑GP可作为类过氧化物纳米酶所具有的优异催化能力。如图4中的插图所示，含有H2O2和TMB的溶液在rGO‑GP存在下变蓝，也进一步证实过氧化氢对TMB的氧化具有催化作用，rGO‑GP/TMB/H2O2体系在652nm处的吸光度高于单一的rGO/TMB/H2O2，证实了rGO‑GP作为类过氧化物纳米酶具有优异的催化能力。实施例2和实施例3中产物的性能与实施例1相近。

[0055] 对rGO‑GP的Km值进行测定，rGO‑GP的Km值为0.024mM，约为HPR(0.43mM)的20倍。

[0056] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。