用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针及制备方法

摘要

本发明公开了用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针及其制备方法。将EDC、HOBt、香豆素‑3‑羧酸的混合物在DMF中溶解，加入TEPP46搅拌，经脱水缩合反应后制得固体TEPC466。该荧光探针具有聚集诱导发光性质，与PKM2蛋白特异性结合后，诱导PKM2形成四聚体使分散的探针聚集，光化学效应显著增强，灵敏度高，在检测过程中不易受生物体系中其它成分干扰，对PKM2蛋白具有高选择性。该探针对细胞毒性小，有良好的生物相容性，可用于细胞内PKM2蛋白的成像检测和特异性靶向激动。该探针作为PKM2蛋白靶点的定量定性检测和激动剂，对临床诊疗一体化提供了一种有价值的方法。

权利要求

1.一种用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针，结构如式I所示，代号为TEPC466：

。

2.根据权利要求1所述的用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针，其特征在于，具有聚集诱导发光(aggregation‑induced emission，AIE)特性，当加入TEPC466时，二聚体的PKM2在生理条件下被诱导形成四聚体，分散的TEPC466积累并发出荧光。

3.根据权利要求1所述的用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针，其特征在于，可定量和定性检测PKM2蛋白。

4.根据权利要求2所述的用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针，其特征在于，该探针与PKM2蛋白反应的最大激发波长为310nm，发射波长范围为330‑500nm，且荧光发射强度与PKM2蛋白浓度相关。

5.根据权利要求2所述的用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针，其特征2

在于，当探针浓度为10μM时，定量检测PKM2蛋白的浓度线性范围为0.0625‑4μg/mL，R ＝

0.9997。

6.根据权利要求1所述的用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针，其特征在于，可作为细胞中PKM2蛋白靶向激动剂。

7.权利要求1所述的用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针的制备方法，其特征在于，将EDC、HOBt、香豆素‑3‑羧酸的混合物在DMF中溶解，加入TEPP46搅拌，经脱水缩合反应后制得固体TEPC466。

说明书

用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针及制备

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及化学探针及制备方法，特别涉及用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针及制备方法。

背景技术

[0002] 丙酮酸激酶(Pyruvate kinase，PK)是糖酵解途径中催化最后一步反应的关键限速酶，它催化磷酸基团从磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate，PEP)转移至二磷酸腺
苷(Adenosine diphosphate，ADP)，生成三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)和丙
酮酸。

[0003] PK具有四种同工酶形式，分别为PKM1、PKM2、PKL和PKR。每种同工酶都具有独特的组织表达特异性。PKL、PKR和PKM1均作为稳定的四聚体存在，具有高度的代谢酶活性，而
PKM2亚基可形成四聚体和二聚体。与PKM2的四聚体形式相比，二聚体PKM2对底物PEP具有较
高的Km值，在生理浓度PEP时不具有活性。PKM2在肿瘤细胞中的高表达和二聚体低酶活性赋
予糖酵解表型，有助于增加葡萄糖摄取，抑制丙酮酸进入三羧酸循环进行氧化磷酸化代谢，
促进快速能量产生和糖酵解中间体向侧支途径流动以合成核酸、氨基酸和脂质等生物大分
子，有利于肿瘤的生长而不积累活性氧。在肿瘤细胞内用组成型活性同工酶PKM1替代PKM2
会导致乳酸生成减少，耗氧量增加，抑制肿瘤的生长。

[0004] 已有研究表明，许多疾病如结直肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌的发生与PKM2的高表达密切相关，PKM2的高表达可能是肿瘤发生的早期事件，且与预后相关。因此，PKM2可以作为
早期发现肿瘤的有用的生物标志物和治疗靶点，开发一种可直接高灵敏度地检测和靶向生
物体系中PKM2蛋白的荧光探针具有非常好的应用前景和重要的生物医学价值。

[0005] 近年来，小分子荧光探针作为一种新型的研究工具，可以对靶分子进行示踪和靶向，在生命科学、肿瘤诊断和治疗等研究领域中都大显身手。然而，目前还未有针对PKM2蛋
白的荧光探针的发明创造。

发明内容

[0006] 发明目的：本发明的目的是提供了用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针。

[0007] 本发明的另一目的提供所述用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针的制备方法。

[0008] 技术方案：本发明通过对PKM2的高效选择性激活剂TEPP46(结构如式II所示)进行结构改造，设计、合成了一种基于TEPP46的可定位检测PKM2蛋白四聚体的AIE新型荧光探针
TEPC466，其结构如式I所示。

[0009]

[0010] 进一步地，该探针具有聚集诱导发光(aggregation‑induced emission，AIE)特性，当加入TEPC466时，二聚体的PKM2在生理条件下被诱导形成四聚体，分散的TEPC466积累
并发出荧光。

[0011] 进一步地，该探针可定量和定性检测PKM2蛋白。

[0012] 进一步地，该探针与PKM2蛋白反应的最大激发波长为310nm，发射波长范围为330‑500nm，且荧光发射强度与PKM2蛋白浓度相关。

[0013] 进一步地，当探针浓度为10μM时，定量检测PKM2蛋白的浓度线性范围为0.0625‑4μ2
g/mL，R＝0.9997。

[0014] 进一步地，可作为细胞中PKM2蛋白靶向激动剂。

[0015] 所述的用于特异性检测和激动PKM2蛋白的小分子荧光探针的制备方法，将EDC、HOBt、香豆素‑3‑羧酸的混合物在DMF中溶解，加入TEPP46搅拌，经脱水缩合反应后制得固体
TEPC466。

[0016] 本发明所公开的特异性检测PKM2蛋白的小分子荧光探针，将香豆素结构引入TEPC466，当加入TEPC466时，二聚体的PKM2在生理条件下被诱导形成四聚体，分散的
TEPC466聚集并发出强烈的荧光。本发明公开的特异性检测PKM2蛋白的小分子荧光探针的
最大激发波长为310nm，在不含有PKM2蛋白的情况下，几乎无荧光发射，一旦加入PKM2蛋白
后，在330‑500nm发射波长范围内可发出荧光，最大发射波长为386nm。探针具有较大的斯托
克斯位移，可以很好地消除背景干扰。另外，探针的荧光强度随PKM2蛋白浓度梯度的升高而
增强，检测灵敏，在0.0625‑4μg/mL的PKM2蛋白浓度范围内，荧光强度与蛋白浓度呈线性相
2
关，R＝0.9997。

[0017] 有益效果：本发明首次合成了基于PKM2激动剂TEPP46结构的新型荧光探针TEPC466。TEPC466具有AIE性质，可特异性定量定性检测和激动PKM2蛋白。本发明的特异性
检测PKM2蛋白的小分子荧光探针不受生物体系中其他物质的干扰，在PKM2蛋白存在下荧光
强度发生显著改变，检测限低，灵敏度高，对PKM2蛋白具有高选择性。本发明的小分子荧光
探针对细胞的毒性低，细胞通透性好，生理pH条件下稳定，具有良好的生物相容性，检测直
观稳定，成功应用于细胞内PKM2蛋白的成像检测和PKM2的代谢酶激动剂，可为进一步研究
细胞中PKM2蛋白的生物学功能和治疗肿瘤提供可靠的工具。

附图说明

[0018] 图1为TEPP46和TEPC466固体粉末在紫外线(365nm)照射下的荧光图，左上角为固体粉末在白炽灯照射下的对比图；

[0019] 图2为不同比例的水和四氢呋喃(THF％＝0‑100)对TEPC466(10μM)荧光发射光谱的影响；

[0020] 图3为TEPC466(10μM)与不同浓度的PKM2(0‑20μg/mL)反应的荧光发射光谱；

[0021] 图4为在386nm处TEPC466(10μM)与0.0625‑4μg/mL PKM2反应，荧光强度与浓度呈线性相关；

[0022] 图5为TEPC466(10μM)与1mM各种干扰物质(Na+、K+、Cl‑、His、Ala、Cys、Gly、Arg、Tyr、GSH、Glc)以及PKM2(16μg/mL)反应的荧光发射光谱；

[0023] 图6为在386nm处TEPC466(10μM)与1mM各种干扰物质(Na+、K+、Cl‑、His、Ala、Cys、Gly、Arg、Tyr、GSH、Glc)以及PKM2(16μg/mL)反应的荧光强度变化；

[0024] 图7为TEPC466对细胞毒性的评估；

[0025] 图8为TEPC466在细胞中的共聚焦成像；

[0026] 图9为TEPC466对PKM2蛋白的靶向激动作用测定。ns：p＞0.05，**P＜0.01，***P＜****
0.001， P＜0.0001。

具体实施方式

[0027] 本发明实施例中所使用的试剂和材料，如无特别说明，均可从市售渠道购买。

[0028] 实施例1：TEPC466的合成

[0029] 将EDC(46mg，0.24mmol)，HOBt(36.48mg，0.24mmol)，香豆素‑3‑羧酸(38mg，0.2mmol)的混合物在DMF(10mL)中溶解，室温下搅拌约半小时，然后加入TEPP46(74.4mg，
0.2mmol)，搅拌4小时。将混合物倒入50mL水中，并用EtOAc(20mL×3)萃取。合并的有机层先
用饱和NH4Cl(20mL×2)洗涤，随后盐水(20mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。用硅胶
柱层析对其进行纯化，得到黄色固体TEPC466。

[0030]

[0031] 实施例2：TEPC466的AIE特性

[0032] 如说明书附图1所示，在365nm激发波长的紫外线下，我们发现固体TEPC466发出强烈的黄色荧光，而TEPP46没有。TEPC466的低溶解性会通过激发态分子内质子转移导致荧光
特征的沉淀。TEPC466作为一种具有AIE性质的化合物，在固态时能够发出强烈的荧光，可能
是因为碳‑碳键旋转受到限制。

[0033] 为了进一步证明TEPC466具有AIE特性，我们用二甲基亚砜(DMSO)制备了TEPC466母液，浓度为10mM，研究TEPC466(10μM)在四氢呋喃(THF)/H2O系统中的荧光发射光谱。如说
明书附图2所示，采用岛津RF6000荧光分光光度计，在310nm的最大激发波长下，设置激发光
狭缝宽度为3nm，发射光狭缝宽度为5nm，扫描320‑500nm范围内的荧光发射光谱。与THF相
比，水是TEPC466的更好溶剂，当THF比率越来越高时，在420nm附近的发射峰有轻微的蓝移。
所以TEPC466几乎不溶于有机介质，并在固态时发出强烈的荧光。

[0034] 实施例3：His‑Tagged‑PKM2质粒转染和蛋白纯化

[0035] 在37℃，含5％CO2的细胞培养箱中，用含10％胎牛血清(Biological Industries)和1％青霉素/链霉素(Gibco)的DMEM(Gibco)培养基培养293T细胞(中国科学院细胞库)。待
TM
培养皿中的细胞覆盖率达70％左右，根据制造商的说明，使用Lipofectamine  3000转染试
剂(Invitrogen)，在无抗生素的DMEM培养基中，将His‑Tagged‑PKM2质粒(EX‑Z7438‑M01，
GeneCopoeia)转染293T细胞。待293T细胞转染质粒24h后，使用His‑Tagged蛋白镍柱纯化试
剂盒(TaKaRa)纯化His‑Tagged‑PKM2蛋白，随后用BCA蛋白浓度测定试剂盒(Beyotime)对已
纯化出来的His‑Tagged‑PKM2蛋白进行浓度测定，蛋白保存于‑80℃冰箱备用。

[0036] 实施例4：TEPC466与不同浓度的PKM2蛋白反应的荧光发射光谱测定

[0037] 将TEPC466用适量的DMSO充分溶解配制成10mM储备液，保存于4℃的冰箱备用。应注意，在所有的光谱测定中，反应液均需现配现用。取实施例3中所制备的His‑Tagged‑PKM2
蛋白，用PBS缓冲溶液(10mM，pH 7.4)将蛋白梯度稀释至0、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4、
8、16和20μg/mL。随后加入TEPC466母液使其反应工作浓度为10μM，将TEPC466与不同浓度的
PKM2蛋白在37℃水浴下准确反应10min，按顺序将上述反应液依次加入至石英比色皿中，扫
描TEPC466与PKM2蛋白反应的激发光谱和发射光谱，最终确定反应的最大激发波长为
310nm。在反应最大激发波长310nm处，设置激发光狭缝宽度为3nm，发射光狭缝宽度为5nm，
测定并记录330‑500nm波长范围内的荧光发射光谱。其结果如说明书附图3所示，单独的10μ
M TEPC466在最大激发波长为310nm的激发光下仅在330‑350nm波长范围内有微弱的荧光，
而当TEPC466与PKM2蛋白混合反应后，在386nm处显示出明显的荧光增强信号，且荧光强度
随PKM2蛋白浓度的增加而增强，检测灵敏度高。此外，如说明书附图4所示，在386nm处
TEPC466与PKM2蛋白反应荧光强度在0.0625‑4μg/mL的蛋白浓度范围内有良好的线性关系
(R2＝0.9997)。这些结果表明，TEPC466对PKM2蛋白有较高的检测灵敏度，能够快速响应并
产生强烈的荧光。

[0038] 实施例5：TEPC466对PKM2的选择性评估

[0039] 为了验证TEPC466对PKM2蛋白具有高选择性，我们将10μM TEPC466分别与各种干+ + ‑
扰物质(用PBS缓冲溶液配制成反应工作浓度为1mM)，包括多种离子(Na 、K 、Gl)、氨基酸
(His、Ala、Cys、Gly、Arg、Tyr)、谷胱甘肽(GSH)和葡萄糖(Glc)在37℃水浴下准确反应
10min，为了进行对比，我们还将TEPC466与PKM2(16μg/ML)在相同条件下反应10min，随后立
即测定在310nm最大激发波长下，330‑500nm波长范围内的荧光发射光谱。如说明书附图5所
示，在TEPC466中分别加入其它干扰物质后，330‑500nm波长范围内几乎无荧光响应。但在
TEPC466中加入PKM2蛋白后荧光强度显著增强，在386nm处显示出明显的荧光发射峰。此外，
柱状图(说明书附图6)显示TEPC466与各种干扰物质以及PKM2反应后在386nm处的荧光强
度。结果表明，TEPC466仅在PKM2存在时才产生极强的荧光，说明TEPC466对PKM2具有很高的
选择性。

[0040] 实施例6：TEPC466的细胞毒性评估

[0041] 在TEPC466应用于细胞共聚焦成像之前，对TEPC466在肿瘤细胞中的细胞毒性进行了评估。选用肠癌细胞系HCT116和HT29(中国科学院细胞库)，分别接种于含10％胎牛血清
和1％青霉素/链霉素的McCoy’s 5A(Gibco)培养基中，在37℃，5％CO2的加湿培养箱中培
养。待细胞密度长至90％左右，细胞消化离心接种至96孔板，24h后，弃去细胞原有的培养
基，每孔加入含不同浓度(0、2、4、6、8、10、12、16、20μM)TEPC466的培养基100μL，继续培养
24h。使用CCK‑8试剂盒(Vazyme)评估TEPC466对细胞的毒性。如说明书附图7所示，在癌细胞
中随着TEPC466浓度的升高，细胞的活力几乎没有受到影响，表明TEPC466对细胞低毒性，具
有良好的生物相容性。

[0042] 实施例7：TEPC466的细胞成像

[0043] 鉴于TEPC466良好的光谱特性和细胞低毒性，我们接下来研究了TEPC466在细胞中检测PKM2蛋白的能力。因为在肿瘤细胞中PKM2高表达，选用肠癌细胞系HT29。实验分为两
组，将肠癌细胞系HT29接种至共聚焦小皿内，待细胞贴壁后，按照制造商的说明，使用
TM
Lipofectamine  RNAiMAX转染试剂(Invitrogen)，转染购自广州锐博公司设计的小干扰
RNA(siRNA)。一组转染PKM2的小干扰RNA(siPKM2)将PKM2蛋白沉默，以获得PKM2低表达的细
胞作为阴性对照组。另一组转染对照siRNA，作为PKM2表达的阳性对照组。两组细胞转染24h
后，给予含20μM探针的培养基孵育细胞2h，弃去培养基，用PBS缓冲液洗净残留培养基，使用
蔡司激光扫描共聚焦显微镜LSM700成像。如说明书附图8所示，TEPC466加入至阳性对照细
胞后，在细胞内有强烈的蓝色荧光，而转染了siPKM2的阴性对照细胞中蓝色荧光非常微弱，
这表明TEPC466可以检测细胞内PKM2蛋白的表达水平以及区分PKM2高表达的肿瘤细胞和
PKM2低表达的正常细胞，用于癌症的早期判断。

[0044] 实施例8：TEPC466对PKM2蛋白的靶向激动作用测定

[0045] TEPC466的设计是基于PKM2蛋白的特异性激动剂TEPP46。已知TEPP46可以促进PKM2的二聚体向四聚体构型的转变从而使得PKM2的丙酮酸激酶活性升高。我们使用丙酮酸
激酶活性测定试剂盒(BioVision)中的测定缓冲液稀释实施例3中所制备的His‑Tagged‑
PKM2蛋白至终浓度16μg/mL，随后分别与0，5，10，20，40μm TEPC466在37℃下准确反应
30min，根据制造商的说明，通过比色法测定PKM2的丙酮酸激酶活性。如说明书附图9所示，
PKM2的丙酮酸激酶活性随TEPC466浓度的升高而逐渐增强，当TEPC466浓度为40μM时，PKM2
的丙酮酸激酶活性升高约1.5倍，且就有显著性差异，这表明TEPC466可以作为PKM2的靶向
激动剂。