一种多肽及其在制备治疗乳腺癌药物中的应用转让专利
申请号 : CN202011247065.8
文献号 : CN112409459B
文献日 : 2022-06-07
发明人 : 石磊 , 杨娜 , 姚智 , 马帅 , 曹程 , 车世友
申请人 : 天津医科大学
摘要 :
本发明涉及一种多肽及其在制备治疗乳腺癌药物中的应用，该多肽的序列为：GACFKDAEYIYPSLESDDDDPA。本发明具有如下有益效果：1)该多肽(APS)可特异性地破坏PHF8与TOPBP1结合，但不会影响PHF8其他方面的功能；2)该多肽(APS)对于肿瘤细胞尤其是乳腺癌肿瘤细胞的生长过程具有明显抑制作用；3)该多肽(APS)配合化疗药物顺铂或PARP抑制剂能够更有效地杀伤肿瘤细胞，为肿瘤的治疗提供新思路。
权利要求 :
1.一种多肽，其特征在于：其序列为：GACFKDAEYIYPSLESDDDDPA。
2.权利要求1所述多肽在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
3.一种药物组合，其特征在于：该药物组合包括权利要求1所述多肽和顺铂，或者包括权利要求1所述多肽和PARP抑制剂Rucaparib。
4.权利要求3所述药物组合在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
说明书 :
一种多肽及其在制备治疗乳腺癌药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种多肽及其在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
背景技术
[0002] 全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。中国虽然不是乳腺癌的高发国家，但近年我国乳腺癌发病率的增长速度已高出高发国家1～2个百分点。英国《独立报》也指出，2000年至2013年，中国乳腺癌年平均增长率约3.5％，而美国同期下降了0.4％。目前我国乳腺癌现状不容乐观：首先，发病率方面，国家癌症中心发布的《2017年中国肿瘤的现状和趋势》报告显示，乳腺癌发病率位列女性恶性肿瘤之首；中国乳腺癌发病率低于西方国家，增速却位列世界首位。其次是死亡率，美国乳腺癌平均5年生存率为90％，中国只有73.1％。最后是发病早，通常乳腺癌发病年龄段一般在四十五到五十五岁，但在中国，五十岁左右的人发病率最高。，西方国家实际上是到了六七十岁才是一个中位的高峰期，中国相对来说要早十几年。因此对于如何降低乳腺癌的发病率和死亡率是国内外科研人员所面临的难题。
[0003] 复制压力是内源性DNA损伤的主要来源，对复制压力的合理应答是细胞维持遗传物质稳定性的重要途径之一。如果不能有效地缓解复制压力，可能导致正常细胞突变累积，引起细胞衰老或者癌变。与正常细胞相比，肿瘤细胞常伴有细胞周期G1/S检查点的缺陷，且DNA复制更频繁，这些特征使肿瘤细胞在DNA复制过程中面临巨大的压力。肿瘤细胞中，若累积的复制压力不能有效缓解，会使肿瘤细胞进入有丝分裂崩溃状态，致使细胞死亡。因此，了解复制压力应答的分子机制，对于认识基因组稳定性和肿瘤治疗具有重要的生物学意义和临床意义。
[0004] 通常产生复制压力的原因包括DNA缺口、DNA链断裂、核苷酸的错误掺入、不正常的DNA结构、复制和转录之间的冲突、必要复制因子的缺失以及染色体的不稳定性等，这些因素可以导致复制叉停滞或复制叉崩溃。复制压力一般会诱发单链DNA(ssDNA)结构产生，它可以是DNA聚合酶停滞而复制相关的解旋酶继续解螺旋双链DNA产生，也可以是解旋酶失活或功能抑制导致复制叉断裂产生。ssDNA的持续存在会被复制蛋白A(RPA)复合物(RPA70、RPA32以及RPA14)包裹，产生激活复制压力应答的信号：ssDNA‑RPA复合物。这种结构作为信号传递的平台招募大量复制压力相关的蛋白，如共济失调‑毛细血管扩张突变和RAD3相关蛋白(ATR)。ATR是复制压力应答中最重要的激酶，它能够被招募到ssDNA区域并磷酸化包括细胞周期检查点和缓解复制压力的底物蛋白，以维持基因组稳定性并帮助细胞存活。
[0005] ATR信号的激活对于整个应答过程是非常重要的，其中拓扑异构酶II结合蛋白1(TOPBP1)是ATR被募集到ssDNA‑RPA复合物后促进ATR信号激活的关键蛋白之一。目前已知的模型是(图8)：当复制叉停滞或者崩溃时，形成的ssDNA‑RPA/dsDNA复合物会招募ATR/ATRIP，此时的ATR发生自磷酸化同时磷酸化ATR相互作用蛋白ATRIP，而MDC1/MRN(MRE11‑RAD50‑NBS1)复合物能够及时招募TOPBP1；在RAD17和9‑1‑1(RAD9‑RAD1‑HUS1)复合物的辅助下，TOPBP1一方面通过ATR激活结构域AAD结合ATR/ATRIP，另一方面通过C端的第7和第8个BRCT结构域结合自磷酸化的ATR，进而TOPBP1别构性活化ATR，促使ATR磷酸化下游底物如RPA32和Chk1等。最近有研究表明，结合ssDNA‑RPA复合物的ETAA1，可以利用其类似于TOPBP1的AAD结构域激活ATR。总体来说，ATR活化需要三个过程的调节：RPA复合物在ssDNA上沉积；ATR/ATRIP与ssDNA‑RPA复合物的结合；以及TOPBP1/ETAA1等调节ATR活性。但是关于ATR活化的分子机理仍有很多未知需要探索。
[0006] 目前已知TOPBP1在包括乳腺癌在内的多种肿瘤中均呈现异常高表达趋势，而我们前期研究发现组蛋白去甲基化酶PHF8表达水平的异常升高与乳腺癌发生发展密切相关。临床数据分析提示PHF8和TOPBP1同时高表达的乳腺癌病人预后更差。尽管在肿瘤发生发展中异常激活的组蛋白去甲基化酶是理想的药物靶点，但是由于去甲基化酶家族酶活性结构域的保守性，使得靶向酶活性中心的特异性大大降低。我们的研究提示，PHF8‑TOPBP1物理上的相互作用有很大潜力成为ATR信号通路健全肿瘤的治疗靶点。
发明内容
[0007] 本发明 创造合成能够特异性靶向PHF8与TOPBP1结合的22aa(GACFKDAEYIYPSLESDDDDPA，以下称为APS)的多肽，通过竞争性的结合TOPBP1，使PHF8与TOPBP1相互作用减弱，从而抑制TOPBP1对ATR信号通路激活过程，使肿瘤细胞复制产生的复制压力不能有效缓解最终导致肿瘤细胞的死亡；与此同时，我们发现联合化疗药物顺铂(cisplatin)和PARP抑制剂rucaparib能够更有效地杀伤肿瘤细胞，为乳腺癌的治疗提供了新的治疗方案。
[0008] 本发明采用的技术方案为：
[0009] 一种多肽，其序列为：GACFKDAEYIYPSLESDDDDPA(SEQ ID NO：1)。
[0010] 本发明还提供了上述多肽在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
[0011] 本发明还提供了上述多肽在制备用于抑制PHF8与TOPBP1结合的药物中的应用。
[0012] 本发明还提供了上述多肽在制备用于抑制肿瘤细胞ATR信号通路的激活的药物中的应用。
[0013] 本发明还提供了一种药物组合，该药物组合包括上述多肽和顺铂；或者该药物组合包括上述多肽和PARP抑制剂rucaparib。
[0014] 本发明还提供了上述药物组合在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
[0015] 本发明所具有的有益效果：
[0016] 1)本发明多肽(APS)是特异性的破坏PHF8与TOPBP1结合的分子，并不会影响PHF8其他方面的功能；
[0017] 2)本发明多肽(APS)对于肿瘤细胞尤其是乳腺癌肿瘤细胞的生长过程是明显抑制的；
[0018] 3)本发明多肽(APS)配合化疗药物顺铂或PARP抑制剂能够更有效地杀伤肿瘤细胞，为肿瘤的治疗提供新的思路。
附图说明
[0019] 图1：免疫共沉淀及表面等离子共振(SPR)实验鉴定PHF8与TOPBP1相互作用位点；
[0020] 如图1A Left所示，在HeLa细胞里转染TOPBP1的不同缺失体(ΔBRCT0‑2，ΔBRCT3，ΔBRCT4‑5，ΔBRCT6和ΔBRCT7‑8)，利用免疫共沉淀实验发现一旦缺失BRCT7‑8，TOPBP1与PHF8的相互作用丧失；如图1A Middle所示，利用TOPBP1的截短体(BRCT0‑2，BRCT3，BRCT4‑5，BRCT6和BRCT7‑8)进行免疫共沉淀实验，我们发现TOPBP1的5个截短体中只有BRCT7‑8与PHF8存在相互作用；如图1A Right所示，利用PHF8的6个截短体(N,C,C1,C2,C3,C4)进行免疫共沉淀实验，发现PHF8的C端C3与C4之间的22个氨基酸(以下称APS)负责与TOPBP1结合。
如图1B所示，我们利用缺失APS的PHF8进行免疫共沉淀验证，发现一旦缺失APS，PHF8与TOPBP1结合能力丧失。图1C Middle中，所示曲线从上往下依次为20μM，10μM，5μM，2.5μM，
1.25μM，0.625μM，0.313μM。随着BRCT7‑8浓度的升高，BRCT7‑8与APS结合的强度增强，将该曲线利用分子动力学模拟计算出ka(结合速率常数)，kd(解离速率常数)，KD(解离常数)。而APS‑N21(图1C Left)，APS‑C22(图1C Right)无论BRCT7‑8浓度如何变化，二者均没有结合。
如图1B所示，我们利用缺失APS的PHF8进行免疫共沉淀验证，发现一旦缺失APS，PHF8与TOPBP1结合能力丧失。图1C Middle中，所示曲线从上往下依次为20μM，10μM，5μM，2.5μM，
1.25μM，0.625μM，0.313μM。随着BRCT7‑8浓度的升高，BRCT7‑8与APS结合的强度增强，将该曲线利用分子动力学模拟计算出ka(结合速率常数)，kd(解离速率常数)，KD(解离常数)。而APS‑N21(图1C Left)，APS‑C22(图1C Right)无论BRCT7‑8浓度如何变化，二者均没有结合。
[0021] 图2：APS相应突变体实验验证；
[0022] 如图2A所示，PHF8‑APS上关键氨基酸的突变体(C844S，D847A，S854A，Y850A，Y852A)与TOPBP1通过免疫共沉淀实验发现C844S，D847A，S854A这3个突变体导致二者结合减弱，而Y850A，Y852A突变体使PHF8与TOPBP1的结合基本丧失。因此得出结论Y850和Y852是APS上主要负责与TOPBP1结合的氨基酸；如图2B所示，首先我们在敲低PHF8的细胞里分别外源性表达vector(空白对照)、PHF8/wt(野生型)、PHF8/H247A(酶活性突变体)、PHF8/Y852A，我们发现敲低PHF8或者敲低PHF8后再过表达PHF8/H247A，H3K9me2、H3K27me2、H4K20me1水平上升，而在敲低PHF8后再表达PHF8/wt、PHF8/Y852A，H3K9me2、H3K27me2，H4K20me1水平明显下降，说明PHF8/Y852A并没有影响PHF8去甲基化酶的活性，只是影响了PHF8与TOPBP1的结合。
[0023] 图3：在CPT处理下，免疫印迹实验和免疫荧光实验检测ATR信号激活情况；
[0024] 如图3A所示，在稳定表达GFP‑vector，GFP‑APS，GFP‑APS‑C22蛋白的U2OS细胞里，采用1μM CPT处理1小时，检测ATR激活的下游底物RPA32，CHK1磷酸化状态的变化，以β‑actin作为内参，只有表达APS的细胞，ATR下游底物磷酸化水平降低；如图3B所示，我们利用免疫荧光技术在HU处理4小时后，检测ATR下游底物RPA32 pS33foci(点状结构)形成的数量，结论是表达GFP‑APS的细胞里，RPA32 pS33 foci形成能力明显减弱。
[0025] 图4：U2OS细胞在不同浓度CPT处理下检测GFP‑vector，GFP‑APS，GFP‑APS‑C22细胞的生存率变化；
[0026] 如图4所示，折线图由上往下每条线依次为GFP，APS‑C22，APS。我们得出结论，表达GFP‑APS的U2OS细胞在CPT药物作用下细胞与表达GFP，GFP‑APS‑C22的细胞相比生存率明显下降。
[0027] 图5：MDA‑MB‑231细胞在不同浓度CPT和rucaparib处理下检测GFP‑vector，GFP‑APS，GFP‑APS‑C22细胞的生存率变化；
[0028] 如图5A所示，折线图由上往下每条线依次为GFP，APS‑C22，APS。因此可以看出，在MDA‑MB‑231细胞里，表达GFP‑APS使细胞对CPT药物的抵抗能力下降，同理图5B可以得出结论，GFP‑APS的表达可以协同rucaparib从而更好的杀伤MDA‑MB‑231细胞。
[0029] 图6：异种移植表达GFP‑APS，GFP‑APS‑C22的MDA‑MB‑231细胞至NOD/SCID鼠，分别检测不同处理下小鼠的肿瘤体积和重量变化；
[0030] 如图6A Left所示，展示的是四组处理下不同小鼠肿瘤图片，图6Right展示的是给予NOD/SCID雌性小鼠分别在乳房垫注射表达GFP‑APS，GFP‑APS‑C22的MDA‑MB‑231细胞，我们发现表达GFP‑APS细胞的小鼠肿瘤生长的体积明显小于表达GFP‑APS‑C22的肿瘤体积，并且在rucaparib的作用下，表达GFP‑APS细胞的小鼠肿瘤生长的体积更加明显的小于表达GFP‑APS‑C22的肿瘤体积。如图6B所示，注射GFP‑APS细胞的小鼠肿瘤重量轻于注射GFP‑APS‑C22的肿瘤重量，在rucaparib的药物作用下，注射GFP‑APS细胞的小鼠肿瘤重量更加小于注射GFP‑APS‑C22的肿瘤重量。因此我们得出结论APS对于肿瘤生长起明显的抑制作用并且在联合rucaparib药物的作用下，会进一步抑制肿瘤的生长。
[0031] 图7：异种移植表达GFP‑APS，GFP‑APS‑C22的MMTV‑PyMT原代细胞至C57BL/6J小鼠，检测不同处理下小鼠的肿瘤重量变化；
[0032] 如图7 Left所示，展示了四组不同处理下取出的小鼠肿瘤的图片，图7Middle和Right展示了C57BL/6J小鼠在移植表达GFP‑APS，GFP‑APS‑C22的MMTV‑PyMT原代细胞后，注射GFP‑APS的小鼠肿瘤重量轻于注射GFP‑APS‑C22的肿瘤重量，并且在顺铂的作用下，注射GFP‑APS细胞的小鼠肿瘤重量比注射GFP‑APS‑C22细胞的小鼠肿瘤重量进一步减轻。因此得出结论，APS能够一定程度上抑制肿瘤生长并且在联合顺铂的作用下，小鼠肿瘤生长进一步受抑制。
[0033] 图8为背景技术中提到的ATR活化的分子机理图。
具体实施方式
[0034] 为了理解本发明，下面结合具体实施实例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。
[0035] 首先我们的研究发现PHF8会通过影响TOPBP1在停滞或者崩溃的复制叉处的募集进而影响ATR信号通路的激活使累积的复制压力不能有效缓解，促进肿瘤细胞进入有丝分裂崩溃状态，致使细胞死亡。而PHF8促进TOPBP1募集到复制叉的前提之一是TOPBP1与PHF8产生直接接触。我们发现了PHF8上与TOPBP1结合的关键氨基酸APS，并且进一步确定了APS上重要的作用位点。
[0036] 为了进一步探究APS在抵抗肿瘤生长方面的功能，我们构建了稳定表达GFP‑vector，GFP‑APS，GFP‑APS‑C22的细胞系，检测在CPT和rucaparib药物作用下，肿瘤细胞抵抗复制压力的能力。同时我们利用异种移植表达GFP‑APS，GFP‑APS‑C22的MDA‑MB‑231细胞至NOD/SCID小鼠以及异种移植表达GFP‑APS，GFP‑APS‑C22的MMTV‑PyMT原代细胞至C57BL/6J小鼠，发现表达APS的小鼠肿瘤体积和重量明显小于表达APS‑C22的小鼠，在进行顺铂或rucaparib处理后表达APS的小鼠肿瘤生长受到更明显的抑制，更直接的表明我们的APS的抗肿瘤作用是非常明显的。
[0037] 实施例1：分子生物学角度鉴定PHF8和TOPBP1相互作用模式
[0038] 1.分子生物学方法鉴定PHF8和TOPBP1相互作用位点
[0039] 构建TOPBP1的结构域缺失体(ΔBRCT0‑2，ΔBRCT3，ΔBRCT4‑5，ΔBRCT6和ΔBRCT7‑8)以及结构域截短体(BRCT0‑2，BRCT3，BRCT4‑5，BRCT6和BRCT7‑8)，将其转染至HeLa细胞，72小时后利用免疫共沉淀实验寻找相互作用的关键结构域，结果如图1A所示，TOPBP1通过其BRCT7‑8与PHF8结合。同时我们构建了PHF8的截短体(N，C，C1，C2，C3，C4)，转染HeLa细胞进行免疫共沉淀实验发现，PHF8通过其C端的APS负责与TOPBP1结合。我们进一步对PHF8缺失APS是否会影响二者结合进行免疫共沉淀实验，结果如图1B所示，发现一旦缺失APS，PHF8与TOPBP1的相互作用丧失。我们进一步体外纯化BRCT7‑8与合成的三种peptide(APS，APS‑N21，APS‑C22)通过SPR技术进行验证，结果再次证明APS负责与TOPBP1的BRCT7‑8结构域结合(图1C)。
[0040] APS:GACFKDAEYIYPSLESDDDDPA(SEQ ID NO：1)
[0041] APS‑N21:YWRTESEEEEENASLDEQDSL(SEQ ID NO：2)
[0042] APS‑C22:LKSRPKKKKNSDDAPWSPKARV(SEQ ID NO：3)
[0043] 2.APS上负责与TOPBP1结合的关键氨基酸的验证
[0044] 通过一系列分子生物学突变体的构建，我们构建APS上关键氨基酸的突变体(C844S，D847A，S854A，Y850A，Y852A)与BRCT7‑8进行免疫沉淀验证，发现这些突变体均会对二者相互作用产生影响，其中Y850和Y852作用最为明显(2A)。并且我们发现PHF8影响与TOPBP1结合的突变体并不会影响其去甲基化酶活性(2B)。
[0045] 实施例2：使用APS联合CPT和PARP抑制剂rucaparib从细胞水平杀死肿瘤细胞[0046] 1.制备GFP‑vector，GFP‑APS，GFP‑APS‑C22稳定表达细胞系
[0047] 病毒的制备采用线性化聚乙酰亚胺(PEI)转染的方法。293T细胞培养于10cm培养皿中，当细胞生长至70％时，按照质粒(μg)：PEI：OPTI‑MEM＝1:5:100的比例加入质粒和PEI混合液。质粒包括包装质粒(pMDLg/pRRE，pRSV‑REV和pVSVG)和目的质粒(GFP‑vector，GFP‑APS，GFP‑APS‑C22)。分别在48小时和72小时收集病毒上清液。提前准备要感染的细胞系如U2OS，MDA‑MB‑231，留好空白对照组，添加病毒液24小时后换成正常培养基利用嘌呤霉素进行筛选。
[0048] 2.APS抑制肿瘤细胞ATR信号通路的激活
[0049] CPT使用浓度为1μM。
[0050] 在6孔板培养稳定表达GFP‑vector，GFP‑APS，GFP‑APS‑C22的U2OS细胞，48小时后分别给予细胞DMSO和CPT处理，1小时后胰酶消化，收取细胞，PBS洗两次后95度煮30分钟后跑western blot，检测ATR底物激活情况。结果如图3A显示，表达APS的细胞，ATR下游底物RPA2 pS33和p‑CHK1 S345水平与表达GFP‑vector和GFP‑APS‑C22组相比明显降低，说明GFP‑APS抑制了ATR通路的活化。同时对稳转GFP‑vector，GFP‑APS，GFP‑APS‑C22的U2OS细胞进行2mM HU处理4小时，冰的PBS洗两遍后用4％多聚甲醛固定，0.2％TrionX‑100打孔，1％BSA封闭1小时孵育一抗和荧光二抗后共聚焦显微镜分析。结果如图3B显示，APS的细胞RPA2 pS33形成foci的能力明显减弱。
[0051] 3.APS促进CPT处理下对U2OS细胞的杀伤作用
[0052] 在96孔板培养稳定表达GFP‑vector，GFP‑APS，GFP‑APS‑C22的U2OS细胞，1500个细胞/孔，24小时后，用0，25nM，50nM，100nM，150nM，200nM CPT处理细胞，再培养72小时，然后向每个孔中添加Cell Titer Aqueous One Solution Reagent(G3582，Promega)，并在37度培养箱继续培养1小时，通过使用550BioRad plate‑reader(Bio‑Rad,Hertfordshire,UK)测量490nm处的吸光度来测定细胞活度并绘制成生存曲线，结果如图4所示，实验组GFP‑APS比对照组GFP‑vector细胞的存活率明显下降，而实验组GFP‑APS‑C22与对照组无明显差异。
[0053] 4.APS增强CPT，rucaparib对MDA‑MB‑231细胞的杀伤作用
[0054] 实验方法同上，其中rucaparib使用浓度为0μM，2μM，4μM，8μM，16μM，32μM。结果如图5所示，表达APS的细胞在CPT(5A)和rucaparib(5B)的药物作用下存活率比GFP‑vector和GFP‑APS‑C22组明显降低。
[0055] 实施例3：利用乳腺癌小鼠模型，使用APS联合顺铂或rucaparib抑制肿瘤生长[0056] 1.PyMT乳腺肿瘤原代培养
[0057] 将肿瘤大小为15mm×15mm的PyMT小鼠处死，取出其乳腺肿瘤，以无菌方式分离和处理。首先用冰的PBS充分洗涤肿瘤，去除可见的组织块。肿瘤组织在DMEM中用解剖剪刀切3
碎，使其均匀化为大约1mm的小块，然后将组织重新悬浮并在37℃下的消化缓冲液(160μg/ml胶原酶和25μg/ml透明质酸酶)中消化1小时，用孔径40μm的细胞过滤器过滤，之后种植到含非必需氨基酸的DMEM培养基中。
碎，使其均匀化为大约1mm的小块，然后将组织重新悬浮并在37℃下的消化缓冲液(160μg/ml胶原酶和25μg/ml透明质酸酶)中消化1小时，用孔径40μm的细胞过滤器过滤，之后种植到含非必需氨基酸的DMEM培养基中。
[0058] 2.稳定表达GFP‑APS和GFP‑APS‑C22的PyMT乳腺肿瘤细胞的构建
[0059] 病毒的制备采用线性化聚乙酰亚胺(PEI)转染的方法。293T细胞培养于10cm培养皿中，当细胞生长至70％时，按照质粒(μg)：PEI：OPTI‑MEM＝1:5:100的比例加入质粒和PEI混合液。质粒包括包装质粒(pMDLg/pRRE，pRSV‑REV和pVSVG)和目的质粒(GFP‑APS，GFP‑APS‑C22)。在48小时后收集病毒上清液。准备3个10cm培养皿的PyMT乳腺肿瘤细胞，其中GFP‑APS，GFP‑APS‑C22添加5mL病毒和5mL培养基，混匀，而空白对照组只是添加10mL正常培养基，之后polyB按照1:1000的比例添加到3个10cm培养皿中，24小时后3个10cm培养皿细胞全部换成正常培养基并利用嘌呤霉素进行筛选。
[0060] 3.APS异种移植抑制乳腺癌的生长
[0061] 利用构建的稳定表达GFP‑APS，GFP‑APS‑C22的MDA‑MB‑231细胞(1.5×106)用200μl PBS重悬，原位移植到6周龄免疫功能低下(SCID)雌性小鼠的乳腺脂肪垫上。肿瘤体积达3
到40mm 后，每组半数小鼠每两天用rucaparib(20mg/kg，2％v/v二甲基亚砜，10％v/v HPBCD，2‑羟基丙基‑β‑环糊精，PBS)和相应的安慰剂腹腔注射。每组使用5到6只动物进行实
2
验。每两天用游标卡尺测量肿瘤体积，计算公式为0.5×长×宽。我们在图6A和6B中发现移植APS的小鼠肿瘤体积和重量均明显小于移植APS‑C22的小鼠，并且在rucaparib的药物处理下，移植APS的小鼠肿瘤生长更加缓慢。
到40mm 后，每组半数小鼠每两天用rucaparib(20mg/kg，2％v/v二甲基亚砜，10％v/v HPBCD，2‑羟基丙基‑β‑环糊精，PBS)和相应的安慰剂腹腔注射。每组使用5到6只动物进行实
2
验。每两天用游标卡尺测量肿瘤体积，计算公式为0.5×长×宽。我们在图6A和6B中发现移植APS的小鼠肿瘤体积和重量均明显小于移植APS‑C22的小鼠，并且在rucaparib的药物处理下，移植APS的小鼠肿瘤生长更加缓慢。
[0062] 4.APS抑制MMTV‑PyMT原代细胞的生长
[0063] 利用构建的稳定表达GFP‑APS，GFP‑APS‑C22的MMTV‑PyMT原代细胞(1.5×105)用20μl PBS重悬，原位移植到C57BL/6J雌性小鼠的乳腺脂肪垫上。小鼠移植后1周给予顺铂cisplatin(1mg/kg，5％v/v DMF，40％v/v PEG300，2％v/v TWEEN80 in H2O)或安慰剂腹腔注射处理。每周监测原发肿瘤生长情况，在最大肿瘤直径达到2cm前收集肿瘤。我们通过图7发现移植APS的C57BL/6J小鼠肿瘤生长明显慢于移植APS‑C22的小鼠，并且在顺铂的药物处理下，移植APS的C57BL/6J小鼠肿瘤生长更加缓慢。