酯酶突变体及其应用转让专利
申请号 : CN202110107053.3
文献号 : CN112430585B
文献日 : 2021-04-27
发明人 : 洪浩 , 詹姆斯·盖吉 , 肖毅 , 张娜 , 焦学成 , 杨益明 , 王翔 , 赵军旗
申请人 : 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种酯酶突变体,其特征在于,所述酯酶突变体具有SEQ ID NO: 1所示序列发生氨基酸突变的序列,所述发生氨基酸突变的位点为N51G位点或如下任一种组合突变位点:N51G+W115P、N51G+T117L、N51G+T117M、N51G+T117F、N51G+T117W、N51G+T117A、N51G+T117I、N51G+A142V、N51G+V167M、N51G+W196I、N51G+W196L、N51G+W196V、N51G+D217M、N51G+L231T、N51G+L231I、N51G+V267E、N51G+V267C、N51G+S295T、N51G+S295A、N51G+S295Y、N51G+S295F、N51G+T117M+S140G、N51G+T117M+S140N、N51G+T117M+S140C、N51G+T117M+S140T、N51G+T117M+S140A、N51G+T117M+A142V、N51G+T117M+A142P、N51G+T117M+A142S、N51G+T117M+A142L、N51G+T117M+D217Q、N51G+T117M+D217A、N51G+T117M+D217S、N51G+T117M+D217G、N51G+T117M+L231I、N51G+T117M+S140C+M52F、N51G+T117M+S140C+M52L、N51G+T117M+S140C+M52N、N51G+T117M+S140C+M52Y、N51G+T117M+S140C+M52G、N51G+T117M+S140C+M52W、N51G+T117M+S140C+I195F、N51G+T117M+S140C+I195L、N51G+T117M+S140C+I195T、N51G+T117M+S140C+I195V、N51G+T117M+S140C+D217S、N51G+T117M+S140C+L231I、N51G+T117M+S140C+V267I、N51G+T117M+S140C+I268V、N51G+T117M+S140C+S295F、N51G+T117M+S140C+S295M、N51G+T117M+S140C+S295N、N51G+T117M+S140C+S295G、N51G+T117M+S140C+S295D。
2.一种DNA分子,其特征在于,所述DNA分子编码权利要求1所述的酯酶突变体。
3.一种重组质粒,其特征在于,所述重组质粒连接有权利要求2所述的DNA分子。
4.根据权利要求3所述的重组质粒,其特征在于,所述重组质粒为pET‑22a(+)、pET‑22b(+)、pET‑3a(+)、pET‑3d(+)、pET‑11a(+)、pET‑12a(+)、pET‑14b、pET‑15b(+)、pET‑16b(+)、pET‑17b(+)、pET‑19b(+)、pET‑20b(+)、pET‑21a(+)、pET‑23a(+)、pET‑23b(+)、pET‑24a(+)、pET‑25b(+)、pET‑26b(+)、pET‑27b(+)、pET‑28a(+)、pET‑29a(+)、pET‑30a(+)、pET‑31b(+)、pET‑32a(+)、pET‑35b(+)、pET‑38b(+)、pET‑39b(+)、pET‑40b(+)、pET‑41a(+)、pET‑41b(+)、pET‑42a(+)、pET‑43a(+)、pET‑43b(+)、pET‑44a(+)、pET‑49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET‑A、pRSET‑B、pRSET‑C、pGEX‑5X‑1、pGEX‑6p‑1、pGEX‑6p‑
2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232‑8、pUC‑18或pUC‑19。
5.一种宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞含有权利要求3或4所述的重组质粒,所述宿主细胞为非植物细胞。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞,其特征在于,所述原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞,所述真核细胞为酵母。
8.一种生产手性酸的方法,包括采用酯酶对酯类化合物进行催化反应的步骤,其特征在于,所述酯酶为权利要求1所述的酯酶突变体。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述酯类化合物为 ,反应产物为 ,其中,R1代表‑CH3、‑CH2CH3、‑CH2CH2CH3或‑CHCH3CH3; R2、R3、R4、R5 各自独立地代表‑H、‑F、‑Cl、‑Br、‑CH3 或‑CH2CH3。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述酯类化合物为 、、 、 或 。
11.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述酯酶突变体催化反应的pH为8.5~
9.0,反应温度为30 35℃。
~
说明书 :
酯酶突变体及其应用
技术领域
背景技术
的立体异构体则没有治疗作用或甚至有副作用。其次,医药制品等小生产批量、高附加值的
产品具有结构的复杂性和多样性,如果生产的工艺过程具有化学和区域选择性,则可以免
除不必要的保护和去保护步骤(在传统的有机合成中通常引入保护和去保护步骤来弥补反
应的化学和区域选择性的不足),大大优化生产工艺过程,从而降低生产成本。因此,新型的
有机合成技术必须具备以下的一些特点:高化学选择性、区域选择性和立体选择性;反应条
件温和;反应介质及后处理对环境产生的污染少等。生物催化技术正好具有这些特点,生物
催化反应条件温和,通常在中性和室温,或接近这样的条件下进行;多数情况下生物催化反
应在水相中进行,因而环境污染少;生物催化反应通常具有高化学选择性、区域选择性和立
体选择性等特点。因此,生物催化技术在有机合成方面的应用具有非常重大的科学意义和
实际应用价值。
族,根据作用底物的种类进行分类:羧酸酯,硫酯,磷酸单酯,磷酸二酯,硫酸磷脂,硫酸酯。
不同来源的酯酶具有不同的催化特点和催化活力。
手性乳酸甲酯;在专利(CN 104988165 B)中,从深海污泥中提取酯酶基因est4,并构建含该
酯酶基因est4的基因工程菌株,实现该基因est4的异源表达,并成功用于催化合成多种短
链萜烯酯和动力学拆分多种芳香仲醇等反应中。
中应用时,多数情况下是非天然底物,一般而言,可以通过定向进化的手段对野生酶进行改
造,以提高其对非天然底物的反应活性、稳定性和选择性(包括化学选择性、区域选择性和
立体选择性),从而可以应用在生产中。
发明内容
点。
V、W196I/L/V、D217M/Q/A/S/G、L231T/I、V267E/C/I/V以及S295T/A/Y/F/M/N,其中“/”表示
“或”。
N51G+T117M+A142V、N51G+T117M+A142P、N51G+T117M+A142S、N51G+T117M+A142L、N51G+
T117M+D217Q、N51G+T117M+D217A、N51G+T117M+D217S、N51G+T117M+D217G、N51G+T117M+
L231I、N51G+T117M+S140C+M52F、N51G+T117M+S140C+M52L、N51G+T117M+S140C+M52N、N51G+
T117M+S140C+M52Y、N51G+T117M+S140C+M52G、N51G+T117M+S140C+M52W、N51G+T117M+S140C
+I195F、N51G+T117M+S140C+I195L、N51G+T117M+S140C+I195T、N51G+T117M+S140C+I195V、
N51G+T117M+S140C+D217S、N51G+T117M+S140C+L231I、N51G+T117M+S140C+V267I、N51G+
T117M+S140C+I268V、N51G+T117M+S140C+S295F、N51G+T117M+S140C+S295M、N51G+T117M+
S140C+S295N、N51G+T117M+S140C+S295G、N51G+T117M+S140C+S295D。
(+)、pET‑21a(+)、pET‑23a(+)、pET‑23b(+)、pET‑24a(+)、pET‑25b(+)、pET‑26b(+)、pET‑27b
(+)、pET‑28a(+)、pET‑29a(+)、pET‑30a(+)、pET‑31b(+)、pET‑32a(+)、pET‑35b(+)、pET‑38b
(+)、pET‑39b(+)、pET‑40b(+)、pET‑41a(+)、pET‑41b(+)、pET‑42a(+)、pET‑43a(+)、pET‑43b
(+)、pET‑44a(+)、pET‑49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、
pRSET‑A、pRSET‑B、pRSET‑C、pGEX‑5X‑1、pGEX‑6p‑1、pGEX‑6p‑2、pBV220、pBV221、pBV222、
pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232‑8、pUC‑18或pUC‑19。
CH3 或‑CH2CH3;优选的,酯类化合物为 、 、
、 或 。
法,得到具有上述突变位点的酯酶,因此这些酯酶突变体具有酶特异性大幅度提高的优势,
并且酶活性也有相应提高,从而大幅度降低了酶的使用量,降低了工业生产中的成本。
具体实施方式
VHKVSLPNGEVMGYRKRDGGEKTILLVHGNMTSSKHWDLFFETFPASYTLVAIDMRGFGESSYNKRVEGIEDFAQD
LKFFVDQLGLNDFTMIGWSTGGAVCMQFEAQYPGYCDKIVLISSASTRGYPFFGTHSDGTPDLNQRLKTVDDIEKD
PMRTIPIQQAYDTGNRALLKTIWNSLIYTHNQPEEKRYEAYVDDMMTQRNLADVYHALNTFNISSVTNGLTEGTNQ
ANLIRIPVLVLRGERDLVISKEMTEEIVEDLGTNSTYKELSASGHSPFIDDCDQLTNIITDFLEK),对应的核苷
酸序列为SEQ ID NO:2(ATGGGCAGCAATAACGACAACATGGGTAAACGTGGCGGCAACCTGA TGATCACCA
TCCCGACAGTGCATAAAGTGAGCCTGCCGAATGGCGAAGTGATGGGTTATCGTAAGCGCGACGGCGGTGAAAAAAC
CATCCTGCTGGTGCACGGCAACATGACCAGCAGCAAACATTGGGACCTGTTCTTCGAGACCTTTCCGGCAAGCTAT
ACACTGGTGGCCATCGATATGCGCGGCTTCGGCGAAAGCAGCTATAACAAACGCGTGGAAGGCATCGAGGACTTTG
CCCAGGACCTGAAATTCTTCGTGGATCAGCTGGGCCTGAACGATTTCACCATGATCGGTTGGAGCACAGGCGGCGC
CGTGTGTATGCAGTTTGAAGCCCAGTATCCGGGCTACTGCGACAAGATTGTGCTGATTAGCAGCGCAAGCACCCGT
GGCTATCCGTTTTTTGGTACCCACAGCGATGGCACCCCGGATCTGAATCAGCGCCTGAAGACCGTGGACGACATCG
AAAAAGATCCTATGCGCACCATTCCGATCCAGCAGGCCTACGATACCGGTAACCGCGCCCTGCTGAAAACCATCTG
GAATAGCCTGATTTACACCCACAACCAGCCGGAGGAAAAGCGCTATGAGGCCTATGTGGACGACATGATGACCCAG
CGTAATCTGGCCGATGTGTATCACGCCCTGAACACATTCAACATTAGCAGCGTGACCAACGGCCTGACCGAGGGCA
CCAATCAGGCCAACCTGATCCGCATCCCTGTGCTGGTTCTGCGCGGCGAACGCGACCTGGTGATCAGCAAAGAGAT
GACCGAGGAGATCGTGGAGGATCTGGGCACCAACAGCACCTATAAAGAGCTGAGCGCCAGCGGCCACAGCCCTTTT
ATCGATGATTGCGACCAGCTGACCAACATCATCACCGATTTTCTGGAGAAATAA)。
N51G为模板继续进行突变,以期得到催化活性提高的突变体。
除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征,是基因研
究工作中一种非常有用的手段。
的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物,一圈后回到引物 5’ 端终止,再经过反复加热
退火延伸的循环,这个反应区别于滚环扩增,不会形成多个串联拷贝。正反向引物的延伸产
物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。Dpn I酶切延伸产物,由于原来的模版质粒来源于常
规大肠杆菌,是经dam甲基化修饰的,对 Dpn I敏感而被切碎,而体外合成的带突变序列的
质粒由于没有甲基化而不被切开,因此在随后的转化中得以成功转化,即可得到突变质粒
的克隆。将突变质粒转化至大肠杆菌细胞内,然后通过超声破碎细胞的方法获得粗酶。
声破碎细胞的方法获得粗酶。酯酶诱导表达最佳条件:25 C,0.1 mM IPTG 诱导16 h。
W196I/L/V、D217M/Q/A/S/G、L231T/I、V267E/C/I/V以及S295T/A/Y/F/M/N,其中“/”表示
“或”。
N51G+T117M+A142V、N51G+T117M+A142P、N51G+T117M+A142S、N51G+T117M+A142L、N51G+
T117M+D217Q、N51G+T117M+D217A、N51G+T117M+D217S、N51G+T117M+D217G、N51G+T117M+
L231I、N51G+T117M+S140C+M52F、N51G+T117M+S140C+M52L、N51G+T117M+S140C+M52N、N51G+
T117M+S140C+M52Y、N51G+T117M+S140C+M52G、N51G+T117M+S140C+M52W、N51G+T117M+S140C
+I195F、N51G+T117M+S140C+I195L、N51G+T117M+S140C+I195T、N51G+T117M+S140C+I195V、
N51G+T117M+S140C+D217S、N51G+T117M+S140C+L231I、N51G+T117M+S140C+V267I、N51G+
T117M+S140C+I268V、N51G+T117M+S140C+S295F、N51G+T117M+S140C+S295M、N51G+T117M+
S140C+S295N、N51G+T117M+S140C+S295G、N51G+T117M+S140C+S295D。
法,得到具有上述突变位点的酯酶,因此这些酯酶突变体具有酶特异性大幅度提高的优势,
并且酶活性也有相应提高,从而大幅度降低了酶的使用量,降低了工业生产中的成本。
般而言,包括与目标核苷酸有效连接的启动子,其任选的是与终止信号和/或其他调控元件
有效连接的。表达盒还可以包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码目标蛋
白,但在正义或反义方向也编码目标功能RNA,例如反义RNA或非翻译的RNA。包含目标多核
苷酸序列的表达盒可以是嵌合的,意指至少一个其组分与其至少一个其他组分是异源的。
表达盒还可以是天然存在的,但以用于异源表达的有效重组形成获得的。
确地、顺利地复制、转录或表达。
操作的要求,需要在DNA序列的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点,或者额外增加启
动密码子、终止密码子等,因此,如果用封闭式的表述来限定将不能真实地覆盖这些情形。
核表达质粒,但优选原核表达质粒,在某些实施方案中,重组质粒选自pET‑22a(+)、pET‑22b
(+)、pET‑3a(+)、pET‑3d(+)、pET‑11a(+)、pET‑12a(+)、pET‑14b、pET‑15b(+)、pET‑16b(+)、
pET‑17b(+)、pET‑19b(+)、pET‑20b(+)、pET‑21a(+)、pET‑23a(+)、pET‑23b(+)、pET‑24a(+)、
pET‑25b(+)、pET‑26b(+)、pET‑27b(+)、pET‑28a(+)、pET‑29a(+)、pET‑30a(+)、pET‑31b(+)、
pET‑32a(+)、pET‑35b(+)、pET‑38b(+)、pET‑39b(+)、pET‑40b(+)、pET‑41a(+)、pET‑41b(+)、
pET‑42a(+)、pET‑43a(+)、pET‑43b(+)、pET‑44a(+)、pET‑49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、
pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET‑A、pRSET‑B、pRSET‑C、pGEX‑5X‑1、pGEX‑6p‑1、pGEX‑6p‑
2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232‑8、pUC‑18或pUC‑19。更优选,
上述重组质粒是pET‑22b(+)。
为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞,真核细胞为酵母。
述酯酶具有更好的特异性,甚至更高的酶催化活性,因而利用本发明的酯酶突变体制备手
性酸不仅能够降低生产成本,而且所获得的氨基酸ee值更高。
独立地代表‑H、‑F、‑Cl、‑Br、‑CH3 和‑CH2CH3中的至少一个基团所取代;
~
酸乙酯,充分震荡后,12000 rpm离心3 min,取上清液加入适量的无水硫酸镁,12000 rpm离
心3 min,取上清液体进行气相检测,检测转化率和e.e.值,底物2和底物3如底物1所述,建
立同样体系的反应及处理方式。结果见表1。
~
酸乙酯,充分震荡后,12000 rpm离心3 min,取上清液加入适量的无水硫酸镁,12000 rpm离
心3 min,取上清液体进行气相检测,检测转化率和e.e.值,底物5如底物4所述,建立同样体
系的反应及处理方式。结果见表2。
Tris‑HCl pH 8.5 缓冲液。30C反应16 h后,在1 mL反应体系中加入50 μL 6 M HCl,pH在
2 3之间,混匀后加入2 mL的乙酸乙酯,充分震荡后,12000 rpm离心3 min,取上清液加入适
~
量的无水硫酸镁,12000 rpm离心3 min,取上清液体进行气相检测,检测转化率和e.e.值,
底物2和底物3如底物1所述,建立同样体系的反应及处理方式。结果见表3。
Tris‑HCl pH 8.5 缓冲液。30C反应16 h后,在1 mL反应体系中加入50 μL 6 M HCl,pH在
2 3之间,混匀后加入2 mL的乙酸乙酯,充分震荡后,12000 rpm离心3 min,取上清液加入适
~
量的无水硫酸镁,12000 rpm离心3 min,取上清液体进行气相检测,检测转化率和e.e.值,
底物5如底物4所述,建立同样体系的反应及处理方式。结果见表4。
Tris‑HCl pH 8.5 缓冲液。30C反应16 h后,在1 mL反应体系中加入50 μL 6 M HCl,pH在
2 3之间,混匀后加入2 mL的乙酸乙酯,充分震荡后,12000 rpm离心3 min,取上清液加入适
~
量的无水硫酸镁,12000 rpm离心3 min,取上清液体进行气相检测,检测转化率和e.e.值,
底物2和底物3如底物1所述,建立同样体系的反应及处理方式。结果见表5。
Tris‑HCl pH 8.5 缓冲液。30C反应16 h后,在1 mL反应体系中加入50 μL 6 M HCl,pH在
2 3之间,混匀后加入2 mL的乙酸乙酯,充分震荡后,12000 rpm离心3 min,取上清液加入适
~
量的无水硫酸镁,12000 rpm离心3 min,取上清液体进行气相检测,检测转化率和e.e.值,
底物5如底物4所述,建立同样体系的反应及处理方式。结果见表6。
度助溶剂DMSO (0% 20%),DMF (0% 20%), 不同浓度的缓冲液(0.1 M 1 M Tris‑HCl pH
~ ~ ~
8.5), 不同pH 的缓冲液 (0.3 M KPB pH 7 8, 0.3 M Tris‑HCl pH 8 9), 反应温度
~ ~
o o
(20C 50C)。反应16 h后,在1 mL反应体系中加入50 μL 6 M HCl,pH在 2 3之间,混匀后加
~ ~
入2 mL的乙酸乙酯,充分震荡后,12000 rpm离心3 min,取上清液加入适量的无水硫酸镁,
12000 rpm离心3 min,取上清液体进行气相检测,检测转化率和e.e.值。结果见表7‑10。
o
冲液。在30C下反应,跟踪反应时间取样检测,并调节pH在9.0左右,在反应50 h时,转化率
为48%,e.e.值 为98%。对反应样品进行后处理,加入6 M HCl,调节pH在 2 3之间,混匀后加
~
入200 mL的乙酸乙酯,进行萃取,充分震荡后,分离有机层,并加入适量的无水硫酸钠,进一
步进行过滤,以及对有机层进行旋蒸处理,最后拿到4.4 g的样品,纯度为98%,e.e.值 为
98%,进一步核磁检测,收率为45%。
o
冲液。在30C下反应,跟踪反应时间取样检测,并调节pH在9.0左右,在反应60 h时,转化率
为48%,e.e.值 为98%。对反应样品进行后处理,加入6 M HCl,调节pH在 2 3之间,混匀后加
~
入300 mL的乙酸乙酯,进行萃取,充分震荡后,分离有机层,并加入适量的无水硫酸钠,进一
步进行过滤,以及对有机层进行旋蒸处理,最后拿到4.3 g的样品,纯度为98%,e.e.值 为
98%,进一步核磁检测,收率为44%。
改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。