一种兼具分子靶向/声动力治疗的携氧载药自组装纳米药物及其制备方法

摘要

本发明公开了一种兼具分子靶向/声动力治疗的携氧载药自组装纳米药物及其制备方法。该纳米药物是以厄洛替尼修饰的壳聚糖（CE）为载体，再装载血卟啉和全氟辛溴，通过自组装制备CE/PFOB/HP自组装纳米粒子（CEPH）。HP，作为一种声敏剂，可发挥其声动力治疗（SDT）效果；PFOB携氧，改善肿瘤相对低氧的微环境，同时能够增强SDT效果，克服低氧条件下肿瘤细胞对化疗药物Er的耐药性。该纳米药物，联合分子靶向治疗与声动力治疗，利用PFOB逆转耐药，三者协同可最大程度抑制肿瘤细胞增殖。

权利要求

1.一种兼具分子靶向/声动力治疗的纳米药物，其特征在于：所述的纳米药物是由壳聚糖Cs、厄洛替尼Er、血卟啉HP和全氟辛溴PFOB反应得到的以厄洛替尼修饰的壳聚糖/全氟辛溴/血卟啉纳米药物，其中，血卟啉HP载药量为30‑500 μg/mg，厄洛替尼Er嫁接量为40‑1000 μg/mg；

利用厄洛替尼修饰的壳聚糖为载体，再装载血卟啉和全氟辛溴，从而构建所述纳米药物；包括以下步骤：

（1）将血卟啉和全氟辛溴分别溶于DMSO和氯仿中，取厄洛替尼修饰的壳聚糖分散于DMSO中，上述血卟啉溶液和全氟辛溴溶液依次滴加到厄洛替尼修饰的壳聚糖溶液中，在避光条件下磁力搅拌24 h；

（2）准备装有20 mL双蒸水的小烧杯，磁力搅拌下，将上述溶液缓慢滴加到双蒸水中，室温避光条件下磁力搅拌24 h，反应液于去离子水中透析，冻干，即得包载全氟辛溴和血卟啉的厄洛替尼修饰的壳聚糖纳米粒，即为所述纳米药物；

所述纳米药物的粒径为50‑400 nm；步骤（1）中厄洛替尼修饰的壳聚糖溶液浓度为2 50 ~

mg/mL，血卟啉溶液浓度为0.8 20mg/mL，全氟辛溴溶液体积分数为10 95%；厄洛替尼修饰的~ ~

壳聚糖溶液:血卟啉溶液:全氟辛溴溶液体积比为1 10:1 10:0.5 3；

~ ~ ~

步骤（2）中的透析袋截留分子量为8000‑14000 Da；

所述纳米药物的携氧能力为80‑2000 μg/mL。

2.一种如权利要求1所述的纳米药物在用于制备抗肿瘤的分子靶向/声动力治疗药物中的应用。

说明书

一种兼具分子靶向/声动力治疗的携氧载药自组装纳米药物

及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种兼具分子靶向/声动力治疗的携氧载药自组装纳米药物及其制备方法。

背景技术

[0002] 肺癌的发病率逐年增高，已成为致死率最高的肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌总数的80‑85%。采用传统的治疗手段如手术治疗、放射治疗和化学治疗，其
预后很差，五年生存期很低。以酪氨酸激酶抑制剂如厄洛替尼为代表的分子靶向药物，因在
肺癌治疗过程中效果显著，副作用小，生存期显著延长等优势被广泛应用于临床。但部分肺
癌患者在使用分子靶向药物治疗过程中出现耐药，包括内源性机制导致的耐药和肿瘤低氧
微环境等外源性机制导致的耐药。

[0003] 声动力治疗（SDT）是在光动力治疗（PDT）基础上发展起来的一种新型非侵入性治疗方法，已经应用于各种癌症的治疗过程。该治疗手段是通过超声，癌细胞内的光敏剂分子
（PSs）被激发产生高毒性的活性氧自由基（ROS），从而杀死快速分裂的肿瘤细胞。同PDT采用
的光照相比，SDT所采用的超声属于一种机械波，具有更强的组织渗透能力，当声敏剂聚集
于肿瘤部位时可以被超声特异激活从而实现精确治疗，减少对周围正常组织的损伤；此外，
超声装置经济、便携、操作简单、便于实现，因而具备非常广泛的应用前景。血卟啉（HP）作为
第一代光敏剂，生物相容性优良，研究发现其在PDT和SDT中均能发挥对肿瘤的治疗效果，然
而，其较差的水溶性、组成比例不稳定、体内代谢缓慢、光稳定性较差等原因限制了血卟啉
的临床应用。为增强HP靶向识别并且提高HP的光稳定性，使用厄洛替尼（Er）修饰的壳聚糖
（CE）作为载体靶向递送声敏剂至Er敏感肿瘤细胞以提高SDT靶向性。

[0004] 肿瘤微环境呈低氧状态，因SDT是耗氧过程，所以这种低氧环境限制SDT疗效，同时也和药物的耐药有关。全氟辛溴（PFOB）属液态氟碳类物质，其密度大于水，呈长链结构，具
备携氧能力，在体内循环后经呼吸排出体外而不参与生物降解，具有良好的生物相容性。以
CE为载体递送PFOB，改善肿瘤微环境，增强SDT，同时可克服低氧条件下肿瘤细胞对化疗药
物Er耐药。

[0005] 壳聚糖（Cs），因其毒性低、价格低廉、生物安全性高、抑菌性等优势被广泛用作小分子抗癌药物、蛋白多肽类、基因药物等多种药物的递送系统。为增强其靶向递送的能力，
采用Er修饰的Cs作为载体，该载体对pH敏感，在酸性条件可加速Er解离，促进Er释放。

[0006] 基于上述研究背景，本申请通过合成Er修饰的Cs，并包载声敏剂HP和携氧体PFOB，旨在合成分子靶向、SDT及改善肿瘤缺氧微环境的三重效应的包载PFOB和HP的Er修饰的Cs
纳米粒（CEPH），改善肿瘤微环境，克服低氧条件下肿瘤细胞对化疗药物Er的耐药性，利用
SDT和分子靶向治疗的协同作用效果，最大程度地抑制肿瘤细胞的增殖。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种兼具分子靶向/声动力治疗的携氧载药自组装纳米药物及其制备方法和用途，利用PFOB携氧改善低氧导致的耐药，同时增强HP的SDT效果。

[0008] 为达到上述目的，本发明采取了如下技术方案：

[0009] 所述的纳米药物是由壳聚糖Cs、厄洛替尼Er、血卟啉HP和全氟辛溴PFOB反应得到的以厄洛替尼修饰的壳聚糖/全氟辛溴/血卟啉（CE/HP/PFOB）纳米药物，其中，血卟啉HP载
药量为 30‑500 μg/mg，厄洛替尼Er嫁接量为40‑1000 μg/mg。

[0010] 本发明提出一种CE/HP/PFOB纳米药物（CEPH），它是将HP和PFOB包载于经过Er修饰的Cs中得到的纳米药物CEPH。

[0011] 一种制备如上所述的CE/HP/PFOB纳米药物的方法为：先用Er将Cs经过点击化学进行修饰，形成CE载体，包载声敏剂HP和携氧体PFOB。

[0012] 具体包括以下步骤：

[0013] 步骤a：将CE分散于二甲亚砜（DMSO）中，HP和PFOB分别溶于DMSO和氯仿中。将HP溶液和PFOB溶液依次滴加至CE溶液中，在避光条件下磁力搅拌24 h。

[0014] 步骤b：准备装有20 mL双蒸水的小烧杯，磁力搅拌下，将上述溶液缓慢滴加到双蒸水中，室温避光条件下磁力搅拌24 h，反应液于去离子水中透析处理24 h，每6 h换水一次。
利用冷冻干燥机将透析液干燥，即得包载PFOB和HP的Er修饰的Cs纳米粒，即为纳米药物
CEPH。

[0015] 步骤a中所采用的CE，其Er载药量为40‑1000 μg/mg。

[0016] 步骤a中CE溶液浓度为2 50 mg/mL，HP溶液浓度为0.8 20 mg/mL ，PFOB溶液体积~ ~
分数为10 95%。
~

[0017] 步骤a中CE溶液：HP溶液：PFOB溶液体积比为1～10：1～10：0.5～3。

[0018] 所述步骤b中的透析袋截留分子量为8000‑14000 Da。

[0019] 本发明的纳米药物CEPH用于肿瘤细胞的声动力治疗。

[0020] 所述的纳米药物在用于制备抗肿瘤的分子靶向/声动力治疗药物中的应用。

[0021] 所述的纳米药物在制备用于逆转低氧微环境导致分子靶向药物中的应用。

[0022] 所述的纳米药物在制备用于通过携氧促进声动力治疗药物中的应用。

[0023] 本发明改善了肿瘤细胞低氧微环境导致的耐药，同时增强HP的声动力治疗效果。

[0024] 本发明用MTT法测试了所述纳米制剂CEPH的细胞毒性，以及治疗效果。

[0025] 本发明的作用原理是：

[0026] 第一，通过点击化学用Er修饰Cs，增强Cs的靶向性，具备主动靶向NSCLC的能力，在肿瘤酸性环境以及溶酶体的作用下，纳米粒中的各种成分得以释放，从而发挥纳米粒的抗
癌作用；

[0027] 第二，肿瘤微环境呈现低氧状态导致药物耐药，PFOB作携氧体，改善肿瘤低氧微环境，克服分子靶向药物出现的耐药；

[0028] 第三，SDT过程耗氧，将氧气转化为高毒性的ROS从而杀死肿瘤细胞，但肿瘤中氧气浓度相对较低，HP的SDT效果受限制，当用Er修饰的Cs作为载体靶向递送PFOB至肿瘤细胞
时，肿瘤低氧状态得到改善，其SDT得到增强，大大提高治疗效果。

[0029] 本发明的有益效果是：

[0030] 第一，本发明以CE作为药物载体，能通过控制纳米粒的粒径，很好的装载药物，超声响应，加快释放血卟啉；

[0031] 第二，本发明所得到的纳米药物可通过超声发挥声动力治疗效果；

[0032] 第三，在CE/HP/PFOB纳米药物中，PFOB作为携氧体，增强声动力治疗效果。

[0033] 第四，在CE/HP/PFOB纳米药物中，PFOB使得纳米药物具备携氧能力，改善肿瘤缺氧微环境，进而逆转厄洛替尼耐药，提高抗肿瘤效果。

附图说明

[0034] 图1为制备的CEPH的HP的紫外图谱。

[0035] 图2为制备的CEPH含氧量及其含氧稳定性示意图，其中，A为KMnO4在525 nm的紫外吸收与浓度的线性曲线，B为纳米粒CEP 和CEPH 含氧稳定性。

[0036] 图3为CEPH在超声或不超声条件下于释放介质中12 h内的释放曲线。

[0037] 图4为制备的CEPH的溶液单线态氧检测实验，其中，A为在施加强度为0.1 W/cm2时间为1 min的超声条件后各不同纳米溶液中SOSG的荧光强度对比，B为CEPH溶液在不同超声
2
强度下超声1 min后的SOSG荧光强度对比，C为CEPH溶液在超声强度为0.1 W/cm 下不同超
声时间SOSG荧光强度的对比。

[0038] 图5为制备的CEPH的Er靶向识别实验，其中A为A549细胞对纳米粒CEPH和CPH的摄取情况，B为PC‑9细胞对纳米粒CEPH和CPH的摄取情况，C为H1975细胞对纳米粒CEPH和CPH的
摄取情况。

[0039] 图6为常氧条件下所制备的不同纳米药物及超声对PC‑9细胞的体外毒性实验。

[0040] 图7为PC‑9细胞在常氧条件下对CEPH的摄取实验。

[0041] 图8为PC‑9细胞在低氧条件下对CEPH的摄取实验。

[0042] 图9为PC‑9细胞在常氧条件下对CEPH的共聚焦成像图。

具体实施方式

[0043] 下面结合具体实施例，对本发明进行进一步说明，有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

[0044] 实施例1

[0045] 取1 g Cs分散于50 mL DMF中，加入2 g 4‑溴邻苯二甲酸酐，氮气保护下125 ℃搅拌至溶液澄清，将热滤液倒入500 mL冰水中，白色固体析出，控温4‑8 ℃下以5000 r/min离
心5 min，所得固体为经溴代邻苯二甲酸酐取代的壳聚糖。称取1 g上述产物分散于50 mL 
N‑甲基吡咯烷酮中，50 ℃油浴加热至完全溶解，向其中加入1.66 g叠氮化钠，氮气保护下
继续反应24小时。反应液倒入100 mL乙醇中固体析出，以12000 r/min转速离心5 min，沉淀
物经水洗、丙酮洗后真空干燥，得叠氮取代的壳聚糖。称取1 g叠氮取代的壳聚糖分散于30 
mL DMSO中，加热搅拌20‑30 min至完全溶解，加厄洛替尼 250 mg，氮气保护下，用5 mL注射
器依次滴加200 mg五水硫酸铜（溶于3 mL双蒸水中）和200 mg抗坏血酸钠（溶于3 mL双蒸水
中）。氮气保护下50 ℃油浴避光搅拌加热3天，反应液用截留分子量为8000 14000的透析袋
~
在双蒸水中透析2天，每6个小时换一次水。产物经冷冻干燥后即得载体CE。

[0046] 实施例2

[0047] 取10 mg CE分散于1 mL DMSO中，1 mg HP溶于0.25 mL DMSO中，0.25 mL PFOB溶于0.25 mL氯仿中，将HP溶液和PFOB溶液依次滴加至CE溶液中，在避光条件下磁力搅拌24 
h，准备装有20 mL双蒸水的小烧杯，磁力搅拌下，将上述溶液缓慢滴加到双蒸水中，室温避
光条件下磁力搅拌24 h，反应液置于截留分子量为8000 14000的透析袋中用去离子水中透
~
析处理24 h，每6 h换水一次。利用冷冻干燥机将透析液干燥，即得包载PFOB和HP的Er修饰
的Cs纳米粒CEPH，于‑20 ℃储存。

[0048] 将制备的CEPH用DMSO分散至一定浓度，用紫外分光光度计测紫外吸收，从图1可知，CEPH含HP特征吸收峰，证明HP已成功被包载到CE载体上。

[0049] 实施例3

[0050] 取10 mg CE分散于1 mL DMSO中，然后将HP的DMSO溶液（1 mg HP溶于0.25 mL DMSO中）滴加至上述溶液中，在避光条件下磁力搅拌24 h，准备装有20 mL双蒸水的小烧杯，
磁力搅拌下，将上述溶液缓慢滴加到双蒸水中，室温避光条件下磁力搅拌24 h，反应液转移
至截留分子量为8000 14000的透析袋内于去离子水中透析处理24 h，每6 h换水一次。利用
~
冷冻干燥机将透析液干燥，即得包载HP的Er修饰的Cs纳米粒（CEH）。

[0051] 实施例4

[0052] 取10 mg CE分散于1 mL DMSO中，然后将PFOB的氯仿溶液（0.25 mL PFOB溶于0.25 mL氯仿中）滴加至上述溶液中，在避光条件下磁力搅拌24 h，准备装有20 mL双蒸水的小烧
杯，磁力搅拌下，将上述溶液缓慢滴加到双蒸水中，室温避光条件下磁力搅拌24 h，反应液
于去离子水中透析处理24 h，每6 h换水一次，透析袋截留分子量为8000 14000。利用冷冻
~
干燥机将透析液干燥，即得包载PFOB的Er修饰的Cs纳米粒（CEP）。

[0053] 实施例5

[0054] 取10 mg Cs分散于1 mL1%的冰醋酸中，1 mg HP溶于0.25 mL DMSO中， 0.25 mL PFOB溶于0.25 mL氯仿中，依次滴加到Cs的冰醋酸溶液中，在避光条件下磁力搅拌24 h，然
后缓慢滴加到20 mL双蒸水中，室温避光条件下振荡24 h ，反应液于去离子水中透析处理
24 h，每6 h换水一次，透析袋截留分子量为8000 14000，将透析液放‑80℃冰箱数小时，放
~
入冷冻干燥机内即得包载PFOB和HP的Cs纳米粒（CPH）。

[0055] 实施例6

[0056] 将KMnO4配成一定浓度的母液，然后将其稀释成一定的浓度梯度，用UV‑vis测量不同浓度KMnO4的紫外吸收值，绘制出KMnO4的标准曲线。

[0057] （1） Na2SO3 + O2 = Na2SO4

[0058] （2） KMnO4 + Na2SO3+ H2O= 3Na2SO4 +2 KOH + 2MnO2

[0059] 根据上述化学反应，取相同浓度相同体积的CEP和CEPH纳米粒分别与过量的Na2SO3反应，未反应的Na2SO3与KMnO4发生化学反应，根据KMnO4发生反应前后的吸光值变化以及氧
化还原反应的摩尔质量比定量测出CEP、CEPH纳米粒含氧量。根据上述氧化还原反应分别在
1、2、3、4、5、6、7天同一时间取样，测含氧稳定性。CEPH中PFOB的含氧量为0.429 ± 0.001 
mg/mL，纳米粒CEP中PFOB的含氧量为0.422 ± 0.010 mg/mL，如图2所示，一周内，纳米粒含
氧量只有少数下降，携氧能力较为稳定。

[0060] 实施例7

[0061] 称取2 mg CEPH分散在20 mL 40％乙醇‑PBS（pH = 7.4）溶液中，避光搅拌，在不同2
时间点取样，测量HP的含量。对于超声组，溶液在1 h、2 h和4 h以0.1 W/cm 的强度超声1 
min。其释放特性曲线如图3所示，8 h后HP的释放趋于稳定，12 h内 HP的累积释放量几乎达
到60％，并且经超声后，HP释放明显加快，即证明超声加速HP释放。

[0062] 实施例8

[0063] 称取1 mg 不同纳米粒分散于 1 mL DMSO中，用PBS稀释至50 μg/mL。取6孔板，加入不同供试品溶液1 mL加至孔板中，向其中加入30 μL SOSG工作液（8.25 μM），混匀后，设
置不同的超声强度和时间进行超声，用酶标仪检测荧光强度变化。结果如图4所示，CEH溶液
比CE溶液产生更多的单线态氧；随超声强度的增加和超声时间的延长，CEPH溶液中单线态
氧的含量也在增加，且CEPH比CEH产生更多的单线态氧，证明PFOB的携氧作用增强超声效
果。

[0064] 实施例9

[0065] 常氧条件下培养PC‑9、A549和H1975这三种细胞在培养瓶中生长至80%后，胰蛋白酶消化，每孔20万细胞铺12孔板，孵育24 h后，吸弃旧培养基，一半细胞预先用10 μg/mL Er
孵育半小时后，吸弃培养基，分别加含有等量HP的纳米粒CPH和CEPH（含10 μg/mL Er），孵育
4 h后，PBS洗两遍，用不含EDTA的胰酶消化细胞，1500 rpm/min的转速离心5 min弃去上清
液，PBS洗2次，500 μL PBS悬浮吹散均匀，待测流式。结果如图5，PC‑9细胞摄取的纳米粒
CEPH比纳米粒CPH多，而A549和H1975细胞只有略微的变化，另外三种细胞对纳米粒CPH的摄
取较少，这就说明了PC‑9为Er敏感型细胞，Er更易被PC‑9细胞摄取。为了进一步验证Er的靶
向作用，本申请进行了竞争性抑制实验，当细胞预先用Er作用后，A549和H1975细胞对CEPH
的摄取曲线几乎没有变化，但PC‑9细胞的摄取曲线有了明显的左移，即摄取量减少，这是由
于事先加入Er导致PC‑9细胞的未结合受体较少，摄取CEPH的量便大大减少，这些结果表明
CEPH中的Er具有靶向作用，可介导药物的靶向输送。

[0066] 实施例10

[0067] 培养肺癌细胞PC‑9，选取形态较好的细胞，待细胞在培养瓶中生长至80%，胰蛋白酶消化，配制成浓度为每毫升5‑10万细胞的细胞悬液。按每孔2 mL细胞悬液的量接种到6孔
板，置于含5% CO2，37℃培养箱中孵育24 h，使细胞贴壁均匀生长。用1640培养基将药物
CEH、CEP、CEPH稀释成Er的统一浓度为10，5，1，0.1 μg/mL，分为超声组和不超声组，超声条
2
件为0.1 W/cm +1 min，孵育24 h。吸弃培养基，并于每孔中加入1.6 mL MTT溶液，培养箱中
孵育4 h，加入DMSO溶液2 mL于各孔中，常温低速振荡摇匀10 min，用多功能酶标仪于570 
nm波长处测定各孔的吸光值（平行实验三次，求平均值），计算细胞的存活率，考察在常氧环
境下纳米粒对PC‑9肺癌细胞的增殖抑制效果。结果如图6所示，常氧环境下 Er、CE 、CEP、
CEH、CEPH均可以在不同程度上杀死细胞，CEPH经超声后，细胞毒性增强，HP发挥声动力治疗
效果，抑制肿瘤细胞的生长。

[0068] 实施例11

[0069] 在37℃，5% CO2的培养箱中培养肺癌细胞PC‑9，选取形态较好的细胞，待细胞在培养瓶中生长至80%，胰蛋白酶消化，铺12孔板，每孔20万细胞1.5 mL培养基孵育24 h，吸弃旧
培养基，小孔分别加纳米粒CEH和CEPH（含10 μg/mL Er），孵育4 h后，PBS洗两遍，用不含乙
二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化细胞，1500 rpm/min的转速离心5 min弃去上清液，PBS洗2
次，500 μLPBS悬浮吹散均匀，待测流式，考察在常氧环境下肺癌细胞的摄取。结果如图7所
示，在常氧条件下，PC‑9细胞对CEPH的摄取高于对CEH的摄取。

[0070] 实施例12

[0071] 在1% O2，5% CO2，94% N2，37℃的低氧工作站里培养肺癌细胞PC‑9，其余操作同实施例7，结果如图8所示，在低氧条件下，PC‑9细胞对CEPH的摄取明显高于CEH，该低氧环境下
对CEH的摄取要低于在常氧条件下对CEH的摄取（如图8），证明低氧环境抑制PC‑9对CEH的摄
取，PFOB可以促进低氧条件下PC‑9对CEPH的摄取，为逆转低氧导致的耐药提供前提条件。

[0072] 实施例13

[0073] 在37℃，5% CO2的培养箱中培养肺癌细胞PC‑9，选取形态较好的细胞，待细胞在培养瓶中生长至80%，胰蛋白酶消化，预先将爬片放入12孔板，取10万悬浮细胞均匀地铺于12
孔板，每孔1.5 mL培养基孵育过夜，吸弃旧培养基，小孔分别加纳米粒CEH和CEPH（含10 μg/
mL Er），孵育4 h后，PBS洗三次，加入溶酶体染料孵育30 min，PBS洗三次，4%的多聚甲醛固
定15 min，PBS洗三次，Hochest染料避光染色15 min，将爬片倒扣在载玻片上，共聚焦观察
在常氧环境下PC‑9的摄取。结果如图9所示，CEPH能够被PC‑9细胞摄取并定位于溶酶体。

[0074] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。